流式细胞术在精液检测中的应用

流式细胞术在精液检测中的应用 流式细胞术在精液检测中的应用 ? 1876?检验医学与临床2011年8月第8卷第15期IabMedClin,August2011,Vo1.8,No.15 流式细胞术在精液检测中的应用 靳韶华综述,李建远审校(山东省烟台市毓璜顶医院中心实验室264000) 【关键词】流式细胞术;精子;检测 DOI:10.3969/j.issn.1672—9455.2011.15.046文献标志码:A文章编号:1672—9455(2011)15—1876—02 流式细胞术(FCM)是2O世纪7O年代发展起来的一种单 细胞快速技术,已广泛应用于细胞生物学和医学的各个领 域.精子质量检测是诊断男性不育的重要手段,由于检测精子 数低及主观因素影响,常规的精液检查只能反映精子的形态特 征和有限的功能,不能为生育力提供准确评估的依据.将 FCM用于精液检查,可把定性的描述过渡到定量的研究,并可 进行数据统计,大大提高了实验结果的科学性,而且可对精液 进行高通量,多参数分析.因而FcM为客观地评价男性生育 能力提供了有利的条件,有着广泛的应用前景.本文对流式细 胞术在精液检测中的应用进行综述. 1精子质膜完整性的检测 精子的质膜组分对精子质量具有非常重要的作用.精子 的质膜完整性是精子存活的基本条件之一,也是检测精液质量 的重要指标之一.精子质膜维持和调节胞内成分,质膜破损会 导致精子内环境失衡,最终导致精子死亡l1].碘化丙啶(PI), 溴化乙锭(EB),赫斯特荧光染料33258(Hoechst33258)是用于 死精子质膜特异性检测的荧光染料,其中PI最常用.它们是 膜不透性的DNA探针,只有质膜破损的精子才能允许染料进 入细胞与DNA结合.检测活精子特异性的荧光染料有 SYBR一14\羧基荧光素双醋酸盐(cFDA),羟基二甲基荧光素双 醋酸盐(CDMFDA)等.它们是膜通透性的染料,能进入质膜完 整的精子[2].Hoechst33258,CFDA等染料对某些细胞的膜功 能和DNA完整性具有一定损害l3].Christensen等用 SYBR一14/PI检测哺乳动物精子,用FCM进行定量分析,发现 活精子被SYBR一14染成绿色,死精子被PI染成红色;同时染 上两种荧光的双阳性精子示正处于由活到死的过度状态. PI和SYBR一14联合使用,可以很好地检测精子活力.其原理 可能是PI进入死精子头部后端,取代了SYBR-14或使SYBR- 14的荧光淬灭. 2染色质状态的检测 精子的染色质状态是目前研究较多的一个指标.精子染 色质结构的稳定性对=F精卵的正常结合及受精卵的发育均是 十分重要的.精子发生和成熟过程中,染色体呈减数分裂,核 内染色质高度缩合,其缩合程度与精子成熟度有关_5].用 FCM结合DNA荧光染料(如PI),可以间接反映出精子染色 质缩合度,从而反映精子的成熟度,判断其生育能力.流式细 胞仪可对精子染色质结构的缩合水平进行快速,精确的分析, 但受样品的保存和放置时间等影响染色质结构完整性的变化 因素较为敏感.精子染色质结构分析测量反映了不同精子染 色质构象结构的异质性.人精子细胞在染色质缩合水平,内源 性DNA缺口和组蛋白相关区域的长度方面显示出很大的变 异性,大多数正常精子具有浓密的固缩核,也有许多精子具有 不同含量的染色质缺陷.精子染色质结构分析能提供一个客 观的精子染色质完整性分析,快速识别和评价精子细胞显示出 对DNA变性的高敏感性l6].精子染色质结构的完整性与精 子畸形率,存活率有关,但与顶体完整率无关. 3顶体状态检测 ? 综述? 在受精过程中,精子发生顶体反应,释放顶体酶,穿入卵细 胞进行受精.顶体结构及功能与妊娠率显着相关,正常的精子 顶体及顶体反应是精卵结合的必要条件.传统的顶体检测方 法技术要求较高,操作复杂,难以推广应用.FCM为研究精子 顶体结构的完整性及顶体反应能力提供了新的方向.实验证 实,一些荧光染料染色后视野反差很大,能够很好的区分顶体 完整和顶体破裂的精子.例如络合异硫氰酸荧光素的花生凝 集素(FITC—PNA),或者络合了异硫氰酸荧光素的豌豆凝集素 (FITC—PSA).