苹果霉菌和酵母菌的分离与纯化

苹果霉菌和酵母菌的分离与纯化 苹果霉菌和酵母菌的分离和纯化 摘要:从酸败腐烂的苹果上挑取霉变物用马丁氏培养基28摄氏度培养2-3天，分离出几个真菌菌株;挑取霉变物用沙堡琼脂培养基37摄氏度培养2-3天将分离菌株重新进行涂布平板，分离出酵母菌菌。挑取马丁氏培养基单菌落表面的少许孢子继续用马丁氏培养基培养，经28摄氏度培养2-3天于低倍镜下观察，通过菌丝和孢子对分离株进行鉴定。观察到簇生在分生孢子梗的顶端的呈扫帚状分枝的分生孢子1和有隔菌丝，可鉴定为霉菌;挑取沙堡琼 用沙堡琼脂培养基培养，经37摄氏度培养2-3天于低脂培养基单菌落表面的少许孢子继续 倍镜下观察观察到单细胞的芽殖孢子，并通过进一步的酵母菌生理生化测定，可鉴定为酵母菌。 关键词:真菌;菌落;菌丝;孢子 前言:真菌一词来源于拉丁文的“蘑菇”，现在真菌这一名词的概念不仅包括蘑菇，而是代表着一个相当大的生物类群。什么是真菌,从生物学观点来看，它们是一大类真核微生物，无根茎叶，不含叶绿素，不能利用无机物来制造食物，靠寄生或腐生生活，仅少数为单细胞，其余为多细胞，大多数真菌有分枝或不分枝的丝状体，能进行有性生殖和无性生殖。从形态上分为酵母菌、霉菌、担子菌。 真菌不仅种类多，数量大，而且分布极为广泛，与人类生产与生活有着密切的关系。有些菌丝可引起人与畜禽疾病，有些霉菌还产生霉素，直接或间接的危害人类健康。因此，了解真菌的培养方法，认识其形态十分重要。近年来在真菌分类方面趋向于采用Anisworth或者bisby的《真菌学辞典》介绍的分类系统。该系统认为真菌不属于低等植物，而是属于单独成立的真菌界，以下分为黏菌门和真菌门。本研究从苹果中分离出几株真菌，并用真菌分类方法对其进行鉴定。 研究意义:让小组成员进一步掌握微生物分离纯化的试验方法和技术。了解霉变苹果的微生物分布特点，种类组成，数量及优势类群等。对所分离菌株进行简单的生物学、生理学特性研究。进一步了解霉菌对我们生活的影响 1材料与方法 1.1实验材料与器材 1.1.1材料 酸败腐烂的苹果 1.1.2器材 无菌室、手提式高压蒸汽灭菌锅、电炉、天平、铁架台、灭菌培养皿、锥形瓶、漏斗、试管、烧杯、胶头滴管、石蕊试纸、接种环、酒精灯、量筒、玻璃棒、纱布、滤纸、试管塞、报纸、扎绳、标签、温箱、盖玻片、载玻片、显微镜、杜氏管、血细胞计数板、血细胞计数器、接种针、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、灭菌滴管 1.1.3 培养基 沙堡琼脂培养基 马丁氏培养基 1.2实验的操作 1.2.1 培养基的准备 马丁氏培养基的制备、无菌水的制备、沙堡琼脂培养基的制备 1.2.2稀释涂布平板法 1.2.2.1倒平板 将沙堡琼脂培养基、马丁氏培养基溶化，待冷至55-60?，然后分别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拨出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管(瓶)口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀制成平板。最好是将平板放室温2-3天，或37?培养24小时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。 1.2.1.2制备腐烂苹果稀释液 选取苹果上的霉菌，将其放到烧杯中，加入10毫升无菌水，搅拌，将其制成悬浮液。放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使腐质苹果与水充分混合，将菌分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml -1-2-3-4-5-6无菌水的试管中，以此类推制成10、10、10、10、10、10、各种稀释度的霉菌溶液。 1.2.1.3涂布 -4-5-6将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10、10和10三种稀释度，然 -4-5-6后用三支1ml无菌吸管分别由10、10和10三管霉菌稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌铁涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。 1.2.1.4培养 将马丁氏培养基溶化平板倒置于28?温室中培养3~5日，沙堡琼脂培养基平板倒置于37?温室中培养2-3日。 1.2.1.5再接种 将各温度下培养的菌种再次接种到相应培养基平板上，倒置于原温室中培养。 1.2.1.6挑菌 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28?和37?温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。 2结果与分析 2.1结果 2.1.1各培养基上菌落数目 对涂布平板培养法培养之后的菌落数目的统计得以下结果，如表1 表1 培养基 菌种 霉菌 酵母菌 83 0 马丁氏培养基 0 75 沙堡琼脂培养基 2.1.2真菌菌落特征: 2.1.2.1霉菌菌落 将不同霉菌在固体培养基上2-3天，可见霉菌菌落有绒毛状、絮状、绳索状等。菌落大小依种而异，有的能扩展到整个固体培养基，有的有一定局限性(直径1-2cm或更小)，很多霉菌的孢子和菌丝能产生色素，致使菌落表面、背面甚至培养基呈现不同颜色，如黄色、绿色、黑色、橙色等 2.1.2.2酵母菌菌落 酵母菌在固体培养基上菌落呈油脂状或腊脂状，表面光滑、湿润、粘稠，有的表面呈粉粒状，粗糙或皱褶，菌落边缘整齐、缺损或丝带状。菌落颜色有乳白色、黄色和红色等。 2.2分析 霉菌菌落由菌丝体和孢子组成，菌落比细菌和放线菌大，有的甚至布满整个培养基表面， 菌落较疏松成绒毛或絮状，因霉菌的基内菌丝在培养基内生长，故其菌落不易被接种针挑起:因霉菌孢子带有各种颜色，使其菌落表面也呈现黄、绿、青、橙、黑等颜色 酵母菌菌落由单细胞的酵母菌组成。其外观与细菌相似。呈圆形，表面湿润光滑不透明，易被接种环挑起;多数菌落呈乳白色，少数为红色;长时间培养的菌落表面呈皱缩状。酵母菌以芽殖、裂殖、掷孢子方式进行繁殖。霉菌以无性繁殖(芽孢子、节孢子、厚垣孢子、孢子囊孢子、分生孢子)和有性繁殖(卵孢子、接合孢子、子囊孢子)进行繁殖。 霉菌菌丝体由基内菌丝。气生菌丝和繁殖菌丝组成，其菌丝比细菌及放线菌粗几倍到几十倍，可以采用直接制片法观察。本实验中，霉菌观察采用直接制片观察，酵母菌采用简单染色法观察。在显微镜下酵母菌的形态特征是大而分化，而霉菌细胞的特征是粗而分化，细说就是酵母菌见芽体，霉菌可见其分生孢子与分生孢子梗。