BardetBiedL综合征蛋白质复合体BBSome在蛋白蛋白相互作用调节及分子伴侣复合辅助下的组装 (2)（可编辑）

BardetBiedL综合征蛋白质复合体BBSome在蛋白蛋白相互作用调节及分子伴侣复合辅助下的组装 (2)（可编辑） BardetBiedL综合征蛋白质复合体BBSome在蛋白蛋白 相互作用调节及分子伴侣复合辅助下的组装 (2) 德器惑意一冀综合征蛋自质复合体瑟黼在蛋囱 一 蛋离栩置俸用调节爱分子伴侣复合倦辅助下约缀装 髓奄麴 量风一糕重鱼紫懑熏雕戮穰魏奄遗翘噩薹遗 口 。 』 ? ? 日 ? ?《? 重鼋胍 置藿爨髓重疆穗重雹髓嘲驵髓毫垂爨 鼢亘 露隧?糯 导 师: 呈 箜 谂文课起止时问: 年月一 年月 完成时阑: 茎璺圣生壁圈 中国医科大学《辽宁 年月帽医科大学研姓学位论文独创性声明必燃必 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料,与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。 、 / 论文作者签名:笪垄出疑日期:主生王垒上伽 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学,且导师 为通讯作者,通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容保密内容除外,以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名:笪坌羔堕 指导教师签名: 日圈录 一、摘要 中文论著攘要? 英文论著摭要? 二、英文缩略谮? 三、论文瑟剁一瑟综合征蛋囱质复合体嚣在蛋囱一蛋白捆瓦作用调节及 分予伴侣复合体辅助下的缓装 前言? 孝才耩与。 实验结粟 讨论?碡 结论 阏、本磷究创新性的自我评价? 五、参考文献??鸵 六、附录? 综述?碡 在学糯问科研成绩?。? 致谢? 个人简介??。中支论著摘要。 氇屯一卫综合徒蛋囱震复含体瑟。盟在蛋囱一 蛋囱褶亘作用调节爱分子《半偶复合体辅助下韵组装 的 因 纤毛糙耐器是从一些原棱细赶和真核维胞表面伸懑豹突起,由三个丰 要部分组裁:中央轴丝、围绕它的餍膜和一些细胞质。纤毛在脊椎动物体内 的广泛 存在可以解释当其结构或功能出现障碍时趣现翡复杂多祥豹疾病或表型。秘前已知 存在纤毛功畿不全的有肾、谶网膜组织以及神经铃、发育中的肢体、胰腺、肝脏、 脾、骨骼及中枢神经系统的一些部分。这些疾病因病因学及遗传学方藏的重塞丽被 归入~个大类,统称为纤毛福关疾病亿滞赫铭。醋蒋『的研究数援可帮助我们在 这类疾病中发现新的基因突变,翳外在认识纤毛棚关疾瘸的症状方巍也大有帮助。 穗卜醴综合征瑟捌转甜 ?黼霉,转是一稀罕见的与纤毛辋关 的人类常染色体隐性遗传痪瘸,影响人体多个系统。其丰要临床症状包括肥胖、税 网膜色素变性、多指霆畸形、多囊肾、性腺发商不全、认知障碍、高血压及糖 藤瘸等等。由于其多样的临床症状,使黪穗啦综合征成为研究多种人类疾瘸 分‘了的重要模型。刹湖前为止,共有个嚣器鏊因被搬导,其中器露、厶 帮、、、器和萝七种所编码的蛋囱共同构成糕删啦综合征垂白复合体 聪。 人们对黼组装过程的步骤、调节知之毽少。在体囱,几乎所有豹构成 瑟的蛋囱都以脯复合体亚罐形式存在,丽辍少见游离分了,这提示 瑟秘撤的组装过耩进行鲶非常迅速,且各中间体存在时闻极短。本研究对 器西复合体缀装的全过程进行了深入氍开究,尝试建立一个转瑟缱装的模 型。对组装过程的研究将给各皿基的功链谤究奠定慕础,并给转糯熊 整体功能研究提供新的思路。材料及方法 羔、克隆及避克隆使用煞菌株、载体、工其酶等 大肠杆菌粉料虢,克隆载体髂瞻、《隧。魏,表达载体塞《。嚣馨、 《》一料、《》一髓、鹾?矗:; 鲫醚、您黼 。瓣鏊膳带缴 合成酶;所有隰翎性内切酶包括部分高保真版本、瓣连接酶、 。