【doc】大豆凝集素对小肠上皮细胞和红细胞凝集能力的研究

【doc】大豆凝集素对小肠上皮细胞和红细胞凝集能力的研究 大豆凝集素对小肠上皮细胞和红细胞凝集 能力的研究 动物营养2008,20(2):234.237 ChineseJournalofAnimalNutrition 大豆凝集素对小肠上皮细胞和红细胞凝集能力的研究 王幸马秋枝刘强 (1.南京农业大学动物科技学院,南京210095;2.江苏省化工信息中心有限公司,南京210024) 摘要:本文旨在测定纯化的大豆凝集素对兔和鸡小肠上皮细胞和红细胞的凝集活性.测定大豆凝集素对红细胞 的凝集能力时,采用2%兔红细胞悬液,测定了使兔红细胞50%凝集的蛋白质浓度.测定对兔小肠上皮细胞的凝 集能力时,采用荧光标记SBA与新鲜小肠上皮细胞结合后,观察荧光显微镜下荧光结合细胞比例的方法定量.经 血凝试验结果表明,使兔红细胞50%凝集的SBA蛋白质浓度为2.50,3.69#g/mL,而SBA对鸡的红细胞没有凝 集作用.SBA对兔小肠上皮细胞有结合能力,结合率为30%左右.试验结果说明大豆凝集素的血凝活性具种属 特异性,用SBA与小肠上皮细胞的结合率作为评价其抗营养活性的指标具一定可行性. 关键词:SBA;小肠上皮细胞;红细胞;凝集 凝集素能与特异性糖或糖的复合物专一地,非 共价的可逆结合,糖专一结合是凝集素最基本的特 性.Liener等n发现大豆凝集素(soybeanaggluti. nin,sBA)是大豆中唯一的含量较高的生物活性蛋 白,含量约占大豆蛋白的5%,7%,是影响大豆营 养价值和产品稳定性的主要因素,其生物学功能通 过与细胞的结合而直接或间接的发挥作用. SBA是大豆及其制品中主要的抗营养因子之 一 ,其抗性表现为与肠道上皮细胞结合,引起上皮组 织变态反应,水肿,同时降低了肠道养分的消化和吸 收机能].以往的研究中,有人用对人或动物红细 胞的凝集能力来评价大豆制品中SBA的含量和抗 性..].但从营养学角度分析,SBA抗营养活性的靶 器官首先应该是消化道上皮组织.因此,用红细胞 凝集能力来评价其抗营养活性可能存在方法上的缺 陷,而且,SBA各异构体之间的凝血能力也存在差 异.Hajos等虽然测定了肠道结合SBA的量,但 是与红细胞的凝集现象不同,SBA与上皮细胞的结 合状况不易观察和定量评价,因此探讨SBA与肠道 上皮细胞结合的定量关系有望确立客观评价SBA 抗营养活性的可行方法. 用荧光标记的凝集素作探针检测细胞表面的糖 复合物,已成为用于分离细胞和分析糖复合物等常 用的方法之一嘲.故而本试验拟用荧光素标记凝集 素通过测定SBA-FITC与小肠上皮细胞结合的变 化量,同时参照传统的红细胞凝集法测定结果,比较 不同方法之间的差异,为建立评价SBA的抗营养活 性的客观方法提供有力依据. 1材料与方法 1.1固定化红血球的制备(戊二醛法) 从心脏采取新鲜兔血,注入加有肝素 (30U/mL)和一颗玻璃珠的锥形瓶中,摇动,以脱 去纤维蛋白,并在4?下静置2,7d,用2层纱布过 滤.取脱纤维后的血液,在2000r/min,4?离心 10min,用PBS(0.02mol/L磷酸缓冲液和 0.1mol/LNaC1的混合溶液,pH7.2)洗涤,在 2000r/min,4.C离心10min,如此重复4次,用 PBS冲洗沉淀,制成10%(V/V)的悬液,加入等体 积的含4%戊二醛的PBS,立即混匀,再加入叠氮 钠,使叠氮钠的最终浓度为0.2%(w/v).室温下 搅拌10,18h(20,25?),随时注意调整pH使之 在7,2,7.6,其问间隔2h搅拌1次.然后用PBS 离心洗涤4次,以除去未作用的戊二醛,最终用PBS 配成10%的血球悬液,在4?下保存备用,该悬液可 保存3,6个月. 1.2大豆凝集素(SBA)的红细胞凝集能力的测定 1.2.1SBA对兔红细胞凝集活力的测定 在"v"型血凝板的第1,8列的第1行的孑L中 分别加入25L缓冲液(0.075mol/L磷酸缓冲液 收稿日期:2007-07-26 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30300252) 作者简介:王幸(1979.),女,浙江诸暨人,硕士,主要从事饲料资源开发利用的研究 E-mail:wanganrg@126.com *通讯作者:刘强,副教授,E-mail:liuayang@jlonline.com 2期王幸等:大豆凝集素对小肠上皮细胞和红细胞凝集能力的研究235 — 0.075mol/L氯化钠,pH7.2).取凝集素溶液 25L,加入第1孔,与缓冲液混匀后取出25L,加 入第2孔,混匀后再取出25L,加入第3孔.以此 类推,作倍比稀释直至加到第12行的孔止.