猴头菇多糖研究

猴头菇多糖研究 洛阳理工学院毕业(论文) 猴头菇多糖的提取与分离技术 摘 要 介绍了热水浸提法、超声波提取法提取分离猴头菇多糖的工艺机理以及各优缺点的比较，系统阐述了热水浸提法、超声波提取法提取多糖的研究进展。超声波技术提取植物多糖，该法是应用超声波强烈空化作用提取植物的有效成分，是一种物理破碎过程。目前，超声波技术在提取植物化学成分方面已得到广泛应用。 关键词:猴头菇多糖，热水浸提法，超声波，提取，分离 I 洛阳理工学院毕业设计(论文) Hericium Extraction and Separation Technology ABSTRACT Introduced the hot water extraction, ultrasonic extraction of polysaccharides Hericium Extraction mechanism and compare advantages and disadvantages of each method, the system described hot water extraction, ultrasonic extraction of polysaccharides extraction progress. Ultrasonic extraction of plant polysaccharides,the law is strong cavitation. Ultrasonic extraction of plant active ingredients is a physical process of fragmentation. At present, the ultrasonic technology in the chemical composition of plant extract has been widely used. KEY WORDS:Hericium Ernaceus Polysaccharide,hot water extraction,ultrasonic extraction,separation II 洛阳理工学院毕业设计(论文) 目 录 前 言 ................................................................................................ 1 第1章 猴头菇多糖的提取与分离技术的研究进展 ........................ 2 第2章 猴头菇多糖的提取与分离技术 ............................................ 3 2.1 热水浸提法 ........................................................................... 3 2.2 超声波提取法 ..................................................................... 10 第3章 猴头菇多糖的提取与分离技术展望 .................................. 18 谢 辞 ................................................................................................ 19 参考文献 .......................................................................................... 20 外文资料翻译 .................................................................................. 22 III 洛阳理工学院毕业设计(论文) 前 言 猴头菌，又名猴头蘑、熊头菇、刺猬菌，隶属于担子菌门，猴头菌科，是著名的药食两用菌。猴头菇性平，味甘，有利五脏，助消化，滋补身体等功效，特别是对胃溃疡，十二指肠溃疡和神经衰弱等患者有很好的保健效果。猴头菇多糖是猴头菌的主要活性成分之一，具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗突变、防辐射等作用。 目前，猴头菇多糖的研究中存在的主要问题在于传统提取工艺提取率低、耗时久， 因此迫切需要改进提取工艺、提高产率。猴头菇多糖具有多种生物活性，其疗效已被大量实验证明， 但其作用机制还未完全弄清;猴头菇多糖的结构决定其生物活性， 目前结构方面的研究结果存在较大差异， 活性部位的研究还不透彻。目前，新的提取工艺，如超声波辅助萃取、微波辅助萃取、超临界萃取、超滤以及膜分离等已成功用于植物有效成分的提取。特别是超声波和微波辅助萃取在提取真菌多糖方面已有很多报道，显示出传统方法无可比拟的优势，但应用于猴头菇多糖提取的研究未见报道。因此， 这些新型技术在猴头菇多糖的提取方面具有重要的应用前景。此外，猴头菇多糖的构效关系、量效关系及免疫作用机理是极其有意义的研究课题。猴头菇多糖目前已制成各种药物及保健品，深受人们喜爱。猴头多糖应用前景广泛，己吸引了越来越多的研究者的注意。进一步开展猴头菇多糖的分离纯化、结构及药理实验研究，对药物和食品开发以及猴头菇资源的利用都具有重要的意义。 因此，本文将对近年来研究较多的猴头菇多糖的分离与提取技术进行综述。 1 洛阳理工学院毕业设计(论文) 第1章 猴头菇多糖的提取与分离技术的研究进展 猴头菌多糖的提取方法较多，比较常用的有热水浸提法、稀碱液浸提法、稀酸液浸提法等。但因为稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，故热水浸提法仍是研究和应用最多的一种方法,1,。近年来，超声波提取法和酶提取法也得到了广泛的应用。吴克等,2,在对猴头菌子实体多糖的提取中，结合实验结果及考虑提取成本，发现最适温度为80?，提取时间为1h，提取液采用60,的乙醇醇析最佳。刘重芳等,3,通过正交实验确定出多糖提取的最优条件为煎煮3次，每次 1h，滤液合并，醇沉淀浓度为75,。杨炎等,4,得到优化猴头菌子实体多糖的提取最佳工艺为8倍提取液、煎煮1.5h、3次、醇沉淀浓度为70,。张树海等,5,采用热水浸提和超声波处理的方法对猴头菇子实体多糖进行了提取和纯化研究，证明在90?、加水20倍、pH=7.5、浸提8h、超声波处理50s的条件下，猴头多糖提取率可达5.43,。梁华等,6,通过单因素试验和正交实验确定了乙醇浓度和料液比是影响猴头菌中可溶性粗多糖的提取率的主要因素。粗多糖的提取的过程中往往会伴随有蛋白的出现，研究发现,7,，对粗蛋白进行脱蛋白纯化以后，其生物活性会更高。朱美静等,8,研究比较了Sevag法和TCA法对猴头多糖脱蛋白的效果，结果显示，TCA法对猴头菌多糖脱蛋白的效果更好，且多糖损失较少。 2 洛阳理工学院毕业设计(论文) 第2章 猴头菇多糖的提取与分离技术 2.1 热水浸提法 近年来，对多糖提取工艺的研究方法很多如热水浸提法、稀碱液浸提法、稀酸液浸提法。稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，此处采用热水浸提法。 2.1.1 材料和试剂 干猴头菇子实体 ; 胰蛋白酶:(酶活:2500 U,g)，中国医药集团上海化学试剂公司; 碘液、糖化酶:(酶活:10万U,g)，北京奥博星生物技术责任有限公司; 乙醇、蒽酮、硫酸、葡萄糖:均为分析纯。 2.1.2 实验仪器 TU一1800S紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器公司 ; TGL一16C高速台式离心机 :上海安亭科学仪器厂; SHB—III循环水式多用真空泵 :江苏金坛宏凯仪器厂; HH一4数显恒温水浴槽 :江苏亿通电子有限公司; BS一210S电子天平:德国赛多利斯天平公司; RE一52AA旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂; DZF6050型真空干燥箱:上海精宏实验设备有限公司。 