引物合成常见问题分析

引物合成常见问题 引物合成常见问题分析 1(需要合成多少OD的oligo, 一般来说，20BP 2 OD引物可以做400-500次50ulPCR反应，以及 2000—2500 次的测序反应。因此，2 OD 的DNA 量足以进行一般的实验工作。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了，无论是 PAGE 纯化，还是 HPLC 纯化，增大每次的纯化量会大大降低制品的纯度。所以，为了保证制品质量，我们一般把每次的纯化量控制在 2 OD 左右。 如何测定引物的OD值: DNA的量与260nm处的吸光度值(OD值)成正比，因此使用紫外分光光度计定量是最科学的，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。进行OD值测定时，分光光度计上显示的数值为每毫升溶液中的OD值。 例如:您拿到一管引物DNA干粉，用1ml水溶解成母液。取该母液50μL稀释成1ml，在1ml标准比色杯中测定其吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。 2. 如何检测Oligo DNA的纯度, 实验室检测时比较方便的作法是进行PAGE凝胶电泳。一般用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳即可，小于12bp的短链使用20% 的凝胶，大于60bp的引物使用12% 的凝胶。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95?,2mins)。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染色。 使用3%的Agarose凝胶电泳合成的 Oligo DNA 制品，为什么有很多条带, 由于Oligo DNA 是单链 DNA ，容易形成复杂的立体结构，因此进行 Agarose 电泳时，容易出现多条泳带(更不能用 Agarose 电泳来进行定量了)。Oligo DNA 的电泳一定要使用变性 PAGE 电泳，Agarose电泳对于小单链的DNA引物的区分度不够。而且，用荧光TLC板在紫外灯下观察，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染色。 4. 琼脂糖电泳后进行EB染色发现条带很弱，是Oligo DNA的量不够么, EB是通过嵌合到核酸的双螺旋结构中而使其显色的，而合成DNA是单链的，只有通过形成局部发夹结构或其它双螺旋结构的时候才能被染色。不同的引物由于 碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异。比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测，或用上面说的PAGE凝胶电泳用荧光TLC板在紫外灯下观察，也可以用银染的方法。 5. 进行PAGE 电泳时，长度完全一样的 Oligo DNA 为什么泳带不在同一位置 ? ?A 、G 、C 、T 的组份不同，电泳速度不同; ? DNA 的立体结构不同，电泳速度不同; 这种情况在 Oligo DNA 越短时越容易发生，长链 Oligo DNA 之间差别较小。 6. 合成的引物PCR后无目的条带是什么原因 PCR 反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。 ? 引物和模板是否匹配 ; ? 引物本身是否有立体结构，或者二条引物之间是否形成高级结构; ? PCR 反应用试剂是否正常; ? PCR 仪是否工作正常 ; ? PCR 反应条件是否合适 ; ?引物设计是否有问题; 如果一切正常，还无法解决问题时，可能是引物合成的问题，我们可以免费重新合成引物，再次合成还不成功就有可能不是引物的问题啦(合成两次都不成功的要收一次费用)。 7. 测定了Oligo DNA的OD值后发现A260/A280<1.8，制品质量(纯度)合格吗? 有的老师问:引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染,其实引物化学合成，是没有机会蛋白质污染的。Oligo DNA和一般提取的双链DNA不同，A260/A280的比值不能准确衡量Oligo DNA制品的质量，该比值依赖于序列中的各种碱基的组份，比值过低一般是由于引物中C/T 的含量较高所致。下面是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。 8.Oligo DNA定量不准是怎么回事儿, 我们偶尔收到用户投诉定量不准的，出现这种情况的可能性有:(1)生产人员定量错误。这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数。