稻瘟菌基因组DNA提取

稻瘟菌基因组DNA提取 DNA的提取包括以下几项:首先，必须破碎(或消化)细胞壁释放出内溶物。然而许多操作在破壁的同时也会剪切DNA，因此任何方法都是在DNA的完整性和产量这两个方面之间折衷考虑的结果。分离总基因组DNA常用的破壁方法是将样品在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉末。 其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅因子--镁离子。 最后，一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降低到最低。剧烈振荡或小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。一般来说，如果操作得当，可以得到相对分子 。 质量长度为50~100kb的DNA 不过，分离高相对分子质量的DNA还只是工作的一部分。因为在DNA粗提物中往往含有大量的RNA、蛋白质、多糖和色素等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。大多数蛋白质可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过RNase A除去。但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，常常使DNA抽提物呈胶状，更为重要的是即使是低浓度情况下它们也会干扰后续操作，如抑制某些DNA修饰酶包括限制性内切酶的活性，从而阻碍Southern杂交或基因克隆;同时多糖杂质还会影响分光光度法对核酸的定量分析等。PVP可以去除多酚类物质，以免酚类物质氧化带来的颜色影响所抽提DNA的质量。 1) Extraction buffer:50mM Tris-Cl(pH 8.0); 150mM NaCl; and 100mM EDTA(pH 8.0). 2)20% SDS 3)5M NaCl 4)CTAB/ NaCl :10%CTAB in 0.7M NaCl solution SDS提取DNA(大量制备) 操作步骤 1 称取菌丝1-2g放于研钵中，加液氮将其研磨成粉末(尽量细)。 2 将粉末转入50ml离心管中，加入15ml提取液,混匀(此处可剧烈晃动，使其充分混匀)。 3 加750μl 的20% SDS，轻轻混匀，于37?水浴中温浴60分钟(每隔10分钟晃动一次，注意防止将盖子弹出)。 4 加2.25ml的5M NaCl，小心彻底混匀。 5 加2ml的CTAB/ NaCl溶液，混匀，于65?水浴中温浴30~60分钟(期间注意混匀)。 6 待稍冷却后(如不冷却，CTAB去多糖的效果不好)，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混 匀，12000g 10min(根据对DNA的质量要求，可决定是否重复该步骤)。 7 上清转入另一离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀30分钟(放置时间长点可 能产量高点;或在-20?下沉淀，但有可能有部分SDS随DNA沉淀，以后很难去除)， 12000g 10min 。 8 沉淀用70%的乙醇洗涤后，干燥。 9 加入700μl的TE溶解(含RNase)，转入EP管，于65?处理15~20分钟后，放置37? 30-60min消化RNA。 10 再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀 12000g 10min 4?。 11 上清转入另一离心管，再加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，上清转入另一离心管。12000g 10min 4?(如果上述步骤操作较好，本步可以省略)。 12 上清转入另一离心管，加入1/10体积的3M的NaAC和0.6倍体积的异丙醇，-20?沉淀 30-60分钟。 13 12000g 10min 4?。去上清，70%乙醇洗涤沉淀2~3遍。 14 将沉淀干燥后溶于100μl的TE中。 SDS提取DNA(小量制备) DNA的大量制备往往用于基因组Southern和Plasmid rescue等分析。但当DNA需要量少且需要处理大量样品时，一般采取小量制备的方法，此方法所提取的DNA可满足于RAPD和基因敲除实验中PCR之用。 操作步骤 1. 从平皿上刮下少量菌丝及孢子或试管摇培收集少量菌丝(一般约20~25 mg)，加入1.5 ml的EP管中。 2. 加入少许液氮，用钢棒或玻棒在EP管中将其研成粉末。 3. 加入500 μl的抽提液悬浮，混匀。 4. 加入50 μl的10%的SDS，37?处理1~3 h，并间歇颠倒混匀数次。 5. 然后加入75 μl的5 M的NaCl，混匀。 6. 加入65 μl的CTAB/NaCl溶液，65?处理30~60min。 (以上四步可以节减，以2×CTAB()代替) 7. 加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，混匀，10000 rpm离心10 min，上清 转移至另一EP管中(本步可以重复，提高DNA质量)。 8. 加入0.6倍体积的异丙醇，-20?沉淀1 h，10000 rpm、4?离心10 min，弃上清。 9. 沉淀用70%的乙醇洗涤2次。 10. 将沉淀干燥后溶于100 μl TE(含100 μg/ml的RNase)中。