2.1.3 工艺 粉碎一热水浸提(95?)一抽滤一浓缩一醇析一 离心一去淀粉一除蛋白一去小分子物质一醇析一 离心一 干燥一成品 3 洛阳理工学院毕业设计(论文) 2.2 实验方法 2.2.1 曲线的绘制 称取0.5g葡萄糖分析纯，用蒸馏水定容于500 mL容量瓶中;再称取0.4g蒽酮，用浓硫酸定容于200mL容量瓶中，分别量取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL葡萄糖溶液形成浓度梯度，各定容于 100 mL容量瓶中;各取2 mL葡萄糖溶液，加入8 mL蒽酮硫酸定容至10 mL，再取 2 mL蒸馏水，加入8 mL葸酮硫酸定容至 10 mL;将 7个样品置于冰水 中冷却5 min，再浸入沸水中加热 10 min，冷却至室温;用紫外分光光度计在 620 nm下测定其吸收度，其吸收度分别为0(0342，0(0912，0(1336，0(1844，0(2471，0(3157，0(3618描绘标准曲线见图1。 2.2.2 单因素实验 根据文献得知，影响多糖提取效果的因素有:浸提温度，浸提时间，加水倍数，醇析的乙醇浓度,9,。在文献中发现浸提温度都是在80一100?之间讨论，考虑到实际生产的成本，故只对其他3个因素进行讨论。因提取的多糖具有活性，100?的浸提温度可能会影响到其活性，故实验中以 95?作为浸提温度。本实验对浸提时间，加水倍数，醇析的乙醇浓度做单因素实验，单因素实验的安排见表 1。 4 洛阳理工学院毕业设计(论文) (1) 实验材料的制备 将无杂质的猴头菇子实体60?下真空干燥4 h以除去水分。将干燥的猴头菇子实体磨碎并过30目筛。将所得粉末密封保存待用。 (2)实验步骤 (1)称取6.25g猴头菇倒人圆底烧瓶中，加入表1中对应的蒸馏水的倍数摇匀，置于恒温水浴锅内，按表1中对应的时间浸提。浸提后将混合物进行抽滤，将滤液放人旋转蒸发仪中蒸馏浓缩至20 mL左右,10,。浓缩液转入小锥形瓶中，加入表1中对应浓度的乙醇(20倍于浓缩液)进行醇析 24 h使其完全沉淀。再将混合物以3500 r,min的转速离心得多糖粗品。 (2)多糖粗品转入小烧杯并加蒸馏水 20 mL使其溶解，在90?下水浴 30 min将多糖糊化 ，降温至60? ，用糖化酶(酶活:10万 U,g)0.005 g处理10min，用碘液检验至碘液不变色 。 (3)称取0.00125 g胰蛋白酶(酶活2500U,g)在37? 下处理50min，在 280 nm下紫外检测无明显吸收峰，说明蛋白质已经除尽。 (4)把透析袋放人大烧杯中煮沸 10 min，待其完全分离后捞出待用。将处理液装入已用线绑好一端的透析袋，然后在离液面2—3 cm处绑好另 5 洛阳理工学院毕业设计(论文) 一端并进行流动透析,11,。透析24 h，直至透析袋中的溶液从淡黄色变为无色。 (5)在透析后的多糖溶液中加入 40 mL无水乙醇放置24 h沉淀。将沉淀后的混合物离心，沉淀转入小烧杯中(烧杯的重量)，在 40?下真空干燥,12,。完全干燥后再次称重，前后的质量差即为提取的粗多糖的质量。 (6)粗多糖的测量采用蒽酮硫酸法 ，参照文献进行,13,。 2.2.3 结果与讨论 (1)加水倍数对提取率的影响 加水倍数的改变对猴头菇多糖提取率的影响见图2。图2结果显示，从5倍体积到15倍体积水的过程中，多糖提取率有明显的提高。从15倍体积到20倍体积水的过程中，多糖提取率的提高虽然没有前面的明显，但是也有较大提高。由于水不是昂贵的原料，因此可以把加水倍数的最优条 件定为20倍体积水。实验数据见表 2。 (2) 浸提时间对提取率的影响 浸提时间的改变对猴头菇多糖提取率的影响见图3。图3结果显示，浸提时间从2h到6h，提取率有明显的提高6h后提取率变化很微小，所以浸提时间的最优条件为6h。实验数据见表3 6 洛阳理工学院毕业设计(论文) (3)乙醇浓度对提取率的影响 乙醇浓度的改变对猴头菇多糖提取率的影响见图4。图4结果显示，浓度从70,—90,提取率都有明显的增长，但90,以后曲线趋势变得平滑，说明 90,的乙醇浓度已经能够把多糖完全沉淀下来，再高浓度的乙醇已经没有必要。本实验采取的是加入时乙醇的浓度，而实际醇析的乙醇浓度在65,—95,之间，实验数据见表4 7 洛阳理工学院毕业设计(论文) (4)正交实验结果与统计分析 根据单因素实验的结果，3个因素中最优条件分别为:浸提6h，加水20倍，90,浓度的乙醇。选定三因素三水平做正交实验，因素水平、实验结果计算及分析见表5、6。从表6可知，浸提次数是影响多糖提取率的最关键因素，其次是乙醇浓度，加水倍数，在实验范围内，浸提时间的影响最小。 8 洛阳理工学院毕业设计(论文) 极差的大小反应了各个因素对指标的影响程度，根据表7中的极差分析，可排列出实验因素的主次顺序如下:A> D>B>C。由表7最优水平搭配为A3B2C1D3，即最优提取条件为:浸提3次，加20倍体积水，浸提时间4h，乙醇浓度95,。通过正交实验发现浸提次数是影响多糖提取率的最 主要因素，在 1次、2次、3次的提取实验中发现多糖提取率明显增加，至于再增加浸提次数是否还能显著地提高提取，本次实验没有进一步研究。这主要是出于实际生产的考虑，超过3次的浸提虽然能增加提取率 ，但是可能会花费更多的时间成本，因此认为把浸提次数定为3次是比较符合实 际生产的。加水倍数是次之的影响因素，加水过多会耗费能源，加水过少会使猴头菇中的多糖提取不充分，因此加20倍体积水最合适。其次是乙醇浓度，过多乙醇浓度偏高会造成浪费，乙醇浓度偏低会使多糖沉淀不完全， 9 洛阳理工学院毕业设计(论文) 影响提取率，因此乙醇浓度为95,为最优条件。 另外 ，柯丽霞等,14,的研究结果表明，在用稀碱(NaOH)作为提取剂提取红汁乳菇多糖时根本就得不到多糖;在用稀酸(NH4CI)作提取剂时最后能得到粗多糖粉末，但得率很低(0.3NH4CI得率为3.42,，蒸馏水得率为4.35,)，同时，稀酸和稀碱提取多糖容易造成糖苷键的断裂,15,16,。本实验利用蒸馏水的最优提取得率可以达到7.29,。故利用蒸馏水提取具有方法简便、提取率高等优点。 2.2超声波提取法 传统的猴头菇多糖常采用热水回流浸提法，提取工艺复杂，浸提剂用量大、收率低(多糖提取率一般在4.5以下)、成本高。近年来人们开始采用超声波技术提取植物多糖，该法是应用超声波强烈空化作用提取植物的 10 洛阳理工学院毕业设计(论文) 有效成分，是一种物理破碎过程。目前，超声波技术在提取植物化学成分方面已得到广泛应用。本文在单因素实验的基础上，通过正交设计实验，并与传统热水法提取工艺进行比较，对猴头菇多糖提取主要工艺条件进行了优化研究。 2.2.1 仪器试剂及试验材料 JY92-?超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司;721型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;TDL - 5型低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂;电热恒温水浴槽;上海医疗器械三厂;分析天平，上海精密科学仪器有限公司;布氏漏斗(DHB-3型循环水真空泵)，巩义市英峪仪器厂;苯酚、葡萄糖、无水乙醇、浓硫酸等均为分析纯试剂。 猴头菇产于福建古田，烘干后切片，粉碎，过40目筛，70?真空干燥，待用。 2.2.2 试验方法 (1)猴头菇多糖传统热水提取和超声提取实验方法 精密称取猴头菇菌粉样品约2g，放入圆底烧瓶，先用乙醚回流脱脂2次，再用85,( 质量分数，以下同) 乙醇提取去除单糖、低聚糖，过滤。预处理后的菌粉按一定条件(料液比、提取次数、浸提时间、温度) 采用不用提取方法提取2次，过滤，滤液合并，乙醇沉淀，得样品粗多糖，计算多糖提取率。 (2)多糖的测定方法—苯酚硫酸法 精密称取105?干燥至恒重的葡萄糖对照100mg置于100mL容量瓶 中，加水适量使溶解，定容，得1mg/ml的标准品溶液。