辩耐 掰鞠等来盘程秘。所有点突变型质粒均使用疆跹巍勰 聪鼬趣试制盒掏建并经测序确认。所有糖关人类及小鼠基因序列信息来 囟聪囝骢。融器?甜数据库,使用嚣共享舨软件及镊躐 ,进行序列 、内切酶选择、引物设计及测序结粟对比筛选。 、本研究中应用的抗体 兔撬人多克隆抗体秘、、、,单克隆抗体缄。‰ 多克隆抗体 锄够诅。谗,单克隆撬体嚷巍赫确《溉单克隧抗体髓。。曲鞠,兔撬人 单克隆抗体娃宦。瑟鹣、, ? 拜鼹汛, 黼琏魏。羊黼。瑟秘 。 麒媳 大鼠髓谯一薹》鼹蠢蔓》。兔越??唾娃魏。印。。睫加萄 嚣, , 酷, 。 、细胞培养及转染 本研究使用的皮肤成纤维细胞黢爨一携带器瑟常见突变巍的人类 棚鼬。蟊醯综合征患者;另使用细脆及瓿嚣胁酞驴聪绷胞。转染使用 惫徽。或酞剐。 、免疫荧光观察圜的蛋白定位 细胞以冷甲醇与阑定后洗涤封瓣;封闭液中稀释目的蛋白标签一抗在窒溜 孵育后薹》瑟洗涤;再次封闭,后以碰 或趟鑫标记的二抗孵骞。最终以 禳片,并在荧光共焦霆微镜下观察并搠 ?瓤。《辩。必稳黼甜 魏赫魏髓 摄。 、免疫共沉淀观察各蛋白质分子闾棚互作用使用不闻标签羽人类藤转纂因被 共转染入纲胞。转染罐小时后,裂解 细胞、离心。联上清以笋翩趣聪糖聪孵商。经孵育后的纲胞裂解滚再以标记 有榈 应抗体的弱孵育,以裂解液洗涤后行慨。掰瑟并以相应抗体检测。 、溉 宦检测蛋囱表达水平 取野生型及突变型雄性小觚肇丸镧备组织匀浆,黼。辔崤鬟囱定量。蛋白经 电 泳分离、电转至硝酸纤维素并以雌鹰鑫转嘲鼹西醐驵瓣《嚣发光检测。 、蔗糖密度梯度离心 小鬣组织制备组织匀浆,离心,上瀹转移至一%蔗糖梯度离心液,越速离 心。墩上满液并以冷丙酮沉淀,离心。沉淀以一胍上样缓冲液溶解并以 霾毒检测。 、蛋白酶敏感性实验观察蛋白质稳定性及降解情况 以分析液裂解细胞,等量篮囱与。瓣漉混合。终止反应后卺《髑秘检 测,观禁泛素化蛋白质膝解途径下瑟瑟噩白的降解情况。 、小鼠 本研究中应用了多个鼬恭嚣照。?髓或妇一咖小葳。 移豢 团 蠹璃 汞 、秘、、首先形成一个三元亚复合体 秘、、之阀存在较强的相互作用,这种作阕强于这三种蛋白与其德 器臌。组分垂白。该三元孤复合体成为整个辩。糯。的核心及其他弧基蛋白 缝装 进入鼹的平台。 、懿及彗碡最后装配入矜趣融 的最常见罐意突变型蛋白黼并不影响除瑟碡之外鹜。黼其他蘧 基组装遴入复合体,所有。亚苯蠢白中及西鼗后装醒入 秘醪,腮砖的整合剃依赣于瑟的存在。 、瑟腾的定位 蟊瑟与糕的结合及定位于中心体/中心粒属圈卫星体的过程不依赖予 器黼嚣其它亚基,说瞬这一定位是瑟霹分了的固有属性。 、辩的调节作用 瓞调节瑟酪刀嬲亚复合物及研聪复合体之间的褶互作用,且在整 个秘璐的组装过程和功能调节中发舞重要作绷。 、鹣瑟的释放 瑟瑟警从瑟瑟分子伴稿复合体中释放后参与形成夥秘//的三元亚复合铹。 瑟整合入黼是与雕复合体脱离瑟嚣趱的过程榻藕连的。 、腾黧的稳定性 黯秘塞的稳定性依赖于鼹鹣鹏秘贬复合物、分子伴倦器蛋自及 研橥复合体。游离状态下麴园最终遴入泛素化途径被蛋白酶体降解。 绻论 秘、、首先在秘秘分了伴侣复合体的辅助下形成融秘撒的核心三元复 合体,而后转。融的其德组分蠡囱瑟、、分别独立整合入瑟。勰,壤后 瑟瑟依赣于秘的存在组装进入复合体,藏熟的瞰组装完戚。幽此我们建 立了一个完整豹秘趱的组装模型。 美键谰 ‖~月%, 转鲥 一醴综合征;纤毛;型分了伴侣;中心体;蛋白酶体 碡英文论著摘要。 薹脯鼋麴露耄腮一鼋髓麴鼋疆飘黼疆鼋渔雕 耄量藿瑟瑟 巍德。腱疆穰霪耄 唾髓耱毒疆疯糯 鬻 疆隶 麒臆 。鼋基;联糙 蠡甄 莲聪缴魏, 瓣弘 酝蘸 器鳇。髓鳇泌,辨《 脯鑫谶朦《,程黯绷攒鑫糕黼锺秘藕躐程 翔《?越圆》爨媳《强黼雹熊瘫童烈 秘扩瓣聊髓鏊?嚣 黼洮黼臌 聪重魏瓣重飘。魏撇徽耐稻。理 龟。髋彝魏磐差添缱姻飘秘 魏 ’聪,髓《强 ,,,,,,徽 赫 鼹 鼋硒黼器飘?滩 濑。硝,魏 瞧髓髓。魏翩秘《睁聪。爹《妊 瑟麓 鼹 懿糯髓 壁雕瞎。 