白灵菇rDNAITS序列多态性分析

白灵菇rDNAITS序列多态性分析 第26 卷 第8 Vol.26 No.8 常 熟 理 工 学 院 学 报 ( 自 然 科 学 ) 2012 年8 月 Aug.,2012 Journal of Changshu Institute Technology (Natural Sciences ) 白 灵 菇 r D N A - I T S 序 列 多 态 性 分 析 常 金 芳 , 郁 建 锋 , 冀 宏 ( 常 熟 理 工 学 院 生 物 与 食 品 工 程 学 院 , 江 苏 常 熟 215500 ) 摘 要 : 为 了 研 究10 个 不 同 来 源 的 白 灵 菇 品 种 亲 缘 关 系 , 采 用 内 转 录 间 隔 区 (ITS ) 序 列 分 析 技 术 , 系 统 分 析 了 不 同 地 区 白 灵 菇ITS 的 多 态 性. 用ClustalX 、MEGA4 等 软 件 分 析 结 果 显 示 ,10 个 不 同 来 源 的 白 灵 菇 具 有 很 近 的 亲 缘 关 系 , 其 中 有9 个 品 种 的 同 源 性 高 达98.5 % , 其 可 能 来 自 同 一 品 系 , 而 另 一 个 品 种 与 其 他9 个 差 异 较 大 , 此 可 能 来 自 其 他 品 系 或 是 一 株 突 变 品 种. 关 键 词 : 白 灵 菇 ;rDNA-ITS 序 列 ; 亲 缘 关 系 中 图 分 类 号 :Q933 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1008-2794 (2012 )08-0061-05 [1] 白 灵 菇 属 于 真 菌 门 、 担 子 菌 纲 、 伞 菌 目 、 侧 耳 科 、 侧 耳 属 , 为 掌 状 白 阿 魏 菇 , 卯 晓 岚 将 其 命 名 为Pleurotus nebrodensi ( s Lnzengae )Quel. 野 生 白 灵 菇 在 中 国 仅 分 布 于 新 疆 地 区 , 其 形 状 似 灵 芝 , 菇 体 为 纯 白 色 , 肉 质 细 腻 , [2] 味 道 鲜 美 , 朵 型 适 中 , 口 感 特 佳 , 是 一 种 名 贵 食 ( 药 ) 用 真 菌研 究 发 现 , 白 灵 菇 具 有 防 治 老 年 人 心 血 管 疾 病 、 [3] [4-5] 防 癌 抗 癌 等 药 用 功 效白 灵 菇 含 有 多 种 营 养 成 分 , 能 调 节 机 体 生 理 平 衡 、 增 强 人 体 免 疫 功 能 , 享 有 “ 西 天 白 灵 芝 ” 、 “ 天 山 神 菇 ” 之 美 誉 , 深 受 国 内 外 消 费 者 的 青 睐 , 有 广 阔 的 开 发 前 景. Internal transcribed space ( r ITS ) 序 列 进 化 速 率 较 快 且 片 段 长 度 适 中 ( 高 等 真 菌 一 般 小 于1000 bp ) , 加 上 协 同 进 化 , 使 得 其 在 基 因 组 中 不 同 重 复 单 元 间 十 分 一 致 , 成 为 高 等 真 菌 属 内 种 间 及 种 群 系 统 学 研 究 的 基 因 [6] 标 记ITS1 和ITS2 是 中 度 保 守 区 域 , 其 保 守 性 基 本 上 表 现 为 种 内 相 对 一 致 , 种 间 差 异 较 为 明 显. 