(2)引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。这种情况很少见。(3)系统误差，我们认为10%左右为允许误差。使用过程中，引物 工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。(4)用户没有能够正确理解引物OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定;或者用户没有将OD读数，正确地转换成母液中的OD数。这种情况比较常见。(5)用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。 Oligo DNA溶解后发现有少许沉淀，会影响实验结果吗? Oligo DNA制品PAGE纯化后要使用C18柱进行吸附，偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果，请稍许离心后取上清使用即可。 三博公司的 Oligo DNA 制品包装中为什么不提供电泳照片 ? 做过 Oligo DNA PAGE 电泳的人员都知道，用EtBr 等染色剂染色时，同一 OD 量的不同序列的 DNA 制品电泳时的泳带亮度(清晰度)是不一样的。原因在于 EtBr 等染色剂的染色是渗透至 DNA 的双链之间的，而合成的 Oligo DNA 是单链， Oligo DNA 自身形成的立体结构越复杂，EtBr 的染色就越容易， DNA 带也就越亮。相反，有一些 Oligo DNA 由于不形成立体结构，根本就不为 EtBr 所染色。因此，我们认为有些公司对所有产品都提供黑地亮带，而且差不多一样亮的电泳照片是不符合事实的。三博公司的每一条引物在出货之前都要进行严格的电泳检测，拿出1/10 OD的引物来鉴定，在荧光玻璃下面看到白地黑色条带，带形一致没有杂带，有杂带的引物是绝不会发货的，而在荧光玻璃上面照像比较困难，且不美观，所以不好给顾客提供像片。但请您放心三博的质量是您值得信赖的。 PCR 产物经克隆后测序发现引物处的碱基有错误，为什么 ?怎么办 ? 三博远志总结出了以下一些原因，仅供参考: ?PCR 过程的错配; ?克隆过程的突变; ?化学合成过程中，未知的错误;应该说，上述这些情况发生的可能性都极低。然而，合成的 DNA 链越长，发生这种情况的机率也就越大。 ?概率问题，因为引物纯度不可能是 100% ，样品的纯度也不是100%，因此挑选克隆时，有可能挑选了杂质引物扩增出的 PCR 产物做了克隆。 因此，请重新挑选克隆测序，也许结果会变好。根据我们的经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了;40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。 如果挑选 2 -3 个克隆测序情况还没改观，我们会免费重新合成引物。不过重合的引物和第一次的引物一样，还有可能错误。如果还不行可以考虑重设引物，提高样品的纯度上下功夫。总之，实验有时候就是这么不顺利，不要怨天忧人，运气不好生气也没用，还不如心平气和呢, 如果测序发现引物突变，是否有补偿, 我们可以免费重合一次引物，没有其他补偿或赔偿，不能承担其他连带责任，这是国际行规。原因我们在前面已提到，化学合成准确率(或纯度)不可能达到 100%，客户样品的纯度关系也很大，我们总结使用引物错误的概率有1,左右，关于这方面的信息在每个产品说明书里都有事先说明。 进行蛋白表达实验数个月不成功，后经测序发现引物处有错误，怎么办 ? ? 表达实验之前一定要对 DNA 序列进行验证，这是实验的常识; ? 我们可以免费重新合成引物; ? 如进行索赔时，按国际行业惯例，索赔范围限于制品价格范围之内。 14. 如何提高引物的纯度,怎样才能保证 Oligo DNA 的正确性, ? 合成 Oligo DNA 时，选用高纯度级制品; ? 避免使用大于50mer 的长链 Oligo DNA ，最好选用小于 35mer 的合成 DNA 制品。不要超过2OD，60个碱基以上最好不超1OD，国内有一个不好的现象，长链引物要的量都比较大，导致割的条带比较宽，建议您减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些; ? 进行克隆实验时，每次克隆都须进行测序验证，以保证序列的正确性，然后再进行进一步实验，进行蛋白表达实验时，尤其需要注意。 Oligo DNA 最长可以合成多少个碱基 ? 引物越长，出现问题的概率就越大。以每步反应效率为 99% 进行计算，粗略计算合成到 100 个碱基时，目的 DNA 片段的比例便为 0 。 但有些厂家曾报道合成了 150mer 的Oligo DNA片段。三博公司也曾合成过120mer左右的Oligo DNA 制品。但根据我们的经验，要想保证合成DNA 的碱基 90% 正确， 80mer以上要想保证一个碱基都不错就Oligo DNA的长度最好不要超过70mer， 非常危险了，须十分注意。 