聃琏瑟瑟 。腻 瑟秘,瑟瑟 酶露容糊锺履谢 黼 嗣 鼢鑫鲢 愆唾雌鹋程西辙 黼噩繇 《 薮疑幽。哦魏静粉 ? 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一南缴。 秘梭糖化类似因子 风 醯糊磷。受烈魏 聚合酶链式反应 鞴’ 鼹?『髓趱越稍 鞭毛内转运 魏孤热 放线菌酮 ????????????????????????????????????????????????????????????????? ????????????????????一~ 。谂变。 鎏疆擎卜综合征蛋囱质复岔体嚣瀚在蛋囱一蚕 囱榈亘作用调节爱分子伴缌复合体耩助下的组装 前 言 纤毛诅州是从一些原棱细胞神真核纲胞表殛伸出的突起,豳三个丰 要部分组成:中央辘丝、围绕它的质膜和一些细貔麓。轴丝从纤毛藏鞭毛底 郝豹基 粒直达壤端,为一柬直径约~埃的微篱,在基糍底部,则粲聚成懑锥形柬, 深入到细胞质中。 根据轴丝的徽箭排列方式不阊,常见的轴丝结构有轴丝及 车豳丝,比较罕觅的为辘丝,仅见于兔胚胎的脊索摄。一般的根据轴丝结构 及是否具有运动性,人体内的纤毛,丰要有阚种类型:运动型纤毛;包括呼 吸邋上皮缎,趣纤毛、脑室室钎膜细胞纤毛、牛蹙道上皮维胞纤毛以及精了的鞭毛 等;非运动型纤毛:包括内耳的动纤毛和静纤毛等;非运动型纤 毛:肾小管、胆箭、胰管上皮纤毛,舒缀臆/软骨细胞纤毛等,此外,视网膜感受 细胞的外段也是一种特殊的非运动型纤毛;运动型纤毛:仅见于瓤胎 结纤毛。 纤毛在脊稚动物体内的广泛存在可以解释当其结鞫或功熊出现障碍时出现的复 杂多样的疾病或表型。圈前已知存在纤毛功能不全的有肾、视网膜组织,以及神经 管、发育中的肢体、胰腺、肝脏、脾、骨骼及中枢神经系统的一些部分。凝床上已 经证明阂盥接或闻接因素导致熊纤毛功能障碍产牛的疾病有;多囊肾固、 雕瀚黼综合征及棚卜瑟硼综合征等等。这魃疾瘸因病因学及遗 传学方面的重叠而被归入一个大类,统称为纤毛褶关疾瘸佗秘泌。豳前的研 究数据可帮助我们在这类疾病中发现新的摹阂突变,另外在认识纤毛棱关疾病的症 状方面也大有帮助。大分子复合体瓣趱髓甜雠, 包括披糖体,蛋白酶体,核 孔复合体及鞭毛内运输复合体雕。弹魏等等,参与维持细胞内的多种綦本 生物功能。越来越多的研究开始关注与这些臣分子复合体的组装及奠特征 瑚。蠢自 质复合体为细胞实现复杂的机熊调控提供了一种重要的手段,在以往很长一段豺 间,这种作用都被低估了,为了更好豹理解细胞的牛命活动机制,对这些功能性的 蛋囱质复合体麴缝装进行溧入的研究就显得很有必要。另外,对薇囱葳复合体组装 过程的研究,也为罴囱质复合体功能的药理学修饰摁供了新的可麓,并将扩展药物 开发的新领域。 瑟绷仁鼹综合征是一种罕见的与纤毛相关的人类常染色体隐性遗传疾病, 影响人体多个系统。其丰要临床症状包括肥胖、概网膜色素变性、多指瓣畸 形、多囊肾、性腺发育不全、认翩障碍、离壶压及糖藤瘸等等,鼢。由于其多样的憔 床瘫状,使捌啦瑟送综合征成为研究多种人类痰瘸分予机制的重要模燮。到黼 前为止,共有个膦基因被掇导曩其中腮箩,、、霉、、入器和萝七种所编码 的蛋白共同构成转捌~西醚综合征蛋白复合体臌鳓。器。在纤毛膜发 生过程通过小酶鼗腩及最糕中发挥作用,阔时与耵途径褶作鹰参与。癞 莲魏。信号转导的调节。在瑟瑟獭的各个亚基中,瑟瑟、、及含有 螺旋,瑟、则包含多个霄鼗懿纛。叩豳浆镩馥结构域,而瑟转剿有 两个黼瓤琏。糯。结构缄。这些都是已知的参与焉囱质棚互作用的结 。 构域。蟊霹/胤一曲毫髓《 则是风鬃自超家族中小 结合鬟囱中的一员,是瑟瓣定位于纤毛的过程中所必需的瑟创 。 瑟、、贝』与二型分予伴侣有丽源性陋胡。研究显示, 移秘与其中两 个分子伴侣类似蕊囱瑟瑟、构成另一个复合体并在 睨黼蛋白复合体的济 助下完成瑟瑟臌。的组装四,这个分子伴侣复合体在瑟瑟纽装过程中是必需 的。然丽,人们对这~过程的步骤、调节以及秘如耩从分子伴倦复合体向 器转。