这 种 特 点 [7-9] 使ITS 适 合 于 真 菌 物 种 的 分 子 鉴 定 及 属 内 物 种 间 或 种 内 差 异 较 明 显 的 菌 群 间 的 系 统 发 育 关 系 分 析目 前 [10] 已 被 广 泛 应 用 于 真 菌 属 内 不 同 种 间 或 近 似 属 间 的 系 统 发 育 研 究 中目 前 , 白 灵 菇 迅 速 走 俏 市 场 , 其 栽 培 规 模 也 日 益 扩 大 , 但 由 于 命 名 的 随 意 性 , 生 产 中 同 种 异 名 和 同 名 异 种 现 象 严 重 , 导 致 白 灵 菇 栽 培 菌 株 混 乱 , 影 响 了 产 业 的 良 性 发 展. 通 过 对10 种 不 同 生 产 区 域 来 源 的 白 灵 菇ITS 序 列 进 行 分 析 , 探 讨 其 种 内 和 种 间 的 遗 传 变 异 , 为 白 灵 菇 种 质 鉴 定 及 培 育 和 优 产 奠 定 基 础 , 提 供 基 础 保 障. 1 材 料 与 方 法 1.1 菌 种 分 别 从 国 内 不 同 区 域 的 市 场 菌 种 销 售 机 构 购 买 了 北 京 吉 蕈 天 山1 号 、 河 北 武 安 天 山2 号 、 北 京 吉 蕈 农 大 白 灵 菇2 号 、 江 都 天 达 白 灵 菇2 号 、 福 建 龙 海 白 灵 菇 、 河 南 郑 州 白 灵 菇3 、 高 邮 白 灵 菇1 号 、 北 京 吉 蕈 高 温 白 灵 收 稿 日 期 :2012-06-16 基 金 项 目 : 常 熟 市 农 业 科 技 项 目 “ ‘ 村 企 挂 钩 ’ 食 用 菌 设 施 农 业 标 准 化 高 效 栽 培 技 术 集 成 与 示 范 ” (CN201001 ) ; 苏 州 市 应 用 基 础 研 究 项 目 “ 白 灵 菇 种 质 资 源 评 价 及 其 工 厂 化 栽 培 良 种 选 育 ” (SYN201007 ) ; 江 苏 省 科 技 支 撑 计 划 项 目 “ 食 用 菌 低 碳 高 效 生 产 技 术 体 系 建 设 与 示 范 ” (BE2011456 ) 作 者 简 介 : 常 金 芳 (1990 ? ) , 女 , 江 苏 盐 城 人 , 生 物 工 程 专 业2008 级 本 科 生. 通 讯 作 者 : 冀 宏 (1969 ? ) , 男 , 河 北 保 定 人 , 教 授 , 博 士 , 研 究 方 向 : 食 、 药 用 真 菌 工 程 技 术 ,E-mail :jihong@//0>.. 常 熟 理 工 学 院 学 报 ( 自 然 科 学 ) 2012 年 6622 菇 、 北 京 吉 蕈 京 白 灵 菇 、 高 邮 白 灵 菇2 号 等10 个 不 同 命 名 的 白 灵 菇 菌 种. 1.2 方 法 1.2.1 白 灵 菇 菌 丝 体 培 养 3 将10 个 不 同 命 名 的 白 灵 菇 菌 种 在PDA 固 体 培 养 基 上 活 化 培 养7 d 后 , 接 种 约0.1 cm 大 小 的 菌 种 块 于100 [11] mL 的PDA 液 体 培 养 基 ,25 ? 静 置2 d 后 ,180 r/min 继 续 振 荡 培 养7 d收 集 菌 丝 体 , 并 保 存 于-70 ? 冰 箱. 1.2.2 CTAB 法 提 取 基 因 组DNA [12] [13] 参 照Guo 等 和Saghai 等 的 方 法 , 将 上 述 操 作 收 集 到 的 菌 丝 体 ( 湿 重 约0.6 g ) 置 于 陶 瓷 研 钵 中 , 加 入 适 量 的 液 氮 进 行 研 磨 , 将 研 磨 得 到 的 粉 末 转 移 到 1.5 mL EP 管 中 , 加 入 700 μL 裂 解 缓 冲 液 (0.1 mol/L Tris-Hcl ,pH 8.0 ;0.02 mol/L EDTA ,pH 8.0 ;1.4 mol/L NaCl ;2 % CTAB ) , 置 于65 ? 水 浴 消 化3~4 h. 