精子顶体膜糖蛋白上存在花生凝集素受体半乳 糖,FITC—PNA能特异性地标记在顶体膜上,其荧光强度可 反映顶体大小,因此通过测定荧光强度可间接反映顶体结构的 完整性. 4线粒体功能 线粒体是精子的能量供应中心,其功能状态直接影响精子 的活动力,因此线粒体功能异常也是导致精子功能缺陷的重要 病因之一.常用检测线粒体功能的荧光探针有:罗丹明 (Rhl23),MITO和5,5,6,6L四氯一1,1,3,3I_四乙基苯并咪 唑基羰化青碘(5,5,6,6._Tetrachloro一1,l,3,3r_tetraethyl—i midacarbocyanineiodide,JC—1).Rh123可检测精子线粒体有 无功能,但不能区别线粒体膜电位的高低.通常用Rh123和 PI双染结合FCM检测精子线粒体功能.Rh123是一种花青 苷样荧光染料,呈绿色荧光,对线粒体有特异亲和性,通过 FCM检测精子可分3群:PI(+)Rhl23(一)为死精子;PI(一) Rhl23(+)为线粒体功能良好的精子;PI(一)Rh123(一)为线 粒体功能丧失的活精子.在FCM检测过程中,绿色荧光的强 弱反应线粒体的功能,荧光越强,说明线粒体功能越好,精子活 动力越强;反之精子活动力甚至缺乏lg].Jc1在检测精子线 粒体膜电位方面具有重要作用.JC1能较特异地与线粒体内 膜结合,只在线粒体膜崩解时才释放出来,因此检测结果可靠, 敏感性高,是目前检测精子线粒体功能最适合的探针.应用流 式细胞术可以进行快速,高通量,多参数的定量分析,更加有利 于精子线粒体膜电位的检测ll. 5抗精子抗体的检测 1954年在男性不育患者血清中发现了抗精子抗体(As— Ab),目前其已被列入男性不育患者常规检查的项目之一. AsAb主要有免疫球蛋白(Ig)A,IgG,IgM3种类型,血清中主 要以IgG,IgM为主,而精液中主要为IgA.有研究认为,只有 精子表面AsAb附着才是直接导致男性免疫性不育的免疫因 素,故精液中AsAb比血清中AsAb对生殖的影响更大_1. 检测AsAb的方法较多,免疫株法是当前试验法,但费时 且带有主观性,仅计数100个可活动精子.用FCM检测As Ab既提供了快速,高效的检测方法,又具有高度敏感性和特异 性等优点,每秒数千个细胞的速度分析一万个精子,但FCM 是否会提高AsAb的检出水平,需进一步证实_l. 6生精细胞凋亡的检测 细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育,维护内环境稳 定,由基因控制的细胞主动死亡过程.研究表明细胞凋亡的失 检验医学与临床20l1年8月第8卷第15期LabMedClin,August2011,Vo1.8,No.15 控与许多疾病的发生有关,包括不育症.生精细胞凋亡的检测 方法可采用电镜法或末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧核苷 酸原位末端转移酶标记法(TuNEL)等,但这些方法操作较繁 琐,主观性大,不宜常规使用.现在通常用Annexin-VFITC/ PI双标记后上流式细胞仪检测生精细胞凋亡情况.Annexin- V是一种Ca依赖性磷脂蛋白,凋亡早期Ca升高,磷脂酰 丝氨酸(Ps)由质膜内层转移至外层,Annexin,V与Ps有高特 异性结合.因此标记了的AnnexinV作为荧光探针,与凋亡 外侧暴露的Ps特异性结合,用流式细胞仪检测其凋亡,An— nexin-VFITC/P1是一种灵敏,准确,快速的方法.FCM检测 精子凋亡是一种迅速,准确,客观,可靠的评估精子功能和男性 生育力的新方法1]"]. 7讨论 通过FCM的检测可以得到精液不同时期的细胞数据及 精子形态指标,对临床诊断精子发生障碍的性质,原因和程度 ,弱精子和无精子症的判断,治疗及 提供了客观的依据.对少 疗效的观察可作正确的评价. 流式细胞仪在临床上的广泛应用为精子内部结构和功能 的检测提供了一个新的思路.FCM可以对精液常规检测进行 补充,对男性不育的诊断和治疗及优生优育具有重要的意义. 参考文献 Eli周鑫,夏欣一,曹奇,等.SYBR一14/PI双染法流式细胞术 检测精子质膜完整性的研究[J].中华男科学杂志,2010, 16(7):589—593. 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