用移液管精密移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL的葡萄糖标准品溶液分别定容至100ml容量瓶中,分别取1.0mL于10ml比色皿中，另加1.0mL的5,的苯酚，摇 匀 ，迅速滴加浓硫酸各5 ml,摇匀后放置5mi n，置沸水浴中加热15mi n ，取出冷却至室温，以空白校正零点，于490n m 处检测其吸光度，得回归方程y=0.89169x+0.03108，r=0.99781 (3)多糖提取率计算方法 11 洛阳理工学院毕业设计(论文) 2.2.3 结果与分析 (1)传统热水法与超声波法多糖提取工艺条件的比较与确定 1)提取料液比 分别采用传统热水法与超声波法提取多糖，提取条件分别为 :传统热水法浸提时间2h，提取温度70?，提取次数2次:超声波法超声时间15mi n，提取温度40?，提取次数2次，结果如图1。 由图1可看出，多糖提取率随溶剂量的增大而增大，而且在料液比1:10与1:15之间有较大增幅，而后趋向平缓。虽然增大料液比多糖提取率也会有所增高，考虑到料液比太高会使多糖浓度偏低，而且会增加后续工艺中的提取液的浓缩成本和醇沉中的乙醇用量。因此认为，传统热水法和超声波法料液比的最佳料液比1:15为宜。 2)提取时间 分别采用传统热水法与超声波法提取多糖，提取条件分别为:传统热水法料液比1:15，提取温度70?提取次数2次;超声波法料液比1:15，提取温度40?提取次数2次，结果如图2。 12 洛阳理工学院毕业设计(论文) 由图2明显看出，多糖提取率随时间的延长而提高，传统热水法在提取1~2.5h之间增幅较大，但在提取2.5h后，多糖提取率增幅较小，这是由于传统热水法在提取2.5h后，其中多糖大部分已溶出;而超声波法多糖提取率在超声处5~20mi n之间增幅明显，在超声处理20mi n后，多糖提取率增幅较小，这是由于超声波产生的强烈振动，高的加速度，强烈的空化效应、搅拌作用等，加速了有效成分进入溶剂，从而有利于多糖的提取,17,，但时间过长会使部分多糖结构被破坏，从而影响了多糖提取率。通过以上分析可知，传统热水法最佳提取时间为2.5h，而超声波处理最佳时间为20mi n 。 3)提取温度 分别采用传统热水法与超声波法提取多糖，提取条件分别为:传统热水法料液比1:15，时间2.5 h，提取次数2次;超声波法料液比1:15，时间 20min,提取次数2次,结果如图3。 13 洛阳理工学院毕业设计(论文) 由图3可看出,超声方法随温度的升高,多糖提取率上升较快,在 50?以后,多糖提取率增幅较小,这是由于超声作用随着温度的升高,空化作用加强,使得细胞破碎程度过大,其它杂质也被提取出来,从而影响多糖提取率;传统热水法随着温度的升高，多糖的提取率也增大，但增大幅度变化不大，温度在80?以后增大幅度趋向平缓，这是由于过高温度破坏部分多糖结构，使有些多糖发生降解而影响生物活性，从而影响多糖提取率。根据以上分析可知，传统热水提取法的最佳温度为80?，而超声波法最佳提取温度为50?。 4)提取次数 分别采用传统热水法与超声波法提取多糖，提取条件分别为:传统热水法料液比1:15，时间2.5h，提取温度80?;超声波法料液比1:15，时间 20min，提取温度50?,结果如图4。 14 洛阳理工学院毕业设计(论文) 由图4可看出，提取次数对多糖提取率的影响较为显著。两种提取方法随着提取次数的增大，加多糖的提取率也随着增大,且在提取第二次前多糖提取率加量增加明显，以后尽管都有增加,但增加不太明显。考虑到提取次数在第二次以后对多糖提取影响不大，为了节约成本，减少溶剂用量 ，传统热水法和超声波法的提取次数为二次较为理想。 (2)超声提取猴头菇多糖提取条件的优化 通过对传统热水法与超声波法多糖提取工艺条件的比较，可以看出超声波法提取多糖明显优于传统热水法，为了选取猴头菇多糖的超声提取最佳条件，在单因素的考察基础上，考虑到提取次数在第二次以后对多糖提取影响不大，我们选取超声时间、提取温度、料液比3项为考察因素，各取3个水平，进行 正交试验设计，不考虑各因素间的相互影响。因素—水平设计如表1。 15 洛阳理工学院毕业设计(论文) 从表2的直观分析可以看出，极值R反应了3个因素对多糖提取收率的影响，即因素对收率影响顺序:料液比、超声时间、 温度，并得出该正交试验的最佳组合为,加水倍数是影响多糖提取的主要因素，加水量越大，多糖溶出就越容易，相应提取量也更大。但是加水量过大，会使提取液中多糖浓度偏低，而且会增加后续工艺中的提 取液的浓缩成本和醇沉中的酒精用量，从而提取成本也增加。我们建议采 用料液比为1:15。因此，本研究确定猴头菇多糖的最佳提取工艺为 ，即料水比为1:15，提取温度为50?，超声时间20min，这结果与单因素试验所确定条件一致。 (3)超声提取方法与传统提取方法的结果比较 根据以上的实验结果，在最佳工艺条件下提取猴头菇多糖，其中传统热水法提取条件为料液比1:15，时间2.5h，提取温度80?，提取次数 2次;超声波法提取条件为料液比1:15，时间20mi n，提取温度50?，提取 16 洛阳理工学院毕业设计(论文) 次数2次;分别测得多糖提取率结果如图5所示(n=5)。 从图5可看出，超声波法的多糖提取率明显高于传统热水法,浸提剂用量虽一样,但提取时间不到热水法的1/5，收率提高40,以上,提取过程无需高温,避免了因高温对猴头菇多糖分子结构的破坏,被浸提的生物活性在短时间内保持不变。 2.2.4 结论 (1)本研究采用比较的方法对猴头菌多糖提取工艺进行了探讨优化 了提取的工艺条件。其中传统热水提取法的最佳工艺条件为料液比1:15，时间2.5h ，提取温度80?，提取次数2次;超声波法提取猴头菇多糖的最佳工艺条件:料液比1:15，时间20min，提取温度50?，提取次数2次 在此工艺条件下与传统热水法相比，采用超声方法提取时间缩短将近4/5， 收率提高40,以上。 (2)该方法提取猴头菇多糖，简化了提取步骤，提取时间短，温度低 ，能够避免高温及长时间对多糖结构的破坏，而且多糖的提取率高，测定结果较为准确，是一种较为理想的高效、经济的多糖提取新工艺。 17 洛阳理工学院毕业设计(论文) 第3章 猴头菇多糖的提取与分离技术展望 猴头菇营养丰富，经常食用有医疗保健作用。猴头菇多糖是功能性多糖一种新来源。本研究为猴头菇多糖的利用奠定了基础，为开发猴头菇保健食品提供依据，也为建立高效、经济的多糖提取途径提供参考。 目前，猴头菇多糖的研究中存在的主要问题在于传统提取工艺提取率低、耗时久， 因此迫切需要改进提取工艺、提高产率。猴头菇多糖具有多种生物活性，其疗效已被大量实验证明， 但其作用机制还未完全弄清;猴头菇多糖的结构决定其生物活性， 目前结构方面的研究结果存在较大差异， 活性部位的研究还不透彻。 目前，新的提取工艺，如超声波辅助萃取、微波辅助萃取、超临界萃取、超滤以及膜分离等已成功用于植物有效成分的提取。特别是超声波和微波辅助萃取在提取真菌多糖方面已有很多报道，显示出传统方法无 可比拟的优势，但应用于猴头菇多糖提取的研究未见报道。因此， 这些新型技术在猴头菇多糖的提取方面具有重要的应用前景。猴头菇多糖的含量与培养方式有关，已有研究表明液态发酵工艺可增加猴头多糖的产量，但目前这方面的研究还远远不够。因此， 液态发酵工艺也是一个具有广阔前景的研究点。此外，猴头菇多糖的构效关系、量效关系及免疫作用机理是极其有意义的研究课题。 猴头菇多糖目前已制成各种药物及保健品，深受人们喜爱。猴头多糖应用前景广泛， 己吸引了越来越多。研究者的注意。进一步开展猴头菇多糖的分离纯化、结构及药理实验研究，对药物和食品开发以及猴头菇资源的利用都具有重要的意义。 18 洛阳理工学院毕业设计论文 谢 辞 非常感谢张浩玉老师指引我们的论文的写作的方向和架构，并对本论文初稿进行认真批阅，指正出其中误谬之处，使我们有了思考的方向。 谨向张浩玉老师表示崇高的敬意和衷心的感谢～谢谢张老师在我们撰写论文的过程中给与我的极大地帮助。 还有，要感谢在大学期间所有传授我们知识的老师，是你们的悉心教导使我们有了良好的专业课知识，这也是论文得以完成的基础。 