然 后 以 酚 、 氯 仿 抽 提 法 获 得 白 灵 菇 的 基 因 组DNA , 于-70 ? 保 存. 1.2.3 PCR 扩 增ITS 片 段 [10-11] ITS 引 物 ITS1 :5 ′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ′ ;ITS4 :5 ′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ′PCR 扩 增 100 μL 体 系 :70 μL ddH O ,10 μL 10×PCR buffer ,8 μL dNTP (2.5 mmol/L each ) ,ITS1/ITS4 (10 2 pmol/L ) 各2 μL ;5 ng DNA 模 板 ;1 μL Taq 酶 (5 U/ μL ). PCR 扩 增 程 序 :94 ? 预 变 性3 min ,94 ? 变 性45 s ,58 ? 退 火45 s ,72 ? 延 伸1 min , 共35 个 循 环 , 最 后72 ? 延 伸10 min. 1 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 , 并 克 隆 入pMD 18-T Vector , 送 至 上 海 桑 尼 生 物 科 技 有 限 公 司 测 序. 1.3 数 据 分 析 [14,16-17] 利 用Clustal X 软 件 和MEGA4.1 软 件 对 所 获 得 的10 个 白 灵 菇ITS 序 列 进 行 分 析采 用 最 大 简 约 法 , 构 建 系 统 树 , 自 展 次 数 为1000 次. 2 结 果 2.1 ITS 目 的 片 段 的 扩 增 以 引 物ITS1 和ITS4 扩 增 了10 个 白 灵 菇 品 种 的ITS 片 段 , 从 图1 可 以 看 出 供 试 菌 株 扩 增 出 来 的ITS 片 段 约 在680 bp 左 右 , 而 北 京 吉 蕈 农 大 白 灵2 号 的PCR 条 带 明 显 短 于 其 余9 个 品 种 , 基 本 与 预 期 设 计 的 片 段 大 小 相 一 致. 2.2 ITS 序 列 分 析 对10 个 白 灵 菇 菌 种 的ITS 序 列 对 比 分 析 ( 见 图2 ) , 结 果 显 示 , 北 京 吉 蕈 天 山1 号 、 河 北 武 安 天 山2 号 、 江 都 M :Marker 为DL-2000 ; 天 达 白 灵 菇2 号 、 河 南 郑 州 白 灵 菇3 、 北 京 吉 蕈 京 白 灵 1. 北 京 吉 蕈 天 山1 号 ,2. 河 北 武 安 天 山2 号 ,3. 北 京 吉 菇 和 高 邮 白 灵 菇1 号 的ITS 序 列 是 相 同 的 ; 福 建 龙 海 白 蕈 农 大 白 灵 菇2 号 ,4. 江 都 天 达 白 灵 菇2 号 ,5. 福 建 龙 海 白 灵 菇 与 北 京 吉 蕈 高 温 白 灵 菇 菌 株 的ITS 序 列 是 相 同 灵 菇 ,6. 河 南 郑 州 白 灵 菇3 ,7. 高 邮 白 灵 菇2 号 ,8. 北 京 吉 的. 高 邮 白 灵 菇2 号 的ITS 序 列 在 第428 个 碱 基 处 较 其 蕈 高 温 白 灵 菇 ,9. 北 京 吉 蕈 京 白 灵 菇 ,10. 高 邮 白 灵 菇1 号. 