待全部 完毕后,开启振荡器,振荡混匀,同时每孔加入 25L固定化好了的2%血球悬液,血球加毕后继续 振荡15min左右血凝板在室温下(20,25.c)静 置1.5,2h,肉眼观察凝集结果. 如血球不发生凝集时,血球沉于"V"型孔底部, 呈一个红色小圆点;如完全凝集时血球相互集聚形 成均匀网络,血球不下沉.根据血球的凝集程度,划 分为以下4个等级:?不凝集:血球全部沉积于"V" 型孔底部,呈边缘清晰的红褐色小圆点;?少许凝 集:大多数血球沉积于"V"型孔底部,红色圆点边缘 模糊;?半凝集:血球部分沉积"V"型孔底部,周围 有一混浊带,约占孔面积的50%;?大部分凝集:血 球少许沉积于孔中心,周围的混浊带面积大于孔面 积的50%;?全凝集:血球相互集聚形成均匀网络 状,血球不下沉.凝集活力判定以50%凝集为终 点. 试验中了一个SBA的浓度梯度,起始浓度 分别为1.0,0.8,0.5,0.2,0.1,0.05和 0.02mg/mL,同一列的SBA浓度是倍比减小的. 最后是一个只加缓冲液和红细胞的空白对照,结果 见表1.表中数字"1"代表少许凝集,"2"代表半凝 集,"3"代表大部分凝集,"4"代表全凝集,"0"代表不 凝集.其中平均值在3.67,4.00即可判定为全凝 集,2.67,3.33判定为大部分凝集,1.67,2.33判 定为半凝集,0.67,1.33判定为少数凝集,0.67以 下即为不凝集. 1.2.2SBA对新鲜红细胞凝集活力的测定 采用鸡,兔红细胞新鲜血液,配制成2%悬液按 上述方法进行凝集活性测定. 1.3SBA对小肠上皮细胞结合能力的测定 1.3.1兔小肠上皮细胞悬液的制备 将兔放血处死后,取小肠(十二指肠与空肠)放 人D—Hank'S溶液中,纵向剪开小肠,用D.Hank,S 反复冲洗,洗去食糜,直到D.Hank'S溶液不再浑浊 为止,然后用载玻片轻轻刮取小肠表层组织,刮取物 放人盛有D-HankS的烧杯中.取上述组织悬液 20mL,加5mL0.15%的胰蛋白酶消化液,37?消 化5min,用含血清的培养液终止胰蛋白酶的活性, 用吸管轻轻吹打分散细胞团块,在倒置显微镜下观 察,单个细胞约占95%即可.经200目网筛过滤 后,将滤液转人10mL玻璃离心管中,1000r/min 离心5min,弃去上清液,用含血清培养液使细胞沉 淀重新悬浮,细胞计数调整密度后接种于灭过菌的 培养板中,得细胞悬液. 1.3.2荧光标记大豆凝集素 取1.0mgSBA与100异硫氰酸荧光素(fluo- presceinisothiocyanate,FITC)溶解于0.2mL 0.15mol/L~酸氢二钠溶液(pH9.0),在25?恒温振 荡水浴锅中保温培养20h.然后在含1.0retool/L CaCl~,1.0mmol/LMgCI2,1.0mmol/LMnC12和 0.5mol/LNaC1的0.05mol/LTris.HCl缓冲液(pH 7.0)中充分透析,更换透析液3,5次,除去未反应 的荧光素.以透析液颜色不发生明显变化判定为透 析完全.将标记好的大豆凝集素储存于棕色试剂 瓶,4?保存备用口]. 1.3.3SBA.FITC与小肠上皮细胞的结合测定 在兔新鲜小肠上皮细胞悬液中加入足量的 SBA.FITC溶液,在37?恒温水浴中摇浴30min, 使细胞与SBA-FITC充分结合.取出后加入等量 体积的0.1mol/LPBS(pH8.0)溶液,轻轻摇匀后, 4?,1000r/min,冷冻离心10min,取沉淀,再加入 等量的PBS溶液,重复离心3次,以除去未结合的 SBA.FITC.取沉淀用PBS溶解摇匀,在荧光显微 镜下观察r5],计数得有荧光的肠细胞占同一视野下 细胞总数的百分数. 2结果与分析 2.1SBA对红细胞凝集能力的测定 不同浓度SBA对兔红细胞悬液的凝集程度见 表1.由表1可以计算出使5%兔红细胞凝集的 SBA浓度为2.50,3.69t~g/mL. 2.2SBA对新鲜红细胞的凝集能力的测定 用上述方法评价SBA对鸡红细胞的凝集能力, 结果表明,无论是新鲜红细胞还是用胰蛋白酶处理 后的红细胞,SBA均不凝集鸡红细胞悬液,而对兔 新鲜红细胞悬液则有明显的凝集能力. 2.3SBA对小肠上皮细胞的结合能力测定 SBA-FITC与兔小肠上皮细胞结合后,在荧光 显微镜下可以清楚的看到荧光,如图1所示.有荧 光的肠细胞占同一视野下细胞总数的百分数即为 SBA的肠细胞结合率.计数得兔的SBA肠结合率 为(31.4?0.8)%. 