感谢所有给我们帮助的老师和同学，谢谢你们～ 通过此次的论文，我们学到了很多知识，跨越了传统方式下的教与学的体制束缚，在论文的写作过程中，通过查资料和搜集有关的文献，培养了自学能力和动手能力。并且由原先的被动的接受知识转换为主动的寻求知识，这可以说是学习方法上的一个很大的突破。在以往的传统的学习模式下，我们可能会记住很多的书本知识，但是通过毕业论文，我们学会了如何将学到的知识转化为自己的东西，学会了怎么更好的处理知识和实践相结合的问题。 在论文的写作过程中也学到了做任何事情所要有的态度和心态，首先做学问要一丝不苟，对于发展过程中出现的任何问题和偏差都不要轻视，要通过正确的途径去解决，在做事情的过程中要有耐心和毅力，不要一遇到困难就达退堂鼓，只要坚持下去就可以找到思路去解决问题的。而且要学会与人合作，这样做起事情来就可以事倍功半。 总之，此次论文的写作过程，我们收获了很多，即为大学三年划上了一个完美的句号，也为将来的人生之路做好了一个很好的铺垫。 再次感谢我的大学和所有帮助过我并给我鼓励的老师，同学和朋友，谢谢你们～ 19 洛阳理工学院毕业设计论文 参考文献 ,1, 刘日新.食用菌的研究与利用.中国食用菌，1998，17(4): 5-7. ,2, 吴克，杨明.猴头菇子实体多糖的分离及成分分析.特产 研究,1998,2:32-33 ,3, 刘重芳，阙春霞.猴头多糖提取工艺优选及药效学初探. 中成药，1998，20(2):6-8. ,4, 杨炎，周晶艳，等.正交实验法提取猴头多糖的研究.食 用菌，2000，10(5):16-18. ,5, 张树海.猴头菇多糖提取及纯化的研究.食品研究与开 发，2006，27(11):103-106. ,6, 梁华，李雪林，等.猴头菇多糖提取工艺研究.食品与机 械，2006，22(1):35-38. ,7, 刑小黑，吴明忠，朱述钧，等.灵芝多糖化学研究.中国 食用菌，1996，15(3):1-16. ,8, 朱美静，童群义.猴头多糖脱蛋白方法的研究.河南工业 大学学报，2005,26(4):25-27. ,9, 周靓,蒙义文.多糖及其衍生物抗病毒作用研究进展.应 用与环境生物学报，1997，3(1):82-90( ,10, 曾凯宏，明建.真菌多糖的结构与功能.食品科技， 2001(4):65-68 ,11, 杨晓彤， 糜可，等.香菇菌丝体多糖LeBD1-1的分离纯 化和分析.微生物学报，1997,37(2):119-123. ,12, 傅博强，谢明勇，等.茶叶中多糖含量的测定.食品科学， 2001，22(11):69-71. ,13, 刘梅生，孙宏斌(猴头菌的药用价值概述.中国食用菌， 1999，18(1):24-25 ,14, 刘重芳，金若敏，等(猴头多糖提取工艺优选及药效学 初探.中成药，1998，20(2):6-8 ( 20 洛阳理工学院毕业设计论文 ,15, 侯旭杰，杨保求，等(野生巴楚蘑菇多糖提取及含量测 定.塔里木大学学报，2005，17( 2 ):25-26( ,16, 陈石良，谷文英，等(水溶性蛋白聚AP-1的分离纯化和 鉴定.无锡轻工业大学学报，2000，19(1):50-53( ,17, 刘梅森，陈海晏(猴头菌的药用价值概述.中国食用菌， 1998，18(1):24-25. ,18, 卢耀环，辛长砺，等. 猴头菇制剂生物学效应观察.山西 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It is reported that Hericium erinaceus contains more nutrients and other edible fungi cultivated at present Than are in first place, 2. Including rich in protein, fat, cellulose, polysaccharide, also contains 16 kinds of amino acids, including eight human Essential amino acids, and amino acid ratio and the human need to close, Hericium Ru delicious, and bear paws, sea cucumber, shark fin par, as China's traditional "four dishes." Hericium Erinaceus Polysaccharide is one of the most studied ingredients.A large number of medical and pharmacological research show that the monkey-head mushroom polysaccharides have increased immunity, anti-tumor, anti-aging, blood fat and other physiological functions. Hericium erinaceus polysaccharide drugs and health products made from a much-loved and development prospects. 1 Hericium Extraction, Purification 1.1 Extraction of crude Hericium The commonly used methods of Hericium Extraction of alkali formulation, hydrochloric acid, salt, there is reference to hot water extraction. Dilute acid, dilute alkali, reagent consumption, equipment are conventional instruments, so operation is simple, but dilute acid, dilute alkali conditions, easy to make polysaccharide glycosidic bond rupture occurs, some of polysaccharide hydrolysis Ershi Extraction rate reduction, and the impurity content is more, there is certainly scope of application of the same. The most common is the 22 洛阳理工学院毕业设计论文 hot water extraction method. This method is simple and relatively low impurity content. Most studies show that the fruiting bodies of Hericium the best hot water extraction process as follows: temperature 80 ?, 1:20, ethanol concentration of 90% to 95%, leaching catch time 4h, extraction 3 times. The results show that extraction rate with the extracts, extraction conditions vary. Other results show that the mycelium per lkg containing polysaccharide 13.63g, each containing fruiting bodies of Hericium lkg polysaccharide 44.36g, is 3 times the mycelium. In addition, strains, growth