图 1 白 灵 菇 I T S P C R 产 物 的 1 % 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 结 果 他 白 灵 菇 的 多 插 入 了1 个 碱 基 ; 北 京 吉 蕈 农 大 白 灵 菇2 [15] 号 的ITS 序 列 与 其 余9 个 菌 种 的 差 异 性 较 大 , 存 在 较 多 的 序 列 缺 失2.3 系 统 发 育 分 析 2.3.1 10 个 白 灵 菇 品 种 的 遗 传 距 离 利 用MEGA4.1 软 件 对10 个 白 灵 菇 的ITS 序 列 进 行 遗 传 关 系 分 析 , 结 果 显 示 ( 见 表1 ) , 北 京 吉 蕈 天 山1 号 、 河 北 武 安 天 山2 号 、 北 京 吉 蕈 京 白 灵 菇 、 高 邮 白 灵 菇1 号 、 高 邮 白 灵 菇2 号 、 河 南 郑 州 白 灵 菇3 和 江 都 天 达 白 灵 菇2 号 两 两 之 间 的 遗 传 距 离 都 为0.000 , 福 建 龙 海 白 灵 菇 和 北 京 吉 蕈 高 温 白 灵 菇 与 以 上7 个 品 种 之 间 的 遗 传 距 离 也 只 有0.007 , 说 明 这9 个 品 种 的 白 灵 菇 在ITS 区 的 变 异 积 累 并 不 明 显. 北 京 吉 蕈 农 大 白 灵 菇2 号 与常 金 芳 , 郁 建 锋 , 冀 宏 : 白 灵 菇rDNA-ITS 序 列 多 态 性 分 析 8 63 1. 北 京 吉 蕈 天 山1 号 ,2. 河 北 武 安 天 山2 号 ,3. 北 京 吉 蕈 农 大 白 灵 菇2 号 ,4. 江 都 天 达 白 灵 菇2 号 ,5. 福 建 龙 海 白 灵 菇 ,6. 河 南 郑 州 白 灵 菇3 ,7. 高 邮 白 灵 菇2 号 ,8. 北 京 吉 蕈 高 温 白 灵 菇 ,9. 北 京 吉 蕈 京 白 灵 菇 ,10. 高 邮 白 灵 菇1 号 注 : 图 中 阴 影 部 分 为 不 同 碱 基 , “- ” : 无 碱 基 图 2 1 0 个 白 灵 菇 品 种 的 I T S 区 域 序 列 对 比 结 果常 熟 理 工 学 院 学 报 ( 自 然 科 学 ) 2012 年 6644 表 1 以 I T S 序 列 获 得 的 1 0 个 白 灵 菇 遗 传 距 离 结 果 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 北 京 吉 蕈 天 山1 号 河 北 武 安 天 山2 号 0.000 北 京 吉 蕈 京 白 灵 菇 0.000 0.000 高 邮 白 灵 菇1 号 0.000 0.000 0.000 高 邮 白 灵 菇2 号 0.000 0.000 0.000 0.000 河 南 郑 州 白 灵 菇3 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 江 都 天 达 白 灵 菇2 号 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 福 建 龙 海 白 灵 菇 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 北 京 吉 蕈 高 温 白 灵 菇 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.007 0.000 北 京 吉 蕈 农 大 白 灵 菇2 号 4.337 4.337 4.337 4.337 4.337 4.337 4.337 4.101 4.101 其 余9 个 品 种 的 遗 传 距 离 较 大 , 为4.337 , 推 断 其 与 其 他 白 灵 菇 的 来 源 可 能 有 所 不 同. 2.3.2 系 统 进 化 树 利 用CLUSTALX1.83 、MEG4 软 件 , 以 供 试 白 灵 菇 菌 株 的ITS 序 列 构 建 其 分 子 进 化 树 , 进 一 步 分 析10 个 白 灵 菇 之 间 的 亲 缘 关 系. 