236动物营养2O卷 4.OO?O.OO 4.OO?O.OO 4.OO?O.OO 4.OO?O.OO 4.OO?O.OO 3.67?O.58 3.OO?O.OO 2.67?O.58 3.OO?O.OO 2.OO?O.OO 2.OO?O.OO 4.OO?O.OO 4.OO?O.OO 4.OO?O,OO 4.OO?O.OO 3.67?O.58 3.OO?O.OO 3.OO?O.OO 3.OO?O.OO 2.OO?O.OO 2.OO?O.OO 1.67?O.58 4.OO?O.OO 4.OO?O.OO 4.00?0.OO 4.OO?O.OO 3.OO?O.OO 2.67?0.58 2.OO?O.OO 1.67?O.58 1.67?O.58 1.OO?O.OO 1.OO?O.OO 4.OO?O.OO 4.OO?O.OO 3.33?0.58 3.OO?O.OO 3.OO?1.OO 2.OO?O.OO 1.67?0.58 1.67?0.58 1.OO?O.OO 1.OO?O.OO 0.67?0.58 4.OO?O.OO 3.33?O.58 3.OO?O.OO 2.33?O.58 2.OO?O.OO 2.OO?O.OO 1.OO?O.OO 1.OO?O.OO O.67?O.58 O.67?O.58 O.OO?O.OO 3.OO?O.OO 2.33?O.58 2.OO?O.OO 2.OO?O.OO 1.67?O.58 1.OO?O.OO 1.OO?O.OO O.67?O.58 O.OO?O.OO O.OO?O.OO O.OO?O.OO 2.33?O.58 2.OO?O.OO 2.OO?O.OO 1.67?0.58 1.OO?O.OO 1.OO?O.OO O.OO?O.OO O.OO?O.OO O.OO?O.OO 0.OO?O.OO 0.OO?O.OO O.OO?O.OO 0.00?0.OO O.OO?O.OO O.OO?O.OO O.OO?O.OO O.OO?O.OO O.OO?O.OO O.OO?O.OO O.OO?O.OO O.OO?O.OO 0.00?0.OO 图1FITC—SBA与兔小肠上皮细胞 结合后的荧光显微观测 Fig.1Thefluorescenceofrabbitsmallintestine cellconjunctedwithFITC-SBA 3讨论 3.1SBA的红细胞凝集能力 SBA的生物学功能是通过与细胞的结合而直 接或间接发挥作用,概括起来可分为两类:凝集活性 和促分裂活性.其中,红细胞凝集活性是大豆凝集 素最早发现的生物活性,同时SBA的血凝活性还具 有种属特异性,对兔和人红细胞的凝集反应最敏 感.研究证实大豆凝集素因物理或化学因素聚合 时,单体间相互交联,分子大小增加,与红细胞反应 的位点增多,凝集活性增强.红细胞经胰蛋白酶或 链霉蛋白酶处理后,与大豆凝集素的凝集反应明显 增强.在本试验中大豆凝集素能凝集兔的红细 胞,但不能凝集鸡的红细胞和经胰蛋白酶处理鸡红 细胞,说明其确实存在种属特异性,这与以往研究结 果相符. 本试验还发现SBA的浓度大小对其细胞凝集 活性有很大影响.SBA浓度越大,凝集的活性越 大,这是因为凝集素的凝集活力(凝集效价)与凝 集素的量成线性关系.并且经计算知使5O%兔红 细胞凝集时的SBA浓度为2.50,3.69~g/mL,这 一 结果与孙册等的记载结果基本一致. 3.2SBA的小肠上皮细胞结合能力 在用SBA.FITC复合物结合肠细胞悬液的试 验中,SBA.FITC对兔的肠细胞有结合能力,结合率 为3O%左右.同时,本研究曾用相同的方法测定了 SBA.FITC对鸡小肠上皮细胞的结合力,虽然可观 察到SBA能与鸡小肠上皮细胞结合,但结合率未成 功测定,尚需进一步研究.分析原因可能是鸡的小 肠经D.Hank's反复冲洗后,小肠上皮细胞溶解了. SBA同动物的小肠黏膜有广泛的结合作用,并与上 皮细胞有固定的结合部位,而且这种结合作用并不 像血凝活性一样有明显的种属特异性.因此,根据 本试验的研究结果,消化道作为SBA直接危害的对 象,应该是评价SBA抗营养活性的更合理的研究 对象. 4结论 ?SBA不能凝集新鲜鸡红细胞,但能凝集新鲜 兔红细胞,说明其血凝活性具种属特异性. ?SBA能结合小肠上皮细胞,兔的结合率为 30%左右,用SBA与小肠上皮细胞的结合力作为评 价其抗营养活性的指标具可行性. 2期王幸等:大豆凝集素对小肠上皮细胞和红细胞凝集能力的研究237 参考文献: r1]LienerIE,PallanschMJ.Purificationofatoxic substancefromdeffatedsoybeanflour.Biological Chemistry,1952,197:29—36. [2]李振田.大豆凝集素的监测,纯化和对大鼠的抗营养 作用机理研究.博士学位论文.北京:中国农业大 学,2003. r3]deMuelenaereHJH.Effectofheattreatmentson thehemagglutinatingactivityoflegumes.Nature, 1964,201:1029.1030. r4]HajosG,GelencserE,PusztaiA,GrantG,Sakhri M.Biologicaleffecetsandsurvivaloftrypsininhibi- torsandthwagglutininfromsoybeaninthesmallin- testineoftherat.AgricultureChemistry,1995,43: 165.170. [5]张惟杰.