conditions will affect the polysaccharide, the polysaccharide content is affected by many factors. Hericium Erinaceus polysaccharide purification include removal of protein, such as bleaching and precipitation steps. According to information, removal of protein purification of polysaccharides after their higher biological activity. Therefore, to enhance its activity, while further study of polysaccharide material to provide a more pure raw materials, must be carried out on deproteinized polysaccharide processing. In addition, the darker the material to be marking, or measurement error will increase. Removal of protein can be used Sevag, trichloroacetic acid (TCA) method and enzyme method. The most common is the Sevag method, but studies have shown effects of trichloroacetic acid method better than the Sevag, H polysaccharide loss less. Comparison of enzymatic less because of high enzyme selectivity is not easy to find a suitable enzyme. However, removal of protein with the appropriate enzyme, high efficiency, complete protein removal, in foreground. Decolorizing carbon can be used, DEAE cellulose method one. Oligosaccharides, small molecules removed by dialysis. Polysaccharide classification method can be used ethanol precipitation, electrophoresis, filtration and column chromatography. Commonly used in a column chromatography with DEAE cellulose column, Sephadx column, column and so on. Purity mainly polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), high performance liquid chromatography (HPLC), thin layer chromatography (TLC), gel filtration chromatography (GPC) method. 23 洛阳理工学院毕业设计论文 2 Hericium erinaceus polysaccharide structure analysis method, nuclear magnetic resonance (NMR), MS and other methods; connection order of selection by acid hydrolysis, cis-glucosidase hydrolysis, NMR method; hydroxy substituent methylation reaction of a gas chromatograph, periodic acid oxidation, NMR, IR, MS and other methods . Sugar chain form a peptide link by acid hydrolysis, hydrazinolysis reaction. 3 Hericium the biological activity of polysaccharides 3.1 to improve anti-tumor immunity and Cancer is an important polysaccharide compounds, biological activity, with toxic side effects associated with chemotherapy drugs have synergistic effects with features. Mechanism is by increasing macrophage phagocytosis, and promote the formation of immune globulin, elevated white blood cell, lymphocyte transformation rate and improve the body's own resistance to diseases, and may increase the body radiotherapy and chemotherapy tolerance, inhibition of cancer cell growth and expansion. The results show that Hericium erinaceus polysaccharide can increase the immune function of the thymus and spleen weight, increased CY induced immunosuppression in mice white blood cell count, enhancing mouse peritoneal macrophage phagocytosis, prompted hemolysin improve hemolysin in serum levels, indicating that HEP can enhance immune function immune system. Polysaccharide isolated from fruiting bodies of Hericium can significantly enhance the cell factor L-2, significantly inhibited the growth of S180 sarcoma, both in normal and abnormal immune regulatory role, ask received proved HEPS as enhancing immune function and play a role in anti-tumor and thereby inhibit tumor cell growth and reproduction. Medium from Hericium erinaceus extract more sugar was greater than 15,000, with the obvious anti-artificial pulmonary metastatic tumor, and