糯复合体转移都知之甚少。在体幽,几乎所有构成融瑟。的强囱都以 露融腱。复合体亚基形式存在,丽极少见游离分子,这提示器鼗。赫瓣组装过 程进行的非常迅速,且各中间体存在时问极短。蹲黼组装过程的研究将给各亚綦 豹功熊研究奠定基垂毒,并绘秘艟飙的整体功能研究提供新的思路,另外,还 将有 助子提供可在缨胞水平有效评估在患者中发现的点突变的新方法。 本研究应用了多种方法对这一过程进行了搽讨。首先构建了多种根据霹患 者发现的慕困野生型及突变攫表达载体,应用多种嚣器转基因融鲢藏 。。诅小鼠,以鼗干涉干扰瑟瑟黼的组装,另外在搬的某些照基 的过袭达下,得到了瑟瑟组装过程中的一些特定的中间体。通过对这些中间 体 的研究,发现瑟瑟分予伴供复合体瑟瑟僭偈/霭在秘转的帮魏下 将瑟瑟囱器瓞魍转构成的程复合体转移,并形成瑟瑟鹏秘廛瑟三元亚复合 髂。之后,在蛋白质糨瓦作用下,引导融、及分别先后缀装入。最 后进入复合体的亚蓬碡则依赖于醛的存在。丽秘愿僻构成的噩 复合体,与其它起调节作用的蠹自、魏、瑟以及仃雕一道,对 维持瑟和的稳定性煲』是必不可少的。 材料爱方法 一、壳隆及亚壳隧使潲的菌株、载体、工翼蓐篝等 《一》菌种及质粒 大骊杆菌秘鞭兔,克隆载体麴囱黼,巍鼹麴囱喇:傩。, 表达载体《》。,一黼,《一融改造囱栽体,? /麴囱魏融歉;应绷黯琼脂糖平板培养基及樵应抗牛素筛选单克隧菌落。 《二序列分析及引物设计 所有榴关人类及小葳基因秘序列信息来癌暴酶魏。糯西?嚣数据库 , 筒瑟 撩糯疆 使 阂 蘸《》嚣 魏耄耋://嚣?鼹。聪。髓 聪:纳痨。哦施嗣嘶。鬻雌髓船弦/撵影共享版软件及购买囱舔黼陀的 斓 。进行序列分析、内切酶选择、引物设计及测序结果对比筛选。三矜合 成酶、限制性内切酶及其它修饰酶类等 合成酶选用昶。挫罄的辨甜髓聪、器徽 鼹墨确甜。合成酶; 所有限僚性内切酶包括部分离景真版本、碡矜连接酶、列鼹等均来囟 嚣器;人类文库购买囱毒糯组聪髓。 圜定点诱变构建各蛋白突变型表达载体 所有点突变型质粒均使艨瓢勰瑟 《一磺僦酶锺融 鑫鼬《鬈, 棚,试剂盒并经测序确认。 二、本爵舞中应用的摭体 兔抗人多克隆抗体、窆、蹲、了,单克隆抗体酬一。舶畦飘, 多克隆揽体 《。辩《珏,单克辫抗体黼《。瓣罐躐耐融髓, 单克隧抗体鲤畦吖。鼬鞠法, 兔撬人 绷 单克隘抗体黼一鹣器、, 黼照, 豳琏购买囱器。 。旺融 ? 麟。羊黼一秘转 购买离鳓 《 黼瑟。藿两。。鼯 风, 。 鼹 大鼠。 耪购买囱舱鼹趣西随鼬 萨, 渤糯。兔纵一聪旺髓购买囟躺融鼬最疆萨, 黼。黼脚? 威 瑟瑟, 瑟瑟, 秘购买囱 粉腿。薰堇 鑫鲢鲢疆黼鹣, 趣髓,。黼聪秘黼购买囱激五黼聪,。 三~纲胞墙养及转染 皮膑成纤维细臌取囱一携带霞器常见突变爨的人类瑟鑫糟感瑟穗综合 征患者,对照闵皮肤成纤维细胞购买画矗融惑雠嚣幽透暇, 铡,使 用琶魏曲?% 培养攀培养。磐纲胞使用耢嚣翘曲 培养基墙养。舸鲢陲肿基纲腮健用黼程斛,。热醴聃黼 疆% %嘲黼培养基培养。所有转染均使用糯四趣嚣?藏者昶赴黼 越《黔飘,甜幽勰,。黛越转染中,终浓度为仉魏。 躅、免疫荧光理察豳的蛋囱定位 细胞以冷甲醇与匿定分钟后融洗涤次,再含有%融的瑟封闭液中封闭;封溺液 中稀释一抗在窒温孵育小时后洗涤次;再次封闭,后以 》孵商。最终以 烈暇碡或趟 标记的二抗抽捃。锚,烈幽越, 白。扩渤。雕。蠢, 趱黼嚣, 蘧鼗。驵匿重 髓腿疆 《赫魏耢』蔑磬 裱片,并以荧光共焦显微镜观察。 五、兔疫热流淀觋察备蛋囱震分子阁捆置僬震 带有不同标签的人类秘基因被共转染入零纲胞。转染小时后,裂解 熊静。, 昶。幽, 飘 簋鼹痰糊魏, 器, %瓢撼飘。, 缨胞 麴鹪 鑫如黼嚣, 烈并在羰,?篾离心分锌。取上清以?《翘 风趱, 孵育。经孵育后的细胞裂解液孬以栩应抗体孵育窆小器寸。轳?。髓 好 检测。 熊再孵畜小时后,以裂解液洗涤次进行谤爨 六、骶雹魏瑟垂检测蛋囱囊选水平 雕藕释睫凰, 取瓣牛型及突变型雄性小鼠睾丸经鲢嚣段 秘, %疽?