16. 一般的合成 Oligo DNA 的 5‘ 和 3‘ 末端有磷酸基团吗 ? 没有磷酸基团， 5‘ 和 3‘ 末端均为 - OH 基。如需要加磷酸基团，订货时请特别注明，此时需收取磷酸化的费用。 Oligo DNA片段退火后不能连接到载体上是什么原因, 连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。 平端的 PCR 产物难以克隆，为什么 ? 由于一般的 PCR 用引物的 5‘ 末端都没有 P ，因此，扩增后的 PCR 产物的 5‘ 末端也没有 P 。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去;而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会极高。此时请对 PCR 产物的 5‘ 端进行磷酸 (P) 化处理。 如何将两条互补的单链退火形成双链, 用退火缓冲液(10 mM Tris pH=8.0，50 mM NaCl, 1 mM EDTA)溶解引物，浓度:1,5 OD/100μl。将二条链等摩尔混合。94?保温5分钟后，冷却至室温，4?保存供实验使用。 20. 进行反义 DNA (Antisense DNA) 实验时，是否要对 DNA 链全部进行 S 化修饰 ? DNA 经 S 化修饰后比较稳定，在细胞中不会被核酸酶等分解。如果整条链全部修饰成 S 化 DNA ，的确能增加 DNA 的稳定性，但此时会降低 DNA 和目的模板结合的效率。 因此，现在一般的科研人员通常采用将 DNA 片段两端的数个碱基进行 S 化修饰，这样既能取得保护 DNA 的效果，又能增加 Antisense DNA 和目的模板的结合能力。 即使如此，现在还是有很多科研人员采用了全部 S 化的修饰方法，并且能得到非常良好的实验结果。因此，任何一项科研工作都不是绝对的，应根据具体情况设计实验。 21. Biotin标记有三种，它们之间有何不同, ss-Biotin可提供比较长的连接臂(臂长约24.3A)，有利于Biotin与Avidin间的结合，而且分子中含有S-S键，可使用还原剂(50 mM DTT或100 mM 巯基乙醇)方便地将探针分子(不再带有Biotin基团)与靶序列分开。Imino-Biotin可提供较短的连接臂(约13.5A)，其最大特点是Biotin与Avidin的分离可在较温和的条件下进行:8M盐酸胍(pH4.0)。普通的Biotin提供与ss-Biotin相似长度的连接臂，但只能用8M盐酸胍(pH1.5)分离Biotin与Avidin. 22. FITC、6-FAM、5-FAM标记之间有何区别, 他们都是荧光素标记(Fluorescein)，三者结构间的区别如下: 从结构图可见，5-FAM与6-FAM互为异构体:而FITC则在与oligo的连接方式上(硫脲键)有别于前者(酰胺键)，但它们的发色团均为荧光素，通常使用中没有区别。 23. 淬灭基团为TAMRA或ECLIPSE的双标记荧光探针在使用上有什么不同? 由淬灭基团TAMRA或ECLIPSE组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(Hydrolysis Probes)，或称“TaqMan”探针，用于Real-time PCR实验。由于TAMRA与ECLIPSE光谱学性质不同(见下图)，作为淬灭基团使用时的特点也不同，现说明如下: 加图1、2 ? TAMRA为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，自身会在更高波长处发射荧光，此发荧光会对报告基团的检测造成影响，探针荧光本底相对较高。而ECLIPSE为非荧光染料，淬灭报告基团，但自身不发射荧光，因此，探针荧光本底低，信噪比更大，检测灵敏度更高。 ? 淬灭基团对报告基团的淬灭有赖于二者的光谱交盖(Overlapping)，也即报告基团的荧光波长应落在淬灭基团的吸收光谱波长范围内。对比TAMRA与ECLIPSE的吸收光谱可见，TAMRA的吸收光谱波长范围窄，与之可匹配的报告基团种类比较少，而ECLIPSE具有更宽的吸收波长范围(390nm-625nm)，可淬灭的报告基团种类很多(FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可)，用于多重PCR (Multiplexing PCR)时可有多种选择，因此淬灭基团为ECLIPSE的双标记荧光探针更适合于多重PCR。 24. TaqMan 探针设计时应遵循哪些原则, ?探针应位于两引物之间; ?探针中碱基G、C的含量应在20%,80%之间; ?避免同种碱基成串出现，特别是碱基“G”; ?碱基G不要出现在5′末端; ?探针的Tm值要比引物的Tm值高8-10?，应在68-70?之间; ?探针长度超过30个碱基时，最好把淬灭基团放在中间，以防止荧光本底过高，这时探针的3′末端应加磷酸基封阻，以防探针延伸。