that the polysaccharide T cells and macrophages increase in the number. According to statistics, 134 cases with gastric cancer Hericium agent in the treatment, the total effective rate was 78.5%. Experiments show that after cancer surgery and chemotherapy Zhong who eat Hericium can enhance 24 洛阳理工学院毕业设计论文 immune function, to prolong the survival period, narrowing the mass of good results. In cancer therapy, it's not like chemotherapy kill cancer cells directly, but as a biological response modifier, to promote cellular and humoral immune response to tumor cells to suppress and eliminate the effect. Hericium erinaceus polysaccharide biological response that indirectly by inhibiting the growth of tumor cells for tumor immunotherapy approach has opened up a new way. 3.2 antiulcer In recent years, clinical research shows that effective treatment of peptic ulcer Hericium bacteria was 87.2%, total effective treatment of chronic gastritis was 96.3%, 94.4% gastric ulcer, duodenal ulcer total effective rate was 92.7%. The mechanism is Hericium amino acid and polysaccharide composition of the gastric epithelium plays an important role in regeneration and repair, can enhance the mucosal barrier function. The success of such studies show that Hericium erinaceus has a protective effect on gastric mucosa. Application of Hericium erinaceus repair damaged film gastric mucosa, increased gastric mucosal blood flow and thus enhance the defensive capabilities will help reduce the damage factor of the role, and can reduce or mitigate the submucosal infiltration of inflammatory cells. Meanwhile Hericium on the fullness, belching, heartburn, and stool occult blood, loss of appetite, etc. have good therapeutic effect. 3.3 Anti-Aging Theory that the body produces free copy of oxygen free radicals can cause lipid peroxidation, membrane damage, killer cells and changes in the joints lubricant Viscosity, and the resulting cell senescence and death. Superoxide dismutase (SOD) is a free copy of oxygen as substrate, and can remove harmful free radicals, Protect cells against oxidative damage, cell senescence. Many polysaccharides and polysaccharides of Chinese medicine studies show that the polysaccharide 25 洛阳理工学院毕业设计论文 can enhance immune function, clear Free castor seed and play the role of anti-aging. The results show that increased brain Hericium polysaccharide and liver SOD activity was significantly lower fruit flies and mice cardiac lipofuscin content, enhanced ability to fly Drosophila, has anti-aging, anti-fatigue effect. In addition, the study found that Hericium erinaceus polysaccharide can promote the Con A (Con A) activated mouse thymocytes (pre-T cells) and spleen lymphocyte proliferation, could significantly enhance the activity of lactate dehydrogenase, which the body resistance fatigue, resist disease and rehabilitation are important. 3.4 hypoglycemic Hypoglycemic activity with many important physiological functions of polysaccharides. The results show that, from fungi and other herbal extract of 80 kinds of polysaccharides can be made Animal model of high blood glucose concentrations were also significantly lower. Study found that Hericium erinaceus polysaccharide could significantly decrease the blood glucose concentration, and on serum triglycerides and total cholesterol have a significant effect of concentration; Hericium erinaceus polysaccharide is a kind of hypoglycemic activity of fungal polysaccharides. Polysaccharide with different types of small hypoglycemic diabetic mechanism. They may play a role through the following process: the specific membrane receptors, second messenger cAMP by the information transfer to take mitochondria, the activity of enzymes to improve glucose metabolism, accelerate the decomposition of glucose oxidation. 