辨? 鼢澜瀚《锵, 豳聪瞩, 羧以裂解缓冲液 尉制备缱织匀浆。行液氮反复冻融次。裂解液以 牖, 鳓鞣?, 。一黛赫 , 离心分钟,后行蛋囱定量 瓣程圣莲糙, 磁曲, 电泳分 。蛋白经碡一%诅胍嚣瑟醅落萨驸《?, 辩, 畦黼饴彀熊辩彗缴。 离、电转至硝酸纤维索并以诅萨 酞赫嬲,检测。 七、蔗糯密度糕度离心 小鼠组织应用醚琵幽鲻鼹巍,驴藿莹鳓诅呐,胍以裂解缓冲 聪 熊渤《, 鼗, 。%落魏一? , 疆魏颦, 液 。耱 铡备缱织匀浆,,? 离心分钟。上清转移趸一?%蔗糖梯度离心液, 镁。爹魏五。髓《彝落, , 】。徽 缱雉、时量萤。 升上滴滚移出,并以冷丙酮沉淀,,羽嚣离心分钟。沉淀以秘一腿西上 样缓冲液溶解进行溉艇腿检测。 辱八、蛋囱藤每敏感性实验观寨蠢囱震稳定性艇降解情况 雕, % 以分析渡激豫一瓣, , 黼。, 四裂解细胞,等量蛋白与辩‖照五腿混合。以终浓度黼黼班》私 终止反应并进行醅?瑟檎测,溉察泛素化蛋囱质降解途径下瑟秘蛋白的降解 情况。 八、实验动物 本研究中应用了多个器瓠基因融薮一汛或融薮。聪小隰,均为实验窒囱行构 建。 寨验绪票 一、瑟鑫、彳、形成瑟鞭的核心三嚣藏复合傣 表,本研究中使用的来源于器融患者的点突变列表 照 鼗 秘髓 。鬓 鼗 器 爹。墨。 器器薛 ,国嚣,。黛。愆,。。 ,。聪鼗 蛰 。舔,。斛 嚣胜纲飕中过表达带有魏疆窝标签的点突变椭秘及野生型 瑟瑟,并以魏鐾瑟阳 髓。其它内源性糙嚣避基以酶魏瑟检测。 与野牛型瑟相比,突变的秘。”雌’结合瑟瑟黼其它煎基的熊力嘲显藏弱。有 趣的是,滕睨四结合的转转黧要翔对多于转瑟或图,提示存在一个含有 瑟器蕾恼鼗的贬复合体,且瑟瑟警与融西的结合要先于其它转蠹囱如 瑟瑟和》。此外,也说嘲秘髓 与露之间楣作用后整个瑟器黼的组装受 。 阻。这与之前发现的与之间存在强相互作用的结果相一致‘ .皇 ’。乌 . 一量 . . . . , . 。 . ???甓 \一一/ 图,野牛型及突变型蛋白的功能比较 图示:带标签的点突变及野生型转染细胞,并以基以 。其它内源性 检测;与野生型相比,突变的 结合其它亚基的能力明显减弱。?结合的要相对多于或 ,提不存在‘个/的复合体,且与的结合要先于和。 以期结合内源 在细胞中过表达带有标签的//, 性的亚基。结果发现外源性表达的结合了相当大量的和,而 和则几乎没有结合图,提示与/形成亚复合物。这也是利 。 之前结果相一致‘: ??., 日 口 日 : ?一 一??一??刍瞅 图,,,与,,,的共沉淀、糯。 图示:带鹋标签的,,及转染细胞,并以 其它内源性伽亚基以缸釉检测。结果发现外源性表达的结合了相当大量 的和,而和则几乎没有结合,提示与髓/形成业复合物。这个结果 也是和之前与阴而不是作用相一致。 为了进一步确认这个推测,又在稳定表达的细胞中应用对内帅。 内源性亚 源性进行。以 基以妣 检测。有趣的是,的沉默会大幅度的削弱与、 及的作用图,更印证了之前的推测,先与、作用形成// 亚复合物,而后才与,/发生作用。 但的沉默并不影响与的结 合,也证明这两者之间的作用是不依赖于的。 ~ ; 垂 ????? ????一一 ?? ??????? ???一 ??叱吁州:? 一争 图,的沉默会大幅度的削弱与、及的作用 图示:在稳定表达的细胞中应用~对内源性进行、。以鹋 船 咖鲫。 内源性鲫亚基以‘釉检测。的沉默会大幅度的 削弱与、及的作用,印证了我们的推测,先与、作用形成 //亚复合物,而后才与、及发生作用。 二、陷及盼装配入骼。鹏 之前的配对相互作用研究显示与多个亚基、、、之间 都存在相互作用,这个结果使得成为构建整个的骨架?。为了明确 各个亚基是如何整合入中的,使用了由本实验室构建的多个勖突变的小 鼠系【雏。针对睾丸组织的 结果显示,携带有鼬『的最常见错意突变 如埘姗的小鼠的蛋白表达水平降低,但其它亚基的蛋白表达水平 与野生型小鼠相似图。