结 果 分 析 ( 图3 ) 显 示 ,10 个 白 灵 菇 品 种 分 为3 大 分 支 , 北 京 吉 蕈 天 山1 号 、 河 北 武 安 天 山2 号 、 北 京 吉 蕈 京 白 灵 菇 、 高 邮 白 灵 菇1 号 、 高 邮 白 灵 菇2 号 、 河 注 : 分 支 上 数 值 为Bootstroop 值 南 郑 州 白 灵 菇3 和 江 都 天 达 白 灵 菇2 号 图 3 基 于 I T S 序 列 分 析 构 建 的 最 简 约 系 统 树 聚 类 于 同 一 个 分 支 , 它 们 之 间 的 自 展 支 持 率 为91 % , 大 于70 %. 而 福 建 龙 海 白 灵 菇 和 北 京 吉 蕈 高 温 白 灵 菇 在 同 一 个 分 支 上 , 它 们 之 间 的 自 展 支 持 率 为88 % , 也 大 于70 % , 而 后 这2 个 分 支 聚 类 形 成 一 个 大 的 分 支. 北 京 吉 蕈 农 大 白 灵 菇2 号 单 独 形 成 一 分 支 , 也 说 明 其 与 其 他9 个 品 种 白 灵 菇 的ITS 发 生 了 变 异 积 累. 3 讨 论 本 文 对 所 克 隆 的10 个 来 自 不 同 地 区 的 白 灵 菇 的ITS 序 列 进 行 了 遗 传 分 析 , 并 构 建 了 其 系 统 发 育 树. 以 北 京 吉 蕈 天 山1 号 、 河 北 武 安 天 山2 号 之 间 的 遗 传 距 离 为0.000 , 在 聚 类 分 析 中 其 也 在 同 一 分 支 上 , 福 建 龙 海 白 灵 菇 、 北 京 吉 蕈 高 温 白 灵 菇 之 间 的 遗 传 距 离 为0.000 , 且 自 展 支 持 率 为88 % , 与 以 上7 个 白 灵 菇 品 种 的 遗 传 距 离 也 只 有0.007 , 推 测 这9 个 品 种 可 能 来 自 于 同 一 品 系 , 也 有 可 能 这9 个 品 种 的 白 灵 菇ITS 序 列 并 没 有 达 到 亚 种 的 遗 传 变 异 积 累. 而 北 京 吉 蕈 农 大 白 灵 菇2 号 与 其 余9 个 品 种 的 遗 传 距 离 为4.337 左 右 , 在 聚 类 分 析 中 单 独 形 成 一 分 支 , 推 断 其 可 能 来 源 于 其 他 品 系 或 是 产 生 的 新 突 变 株. ITS 区 域 的 基 因 序 列 进 化 速 率 较 快 , 且 在 基 因 组 中 不 同 重 复 单 元 之 间 基 本 一 致 , 现 为 高 等 真 菌 属 种 内 及 [18-19] 种 群 系 统 学 研 究 的 基 因 标 记 之 一对10 个 来 自 不 同 地 区 的 白 灵 菇ITS 序 列 分 析 结 果 表 明 , 只 有 北 京 吉 蕈 农 大 白 灵 菇2 号 与 其 他 的 差 异 较 大 , 而 其 余 的 差 异 不 明 显. 这 说 明 此9 个 白 灵 菇 品 种 可 能 来 自 同 一 品 系 的 栽 培 种 , 也 可 能 是ITS 序 列 分 析 还 不 能 十 分 精 确 地 反 映 出 这9 个 白 灵 菇 之 间 的 差 异. 因 为ITS 序 列 作 为 分 子 标 记 应 用 技 术 的 最 大 限 制 是 有 的 真 菌 由 于 进 化 顺 序 、 变 异 、 甚 至 分 析 方 法 等 原 因 , 在 间 隔 区 上 表 现 的 差 异 性 较 [10 ,20] 小 , 作 为 属 内 种 及 种 群 的 标 记 存 在 着 一 定 的 不 足此 研 究 结 果 虽 然 为 白 灵 菇 的 种 内 关 系 的 研 究 提 供 了 重 要