3.5 rad Hericium Erinaceus polysaccharide also has anti-microwave radiation and other functions. Hericium Erinaceus polysaccharide on mice irradiated by 815Gyv significant role in radiation protection. The protective mechanism may be related to the increase immune function, immune regulation and protection of the hematopoietic tissue. Hericium Erinaceus polysaccharide 26 洛阳理工学院毕业设计论文 may be expected to be the radiation protection drugs, it is worth further study. In addition to the role of Hericium fungus polysaccharides are Liver , stomach and spleen, antibacterial, anticoagulant, anti-leukopenia, treatment of neurasthenia, physical weakness and other diseases, reducing blood fat, anti-thrombosis, promote mouse adrenal cells and PC12 nerve neurite growth of cells, so that functions such as neurite extension. 4 Summary and Outlook At present, the Hericium erinaceus polysaccharide is the main problem existing in the traditional extraction extraction rate, time-consuming, there is an urgent need to improve the extraction process, and increase the yield. Hericium Erinaceus polysaccharide with a variety of biological activity, its efficacy has been proven by experiments, but its mechanism is not fully clear; Hericium erinaceus polysaccharide structure determine its biological activity and structural aspects of the present results are quite different, active site of the research is not thorough. At present, the new extraction process, such as ultrasonic assisted extraction, microwave assisted extraction, supercritical fluid extraction, ultrafiltration and membrane separation has been successfully used for the extraction of plant active ingredients. In particular, ultrasonic and microwave assisted extraction in the extraction of fungal polysaccharides that there are many reports show that traditional methods no Comparable to the advantages, but applied to extraction of polysaccharides from Hericium no reports. Therefore, these new technologies in Hericium erinaceus polysaccharides has important applications. Hericium erinaceus polysaccharide content and training the way, has been shown that liquid fermentation can increase the yield of polysaccharide of Hericium erinaceus, but research in this area is not enough. Therefore, the liquid fermentation is a promising research site. In addition, the Hericium erinaceus polysaccharide structure-activity relationship, dose-effect relationship and the immune 27 洛阳理工学院毕业设计论文 mechanism is extremely interesting research topic. Hericium Erinaceus polysaccharide has made all kinds of drugs and health products, is very popular. Hericium erinaceus polysaccharide widely prospect, has attracted more and more researcher's attention. Further Hericium Polysaccharides, Structure and pharmacology research, drug and food development and utilization of Hericium resources are of great significance. 猴头菇多糖研究进展 华南理工大学轻工与食品学院 樊伟伟 黄惠华 猴头菇又名猴头、猴头蘑、猴头菌、刺猬菌等，是一种大型真菌， 属担了菌纲、多孔菌目、齿菌科、猴头属， 因其了实体形状像猴了头部而得 名。据报道，猴头菌所含有的营养成分与目前人工栽培的其他食用菌 相比都居第一、二位。包括丰富的蛋白质、脂肪、纤维素、多糖，还含 有16种氨基酸，其中有八种人体 必需氨基酸，而且各种氨基酸的比例与人体需要接近，猴头茹味道鲜美， 与熊掌、海参、鱼翅齐名，为我国传统的“四大名菜”。猴头菇多糖是研究 最多的成分之一。