蔗糖梯度离心结果表明, 蚍蛋白与其它 蛋白之间作用与野生型无显著差异,而除外。在胁『加姗.小 鼠中,的绝大部分是游离于之外的图。为了确认这一结果,尝试 在口的『加吼巩小鼠中以锄.的抗体共沉淀内源性的,与预期相 一致,和从中消失图。为了检测突变型蛋白如何 影响整合入,我们对带标签的与带标签的伽各 亚基在细胞中进行了共转染。结果发现,突变型蛋白与的作 用大大减弱图,同时其与和的作用不受影响。总而言之,这些数据显 示要先于整合入图。用类似的方法我们证明了的丧 失不会影响舱的其它亚基进行组装图,,说明是最后组装入 的亚基图。 , ‘ 妒 ??????一 ???? 嘶‘ ??. 一??哟? 曩叠? ?? 一嘲,例 鹏 ?????, 。蛳 图,小鼠睾丸组织中各蛋白的表达状况 图示:小鼠睾丸组织胬蕾咖结果显示,携带有励曩的常见错意突变肋字埘螂 的小 鼠的蛋白表达水平降低,但其它响亚基蛋白表达水平与野生型小鼠相似。 \厂 啪粥 ? ‘ 一互?一 一二囊? ????,?一 ?.????一 ????一 。一一一 一?二一一 一一?一 ???? 一??一一 ???一 一??,一 。??, 图,蛋白野生型及突变型功能对比分析 图示:蔗糖梯度离心结果表明,如蛋白与其它蛋白之间作用与野生型无 差异,而除外,在.小鼠中,的绝大部分是游离于伽之外 的。 , 羹 : ?? ??? 一??? ?????? 图,卿‰小鼠中各蛋白表达水平与野生型小鼠的对比 图示:蚍小鼠中以锄.的抗体共沉淀内源性的伽?各亚基, 和从锄中消失。器 盘 盘 单 单 甲 窖 窖 露 正 正 正 叱 叱 比 宝重宝量宝 宝望 宝委宝 羹鋈 . : 一一? : ???一 . 。。一一’一 ???,??? 图,蚍突变型蛋白结合其他啪亚基的能力 图示:对带标签的与带鸩标签的各亚基进行了共转染。结果, ?突变型蛋白与的作用大大减弱,同时其与和的作用不受影响。 图,要先于整合入的模式图 岍鼬十二 :: 。 一???~ 一????一。 一?~ ?’ 一辽。 :一 ’互 ?一一一 二??一 图,并不影响其他亚基蛋白整合 图示:蔗糖密度梯度离心显示在胁矿小鼠睾丸中除外其它所有伽?亚基仍然 可以形成复合体。 另外,先前研究中为了确认是否某些蛋白的缺席会导致的不完 全装配,对细胞中船鼯或舢嘲以进行了,发现 其它亚基仍然可以组装入复合体【】,这个结果说明、、是独立的装配到 中去的,与配对作用的、、及直接与相作用的数据一 致【。? 妄 謇 : 一三 :?.? ?? ?一. 图,最后一个整合进入 图示:应用抗抗体免疫共沉淀显示是最后一个整合入伽的亚基。 图,最后一个整合入圮的模式图三、明与伽的结合及定位于中心体/中心粒周 围卫星体的过 程不依赖于阻伽怕其它亚基 目前认为是最后一个装配入伽的蛋白,因此我们推测 有可能是伽与其它非蛋白相互作用的重要亚基。之前研究显示,当细胞 被引导形成纤毛时,从细胞浆移动到中心粒周围卫星体,然后再移动到纤 毛。定位在中心体/中心粒周围卫星体并于的羧基端相互作用【,, 这一作用的功能目前尚不清楚。为了确定.的相互作用对于定位 于中心体/中心粒周围卫星体的过程是否是必不可少的,将带有标签的野生 型 及种突变型及分别与带有标签的的羧基端片 断进行共转染。两种点突变都中断了与的作用图。当转染入 冲细胞时,两种突变型蛋白都失去了定位在中心体/中心粒周围卫星体的能 力 图。这个结果提示.的相互作用对于定位于中心体/中心粒 周围卫星体的过程是必需的。 . 岩 % 瓮 民 宝 ; 壁 : :?鞠? ?‘??叠 ??????一?一 图,两种突变型蛋白都失去了与相结合的能力 图示:带标签的野生型及种突变型及与标签的 的羧基端片断进行共转染,两种点突变都中断了与的相互作用。免疫共沉淀 实验 使用抗和的抗体。山 ... ? .。’ 图,点突变及中断了定位于定位于中心体/ 中心粒周围卫星体的过程 图示:图中显示的是野生及突变型的免疫荧光染色。丫.红色用 以标记中心体。 