糖复合物生化研究技术.杭州:浙江大学出 版社,1994.470-540. [6]孙册,朱政,莫汉庆.凝集素.北京:科学出版 社,1984.20-35. [7]MarshellJD.Superiorityoffluoresoeinisothiocya— nateforflurescent.antibodytechnique,withamodi- ficationofitsapplication.ProceedingsoftheSociety ,0,ExperimentalBiologyandMedicine,1958,98: 898.900. r8]LotanR,LisH,SharonH.Enhancementofthebi— ologicalactivitiesofsoybeanagglutininbycross— linkingwithglutaradehyde.BiochemistryBiophys— fcs,1973,55:1347.1355. [9]TernynckT,GuesdonJL,AvramedsS.Theuseof avidin—biotininteractioninimmunoenzymatictech— niques.HistochemCytochem,1979,27(8):1131- 1139. [1O]CokeB,SeigelEG,StockmamnF,LankischPG, CreutzfeldtW.Effetofaspecificserineprotease inhibitorsonthepancreas.II.Influenceofcamo— stateontheendocrinepancreas.Digestion,1985, 31:128.135. ResearchofSBAAgglomerateAbilitytoIntestinalEpidermisCellandRedCell WANGXing'MAQiu—zhiLIUQiang (1.CollegeofAnimalTechnologe,NanjingAgriculturalUniversity,Naniing210095,China; 2.TheInformationCenteroftheChemicalIndustryofJiangsuProvinceCo.,Ltd.,?可 ing210024,China) Abstract:TostudytheagglutinateabilityofSBAonredcellsandintestinalepithelialcells,2%r abbitredcellsuspensionwas usedtotesttheagglutinateabilityofSBA,andtheFITC-SBAwasusedtotestthebindingabilit yofSBAonfreshrabbitand avianintestinalepithelialcells.TheminimalSBAconcentrationwhichcouldagglutinate5O%ofredcellsof2%rabbitred cellsuspensionwas2.50--3.69,%/mL.TherewasnoagglutinateabilityofSBAonavianredcellsuspension.Theresultin. dicatedthattherewasthecapacityofSBAtobindingrabbitepithelialcells,andthattheSBAcouldbindto30%testedcells. TheagglutinateabilityofSBAonavianredcellshaditsgeneraspecificity,anditwassuitabletoevaluatetheanti.nutrition activityofSBAbyitsagglutinateabilityonepidermiscells.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2008,20(2):234-237] Keywords:SBA;Intestinalepithelialcell;Redcell;Agglutinateability *Correspondingauthor,associateprofessor,E-mail:Liuayang@jlonline.corn(编辑胡晓 蕾)