大量的医学和药理学研究表明， 猴头菇多糖具有提高免 疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂等生理功能。猴头多糖制成的药物和保健品 深受人们喜爱，开发前景广阔。 1 猴头菇多糖提取、纯化方法 1(1 猴头菇粗多糖提取 目前常用的猴头菇多糖的提取方法有碱提法、酸提法、盐提法还有热水 浸提法。稀酸、稀碱法，试剂用量少，仪器均为常规仪器，因此操作简单易 行，但稀酸、稀碱条件下，易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解 而使多糖的提取率减少，而且杂质含量也比较多，有一定的适用范同。目前 最常用的是热水浸提法法。此法操作简单，杂质含量相对较少。多数研究表 明猴头菇子实体热水浸提的最佳工艺为:温度80? ，料液比1:20，乙醇浓度90,,95, ，浸捉时间4h，浸提次数3次。研究表明，提取率会随提取部 28 洛阳理工学院毕业设计论文 位、提取条件的不同而不同。其他实验结果表明， 每lkg菌丝体中含多糖13(63g，而每lkg猴头菇子实体中含多糖44(36g，是菌丝体的3倍 。此外， 菌种、生长条件等都会影响多糖含量， 多糖含量受多种因素影响。猴头菇多糖纯化主要包括脱蛋白、脱色和分级沉淀等步骤。据资料显示，粗多糖脱蛋白纯化以后，其生物活性更高。因此，为提高其活性，同时为进一步研究多糖提供较纯的物质原料，必须要对粗多糖进行脱蛋白处理。另外，颜色较深的材料必须脱色，否则测量时误差会增大。脱蛋白可采用Sevag、三氯乙酸(TCA)法和酶解法。目前最常用的是Sevag法，但有研究证明三氯乙酸法比Sevag效果好，H多糖损失少。酶法应用比较少， 因为酶法选择性高，不容易找到合适的酶。但用合适的酶脱蛋白效率高、蛋白脱除彻底， 应用前景广阔。脱色可采用活性炭、DEAE一纤维素法。低聚糖小分子物质采用透析法除去。多糖分级可采用乙醇分级沉淀法、电泳法、 滤法和柱层析法。常用的柱层析法有DEAE一纤维素柱，Sephadx柱、Sepharose柱等。纯度鉴定主要有聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、高效液相色谱法(HPLC)、薄板层析法(TLC)、凝胶过滤色谱(GPC)法。 2 猴头菇多糖结构分析方法 多糖分子量测定可采用HPLC、TLC、GPC、Sepharose CL一6B凝胶柱层析、质谱法(MS)等;单糖及其结构的分析主要采用酸水解法、HPLC、TLC、气象色谱(GR)、核磁共振(NMR)、MS等方法;连接次序选择酸水解、糖苷酶顺式水解、NMR法;羟基取代情况采用甲基化反应一气相色谱、过碘酸氧化、NMR、IR、MS等方法。糖链一肽链联结方式采用酸水解、肼解反应等。 3 猴头菇多糖的生物活性 3(1 提高免疫力及抗肿瘤 抗癌是多糖类化合物的重要生物活性，具有毒副作用小、与化疗药物联用有协同效应的特点。作用机理是通过增加巨噬细胞的吞噬作用，促进免疫球蛋白形成，升高白细胞，提高淋巴细胞转化率和机体本身的抗病能力，并可增强机体对放疗、化疗的耐受性，抑制癌细胞的生长和扩大。研究结果表明猴头多糖能增加免疫功能低下的小鼠的胸腺和脾重，增加CY引起的免疫功能低下的小鼠白细胞数量，增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力，促使溶血素生成，提高小鼠血清中的溶血素的含量，表明HEP能增强免疫功能低下机体 29 洛阳理工学院毕业设计论文 的免疫系统。分离得到的猴头子实体多糖，可明显增强细胞因子L一2， 显著抑制S180肉瘤的生长，对正常及异常免疫都具有调节作用， 问接证明了HEPS是因为增强免疫功能而起到抗肿瘤作用，进而抑制肿瘤细胞的生长繁殖。从猴头菌培养液中提取的多糖分了量大于15000 ，具有明显的抗人造肺转移性肿瘤作用，且该多糖能使T细胞和巨嗜细胞的数量增加。据有关资料统计，用猴头菇制剂治疗134例胃癌，总有效率为78(5, 。实验证明，癌症手术后及化疗忠者， 多吃猴头菇可增强免疫功能，达到延长患者生存期，缩小肿块的良好效果。在肿瘤治疗时，它不像一般化学药物直接杀伤肿瘤细胞，而是作为一种生物反应调节剂，促进细胞和体液免疫反应， 来达到抑制和消灭肿瘤细胞的效果。猴头多糖这种靠生物反应调节间接抑制肿瘤细胞生长的方式为肿瘤免疫治疗开辟了一条新途径。 3(2 抗溃疡 近年临床研究证明，猴头菇菌治疗消化性溃疡的有效率为87(2,，治疗慢性胃炎总有效率为96(3,，胃及溃疡94(4,，十二指肠球部溃疡总有效率为92(7,。其作用机理是猴头菌的氨基酸和多糖成分对胃黏膜上皮的再生和修复起重要作用， 能增强胃黏膜屏障机能。于成功等研究表明猴头菌对大鼠胃粘膜有保护作用。应用猴头菌片可修复损坏的胃粘膜， 增加胃粘膜血流从而增强胃粘膜的防御功能，有利于减轻损伤因子的作用，还可减少或减轻粘膜下的炎细胞浸润度。同时猴头菇对胃胀、嗳气、泛酸、大便隐血、食欲不振等均有良好的治疗作用。 3(3 抗衰老 自由摹理论认为体内产生的氧自由基能导致脂质过氧化，破坏细胞膜，杀伤细胞以及改变关节处润滑液 的粘性，并由此引起细胞衰老与死亡。超氧化物歧化酶(SOD)是以氧自由摹为底物的， 可清除有害自由基， 保护细胞免受损伤，延缓细胞衰老。众多中药多糖与真菌多糖的研究均表明，多糖能增强免疫功能、清除 自由萆而起到抗衰老作用。研究表明猴头多糖可增加小鼠脑和肝脏中SOD活力， 明显降低果蝇和小鼠心肌脂褐质含量， 增强果蝇飞翔能力， 具有抗衰老、抗疲劳作用。此外，研究发现猴头菇多糖可促进由刀豆球蛋白(Con 30 洛阳理工学院毕业设计论文 A)活化的小鼠胸腺细胞(前T细胞)和脾脏淋巴细胞的增殖， 能明显增强乳酸脱氢酶活性， 这对于机体抗疲劳、抵御疾病和康复都有重要的意义。 3(4 降血糖 具有降血糖活性是许多多糖的重要生理功能。研究表明，从真菌及其他中草药中提取的80余种多糖都可使 高血糖实验动物模型的血糖浓度明显降低。研究发现猴头菇多糖能明显降低血糖浓度，且对血清中甘油三酸酯和总胆固醇含量都有明显的作用效果;猴头菌多糖是一种具有降血糖活性的真菌多糖。小同多糖针对不同类型糖尿病降血糖机制不同。它们可能通过以下过程发挥作用:与细胞膜上的特定受体结合，通过第二信使cAMP将信息传拿线粒体，提高糖代谢酶系的活性，加速糖的氧化分解。 3(5 抗辐射 猴头菇多糖还具有抗微波辐射等功能。猴头菇多糖对受815Gyv射线照射小鼠有明显的辐射防护作用。其防护作用机制可能是与其提高机体免疫功能，增强免疫调节和保护造血组织有关。猴头菇多糖可能有望成为辐射防护药物，值得作进一步研究。此外，除上述作用， 猴头菌属真菌多糖还有保肝护肝、健胃益脾、抑菌、抗凝血、抗白细胞下降，治疗神经衰弱、身体虚弱等疾病、降血脂、抗血栓、促进小鼠肾上腺神经细胞及PC12神经突细胞的生长、使神经突外延等功能。 4 小结与展望 目前，猴头菇多糖的研究中存在的主要问题在于传统提取工艺提取率低、耗时久， 因此迫切需要改进提取工艺、提高产率。猴头菇多糖具有多种生物活性，其疗效已被大量实验证明， 但其作用机制还未完全弄清;猴头菇多糖的结构决定其生物活性， 目前结构方面的研究结果存在较大差异， 活性部位的研究还不透彻。 目前，新的提取工艺，如超声波辅助萃取、微波辅助萃取、超临界萃取、超滤以及膜分离等已成功用于植物有效成分的提取。特别是超声波和微波辅助萃取在提取真菌多糖方面已有很多报道，显示出传统方法无 可比拟的优势，但应用于猴头菇多糖提取的研究未见报道。因此， 这些新型技术在猴头菇多糖的提取方面具有重要的应用前景。猴头菇多糖的含 31 洛阳理工学院毕业设计论文 量与培养方式有关，已有研究表明液态发酵工艺可增加猴头多糖的产量，但目前这方面的研究还远远不够。因此， 液态发酵工艺也是一个具有广阔前景的研究点。此外，猴头菇多糖的构效关系、量效关系及免疫作用机理是极其有意义的研究课题。 猴头菇多糖目前已制成各种药物及保健品，深受人们喜爱。猴头多糖应用前景广泛， 己吸引了越来越多。研究者的注意。进一步开展猴头菇多糖的分离纯化、结构及药理实验研究，对药物和食品开发以及猴头菇资源的利用都具有重要的意义。 32