为了确认完整的对于定位于中心体/中心粒周围卫星体是否必 需,取 小鼠肾细胞以.进行转染。在无、或者的情 况下,的定位不受影响图,说明这一定位是游离的的固有特性。 又进一步将与发生作用的区域定位在的氨基端个氨基酸区 域图。这一区域个氨基酸不包含与相作用的区域,是通 过与相结合的一种酬蛋白【】。另外,还证明了仅在 参与下才会与相作用图。 ? 图,的亚细胞定位不受其他亚基的影响 乒, 图示:乒, ?。肾原代细胞转染.,转染细胞同时染色. 红色。在无、或者的情况下,的定位不受影响。 圄 誊 垂嘲薹 舻 :??一 ????~ 一? :. ?? 俩簿珏掷 伯”印??? 渤 啦 . .’船姆 图,及的与作用结合域的定位 图示,.截短突变体经制备,并在每一个截短蛋白的氨基端加入。这些 .截短突变体与?的羧基端或弦进行共转染。.仅在有 参与下才与相作用。 四、明调节阻//亚复合物及/复合体之间的相 互作用 已知与、以及厂蛋白构成分子伴侣复合物。 是该复合物中唯一的非分子伴侣组分,提示可能是该复合物的底物,其功能 之一可能是维持的稳定性。而则在亚当量水平小于:与这一复 合物之间发生作用【,提示并不是这个分子伴侣复合物的结构单位,更又可 能的是发挥对复合体形成的调节功能,其具体功能仍然未知。在稳定表达带 有 标签的细胞里对进行了、,结果并未影响与内源 性的相作用,但下调与仃复合物中两种蛋白?及的 相互作用,提示//与厂讯作用需要的参与图 ,而的过表达可增强与?及之间的作用图。 置 蓉营一 剥哆々/ 鞫 童 鲁 ? ? 蛊 旺 ? 一 ? ?.???? 一 ???? 一 互砸 图,//与佃作用需要的参与 。以共 图示:.在稳定表达分的细胞中应用舢 沉淀分子伴侣复合体。抗及厂豫蛋白的抗体检测相应蛋白。..与 空载体及?共转染。标签抗体沉淀分子伴侣复合体。抗及册 蛋白的抗体检测相应蛋白。五、明从分子伴侣复合体中释放后参与形成// 的三 元亚复合物 成熟的不含有,或/蛋白,说明这些伴侣分了 应该是在某个时间点脱离的某组装中间体。为了确定这些成分脱离的时 间,我们在细胞内过表达带有标签的并使用抗体进行免疫共沉 淀。与预期一致,与及/被共沉淀出来图。有趣的 是,也有一定量的被共沉淀出来,但量明显少于被另一种蛋白 共沉淀出来的。这提示我们,这部分的是与与解离的过程 相关联。这部分的也有可能参与的释放,因为一的相可 作用也需要的参与。 ;;; 盘罄罄昌言盘盘盘 曷 絮餮童毛东 ;霸蚕警警 ?,蠡 四蛊蔷 三二。二 唧:?:一~ 。 ?‘咖。 嘲 ”” ? ::兰 :? 一 ,.。 一 口 ? ? 口 ? 图,/及/从分了伴侣复合体中释放与//的亚复合 物形成 图示:.?在细胞过表达给 问体设置“路障”。以沉淀 ,并以 检测内源性她基。为阳性对照,?为阴性对 照。.厂复合体从脱离的过程。在细胞里分别过表达每一种 基蛋白并观察该哑基蛋广可以与厂.复合体共沉淀,】为阳性对照,?和 .为阴性对照。 揍下来观察了研瓤复合体从秘。。脱离的过糕。在肾缡胞里分另』过 表达每一种瑟黼;亚攥蛋囱并观察该囊基蛋囱是否可以与研厅融夔合体共沉 淀。结果显示,只有耩可见比较强的共沉淀,瑟测相对较弱圈 秘,提示秘整合入瑟凇是与侑黜复合体网释秘偿瑟脱离的过程 横藕连的圈。 虐 “面 、???/ 岛 圈,滕黧整合入瑟瑟是与/复合体闻瑟偈髓兑离的过程 栩藕连的摸式圈 六、阗窆的稳定性依赖于瑟霪/翠/融器重复合物,分子伴稻 廖瑟蛋囱曩?彳/警粱复合倦 我们已经知道瑟/膨共同孛勾成了一个噩复合物圜,为了封月确其重要 性,分删硗察了几种情况下的器表达水平:瑟藏不存在;聩分子伴 侣嚣蛋囱不存在。 在艿加矿及劈夙尹小鼠辈丸组织中,无鼢瞒或无器表达的情况下,瑟 表达水平大幅度下降图。鉴于恐魏的敲羧小鼠尚未建立,我们使用了墩园 一携带有常见突变酝的人类患者的皮肤成纤维缨脆,该突变可完全使 得表达沉默。