【精品】高效液相色谱法测定鱼鳔补肾丸中补骨脂素的含量

【精品】高效液相色谱法测定鱼鳔补肾丸中补骨脂素的含量 高效液相色谱法测定鱼鳔补肾丸中补骨脂素的含量 【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定鱼鳔补肾丸中补骨脂素的含量。方法 采用Hypersil ODSC18(4.6mm×200mm,5μm)色谱柱，乙腈-0.1%磷酸溶液(30:70)为流动相，流速为1.0ml/min,检测波长245nm。结果 补骨脂素在0.07168,0.35840μg范围内呈良好的线性关系，r=0.9999,平均回收率为100.29%(n=6),RSD=1.47%。结论 所建立的方法稳定、可靠，可为该产品建立质量控制方法提供参考。 【关键词】 高效液相色谱法;鱼鳔补肾丸;补骨脂素;含量测定 【Abstract】 Objective To establish a HPLC method for the determination of psoralen in Yubiaobushen pills.Methods Hypersil ODSC18 column(200mm×4.6mm,5μm)was used with mobile phase of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution(30:70).The flow rate was 1.0ml/min and detection wavelength was 245nm.Results The linearity range of psoralen was 0.07168,0.35840μg(r=0.9999),the average recovery rate was 100.29% (n=6) with RSD1.47%.Conclusion This method is accurate,reproducible,and can be used for the quality control of the Yubiaobushen pills. 【Key words】 HPLC;Yubiaobushen pill;psoralen;determination 鱼鳔补肾丸由鱼鳔胶、枸杞子、当归、补骨脂、淫羊藿等组成，具有壮阳益精等功效，用于肾阳虚弱，肾精亏损所致的头昏、眼花等。该药品标准收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第八册,缺含量测定项。方中补骨脂有补肾助阳的功效，为重要臣药，其主要有效成分为补骨脂素和异补骨脂素,1,，本文采用高效液相色谱法对补骨脂的补骨脂素进行了含量测定研究。该方法稳定、可靠，可为该产品建立质量控制方法提供参考。 1 仪器与试药 岛津LC-10AD高效液相色谱仪(配有SPD-10A检测器，N2000色谱工作站)，AE240电子天平(梅特勒公司)。补骨脂素对照品(供含量测定用，批号:110739-200309，中国药品生物制品检定所提供)，3批鱼鳔补肾丸(批号分别为:20060112，20060119，20060326)。乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯化水，其他试剂均为分析纯。 2 溶液的制备 2.1 对照品溶液 精密称取补骨脂素对照品17.92mg，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。 2.2 供试品溶液 取本品适量，剪碎，取约1.5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300W，频率50kHz)45min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。 2.3 缺补骨脂阴性样品溶液 取缺补骨脂阴性样品，同“2.2”项下方法操作，即可。 3 方法与结果 3.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Hypersil ODSC18(4.6mm×200mm,5μm),流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(30:70)，流速为1.0ml/min,柱温为室温。分别精密吸取“2”项下对照品溶液、供试品溶液及缺补骨脂阴性样品溶液各10μl,注入液相色谱仪，按本色谱条件测定。结果补骨脂素理论塔板数为15000以上，补骨脂素与邻近的杂质峰分离度为3.6以上，阴性样品在补骨脂素对照品相同保留时间位置上未见色谱峰，说明方中其他成分对补骨脂素测定无干扰，结果见图1。 3.2 线性关系考察 精密吸取“2.1”项下对照品储备溶液(0.1792mg/ml)0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,分别置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过。分别吸取续滤液10μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，并以峰面积(Y)对进样量(X，μg)进行线性回归，得线性方程:Y=4843233.40X+32673.65,r=0.9999,进样量在0.07168,0.35840μg范围内 呈良好的线性关系。A.对照品 B.样品 C.阴性样品 图1 HPLC色谱图 3.3 精密度、重复性试验和稳定性试验 按上述色谱条件，精密吸取“2.1”项下对照品溶液连续进样6次，每次10μl,峰面积平均值为862783.9,RSD为0.7%,结果明精密度良好。按“2.2”项下方法处理同一批样品(批号:20060112)6份，HPLC分析，进样量均为10μl，含量的平均值为0.3012mg/g，RSD为1.5%,结果表明重复性良好。精密吸取“2.2”项下供试品溶液10μl，按上述色谱条件于0、2、4、8、12h进样测定，峰面积平均值为896126.5,RSD为2.0%，结果表明供试品溶液在室温下12h内稳定。 3.4 加样回收试验 取已知含量的鱼鳔补肾丸样品(批号:20060119，含量为0.3065mg/g)6份，每份约0.75g，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液(0.02203mg/ml)各10ml,再按“2.2”项下方法制备供试品溶液，HPLC分析，进样量均为10μl，结果见表1。表1 加样回收率测定结果 3.5 样品的测定 精密称取3批样品(批号分别为:20060112，20060119，20060326)各3份，每份1.5g。按“2.2”项下方法制备供试品溶液，HPLC分析，进样量均为10μl，按外标法计算补骨脂素含量，结果见表2。表2 样品测定结果 4 讨论 4.1 流动相的选择 参考文献资料,2，3,，试验中考察了三组流动相系统:甲醇-水、乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸溶液，结果表明以乙腈-0.1%磷酸溶液(30:70)为流动相对，补骨脂素峰基线分离，且峰形较好，故选择流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(30:70)。 4.2 提取方法的选择,2，3, 比较超声提取与回流提取，发现补骨脂素提取率相差不大，因超声提取供试品溶液所含杂质较少，且方法简单，便于操作，故选择超声提取。曾试验了甲醇和稀乙醇提取，结果甲醇优。考察了甲醇溶剂量(15，25，35ml)，结果选择甲醇25ml。考察了提取时间(30，45，60min)，结果选择45min。 4.3 由于缺补骨脂阴性样品在异补骨脂素对照品相同保留时间位置上有干扰色谱峰出现，故未建立其含量测定方法。 【参考文献】 1 江苏新医学院.中药大辞典().上海:上海人民出版社，1977，1177-1179.2 国家药典委员会.中华人民共和国药典，2005年版一部.北京:化学工业出版社，2005，129.3 傅欣彤，李琰，张小茜，等.HPLC法测定五味益肾酒中补骨脂素和异补骨脂素的含量.药物分析杂志，2008，28(3):405-410.