在我们的实验中,转的沉默并没有影响纤毛的形成圈 ,这是与之前的报导有矛盾,但同样辫低了转的表达。而在获嚣纲庶中进 行的秘瑟融。核心亚基之一、或多糙移分子伴侣复合体组分的 差 差 亳 萎 妄 誊囊 垂 妄 蓄 妻垂 妄 妄蚕 誉 妄 妄 誊 图,的沉默不影响原发纤毛形成 图示:取自一患者的皮肤成纤维细胞的免疫荧光染色照片。该患者携带突 变。乙酰化微管蛋白为纤毛标记物绿色,红色。在野生型及突变型叶,含纤毛 细胞的 百分率相似。然而,在突变型细胞中的染色明显弱于野生型。 为了理解这些蛋白调节稳定性的机制,我们将等量表达?的腺病 毒载体导入野生型及曰矿小鼠肾细胞,结果发现曰矿细胞中的量明显低于 ,与之前为维持稳定性所必需的结果相一 野生型细胞图, 处理更敏 致。而矿细胞中余下的蛋白也对嗜热蛋白酶 感,其半衰期大约为分钟,而野生型细胞中半衰期为大约分钟图 。 ’ ’ ’ ’ ’ 一‘ ??????一 ????寰舅,鼍,?一一 ,眉’目卫 墓翟萤一誊置::?罾露 绺,列蛋白酶处理敏感 图示:野生型及?‘小鼠肾细胞原代培养,并以腺病毒表达.进行感染。等量 总蛋白于嗜热蛋白酶混合于孵育。在以细胞中降解大大快于野生型细胞。提 示无 ,不稳定。 而对肋矿细胞进行的相同实验也得到了类似的结果, 对来自// / 斟 “小鼠睾丸及突变细胞系连同 、, 蛋白稳定性 细胞的蛋白样品进行的色啪结果现实, 依赖于锕//, 但不依赖于和图; 我们又 肾细胞。稳定性以嗜热蛋白酶敏 将腺病毒表达.导入 感性检测。在野生型细胞里半衰期明显长于 细胞图。 訇 鼋 廿 肋 耄 蠢 妄 ??一 至 薹 看 蚕 ?????,州 ???囊. ???? 呐洲????????? 孽 口暑 筹 囊 毫 .? 呈 叶 量 ?? 弓 妄鲁 妄 誉置 . ??? 。: 棚 帅?? 图,蛋白稳定性依赖于,,及 , 图示:. 结果。蛋白样品来自, 及 小鼠睾丸,突变细胞系或细胞。结果显示蛋 , 白稳定性依赖于, 和, 但依赖于和。.在缺少 的情况下,不稳定。将腺病毒表达.导入 肾细胞。稳定 性以嗜热蛋白酶敏感性检测。在野生型细胞里半衰期明显长于 细胞。 随后又研究了在细胞内的降解过程。推测泛素.蛋白酶体通路九. 可能参与了这一过程。外源性及内源性表达的蛋白在蛋 白酶体被抑制时均被泛素化图。还发现,当在细胞中过表达 一泛素时, 即使蛋白酶体不被抑制,内源性表达的也会被泛素化图。 以蛋白合成抑制剂放线菌酮【处理细胞可降低蛋白 水平。而再以及蛋白酶体抑制剂或 处理细胞,这一现象又得到 逆转,表达水平回升图。这些结果显示被泛素化并由蛋白酶体降 解。 ,? ?? 鼍科 量篁 兰 差 嚣望 ? ’ ? 。。’。“”’ 』:。 ? ??? 图,被泛素化 图示:细胞及?稳定表达细胞株以蛋白酶体抑制剂处理。以 或相应抗体沉淀下来,然后以泛素抗体检测泛素化。结果发现外源性及内源 性 表达的蛋自在蛋门酶体被抑制时均被泛素化。 声 声 捌 罢 罢窭 百 墨 蠢蕾 口 卜 图,泛素过表达对泛素化的影响 图示:标签泛索转染细胞,之后以抗体沉淀。泛素化分别以 抗体及泛素抗体检测。当在细胞中过表达.泛素时,即使蛋白酶体不被抑制, 内源 性表达的也会被泛素化。 × ?至羔。 京 蝣;芝? ?? 一?’ 匕二??? ? 二】【?】【二 图,蛋白酶体抑制剂可使的降解过程受抑制 图示:细胞以 /放线菌酮蛔及蛋白酶体抑制剂 或处理小时。以抗体检测内源性。以蛋白合成抑制剂放线菌酮 耐‘处理细胞可降低蛋白水平。而再以】‘及蛋白酶体抑制剂 或处理细胞,这一现象又得到逆转,表达水平回升。 综合以上数据可以推导出一个模型图,的装配是在蛋白相互作 用及外部分子伴侣,及辅助下的一个有步骤的、受精密调控的过程 图。蛋白分子伴侣复合体倍//在的协助下转换 成加/亚复合物。蛋白一蛋白相互作用引导,及的 装配,而最后一个装配入的亚基则依赖于才能整合入复合 体。//亚复合物则与调节成分,,及厂 蛋白一起,为维持及亚基的稳定性所必需。