单细胞LDL受体与清道夫受体活性的同时测定

单细胞LDL受体与清道夫受体活性的同时测定 单细胞LDL受体与清道夫受体活性的同时 测定 生物化学与生物物理进展Prog.Bioehem.Bioph~.?459? AbstractAstheexpandingofapplicationofES cellgenetargetingtechnique,cloningandstrue— turalanalysisofgenomieDNAforphagelibrary forhomologousfragmentsintargetingvectorare becomingmoreandmoreimportant.An effectivestrategyhasbeendeveloped,termedas “ eeparating/combining”strategy,tomake restrictionmappingoflargegenornicinsertin recombinantphagevector.Inthisstrategy,aset ofsubclonewithcomnlonlyusedplasmidvector, suchaspBlueseril:ItTMseries,wasgeneratedas firststep,restfi~ionmappingofeachsubclone wasanalyzedandthen,digestedthewhole lengthphageDNAandanalyzedtherestriction sitecombinedwiththemappingofsubdones. Anaccuraterestrictionmappingofalargeinsert ofaphagedone,whichcontainmousecoagula— tionfactorIXgene,wasgeneratedsuccessfully withthisstrategy. Keyw~?dsrestrictionmapping,recombinant phageclone.”separating/combining”strategy, genetargeting 单细胞LDL受体与清道夫受体活性的同时测定 I:/边欣杨小毅黄有国)7 ?…生一…?2~..100101)} 摘要结合应用激光扫描共聚焦显微镜系统(LscM)和DiI-AcLDL及BODIPYFL-LDL两种荧光配 基igor*标记技术,可在单细胞水平上同时测定LDL受体和清道夫受体活性.C57BL/6J小鼠巨噬细 胞用终浓度为5rng/L的DiI—AeLDL及BODIPYFL—LDL,在37?负载5h左右的条件下可获得良好的 标记效果.两种荧光配基选择性标记具有高度特异性,在激光共聚焦显微镜下可清晰,定量地观察细 胞对LDL和AeLDL摄人.是一种灵敏度高且可定量研究u]L受体和清道夫受体功能的非同 位素 关键词激光扫描共聚焦显微系统,薹堂垄量韭,低暂度脂蛋白受体,煎重去星连 学科分类号(3,c一33温汛性乙 生理条件下,低密度脂蛋白受体(LDL 受体)广泛地分布于肝,动脉壁细胞等各组织 细胞膜面,当血浆中的LDL与其受体结合 后,经受体介导的内吞作用进入细胞中,并与 溶酶体结合.而LDL被摄入量的多少取决于 LDL受体的活性.因此LDL受体对维持血浆 中的LDL浓度发挥重要作用.某些家族性高 脂血症患者,由于LDL受体基因遗传性缺损 导致细胞不能从血液中摄取U)L,使血液中 胆固醇水平升高,从而引发严重的动脉粥样硬 化.另一方面,体内多种原因都可以导致脂蛋 白的修饰,如血液脂质过氧化物含量增加,内 皮细胞的受损和血管平滑肌细胞的增殖,而巨 委磷 噬细胞又可以通过其表面的清道夫受体活跃地 吞噬这种修饰后的脂蛋白,使细胞内大量胆固 醇脂聚积成为泡沫细胞1J,构成动脉粥样硬 化早期最重要的病理变化.因此,同时测定 LDL受体与清道夫受体(AcLDL受体)活性 的变化具有重要的生理学和病理学意义.迄 今,研究LDL受体与清遭夫受体活性主要是 用放射性同位素I作为示踪剂分别检测群体 细胞LDL受体与清道夫受体活性2.近年来, 激光扫描共聚焦显微镜系统(1aserscanning 国家自然科学基金资助项目(39730130) )通讯联系人. 收藉日期:1997—12—04,修回日期:19984}6.09 „ 460?生物化学与生物物理进展Prog.Bioel~m.Biophys.1998;25(5) confocalmlcmscopy,LSCM)的使用和专一性 的荧光分子探剂的问世,为在单细胞水平上同 时测定LDL受体与清道夫受体活性提供了可 能.本工作应用LSCM技术和DiI—AcLDL, BODIPYFL—u)L两种荧光探剂选择性标记方 法,在单个巨噬细胞水平上同时测定了LDL 受体及AcLDL受体的活性,为研究动脉粥样 硬化发病的分子机理提供了有效的研究手段. 1材料与方法 11药品与试剂 DiI—AcLDL,BODIPYFL—LDL购自 M0kcuProbes公司;RPMI1640培养基购 自Gibco公司,新生胎牛血清购白天律血液研 究所生化制品厂,其他试剂均为国产纯. 1.2巨噬细胞培养 C57BL/6J小鼠[3,(20=2)g]购自中 国医学科学院动物试验中心,向小鼠腹腔注射 无血清RPMI1640培养液,4d后断颈处死小 鼠,利用无菌条件下不断冲洗小鼠腹腔的方法 获得巨噬细胞,用含10%胎牛血清,青霉素 100mg/L,链霉素50mg/L的RPMI1640培 养液在37?,5%CO2培养箱中培养3d后, 换液除去不贴壁细胞(淋巴细胞和肥大细胞), 贴壁细胞即为巨噬细胞,按实验室常规方法培 养2d后进行试验. 1.3巨噬细胞的荧光染料负载 细胞以RPMI1640培养基调整至密度为 ()- 州 H (H=(H一(H 1×107/m1.培养基中含终浓度为5mg/L的 DiI-AcLDL和B()DIPYFL-LDL.在37?, 5%CO2培养箱中孵育5h,其间轻轻振荡几 次,然后以无血清RPMI1640洗3次,以除 去未结合的细胞外的荧光探剂 1.4u)L受体及清道夫受体的测定 将负载荧光染料的细胞置于5cM样品 台上,利用LscM光镜系统确定欲检测的单 个细胞LSCM激光扫描共聚焦显微镜系统 (Meridian公司)由共聚焦显微镜主体,Argon 激光器和微型计算机构成.由微型计算机控制 调整激光扫描共聚焦显微镜系统软件.测定 时,选定激发波长为488rlrn,分别选用515rlrn, 575rlrn的滤光片检测发射荧光,并在显示屏 上显示荧光染料在细胞内的分布情况.激光束 的控制以及图象,数据的采集和加工均由计算 机完成. 2结果与讨论 2.1两种荧光探剂的光谱特征 近年来新合成的荧光探剂BODIPYFL- LDL(N.(4,4一ditluoro-5,7-dimethyl一4一bor 3a,4a—diaza—s-indacene-3一pentano1)和I— AcLDL(1,1”-dioctadecyl一3,3.3,3一 tetramethylindcr.arbocyanineperchlorate)分别 是LDL受体及AcLDL受体(即清道夫受体) 的特异性荧光配基L3,4j.BODIPYFL-LDL及 DiI—AcLDL的结构式如图l所示. (b) H „.H (H 图1BODIPYH.-(a)和DiI-(b)的结构式 BODIPYFL一是一种中性荧光染料,它结 合于u)L复合物的疏水性部分.BODIPYFL. (cH)~0co-I 荧光染料对pH变化不敏感,因此,也可以在 溶酶体水平上观察LDL的摄人.BODIPYFL. 1998;25(5)生物化学与生物物理进展Pr嘴.Biochem.Biophys.?461 能很好地被氩激光所激发,非常适用于激光扫 描共聚焦显微镜系统(LSCM).B()DIPYFL- LDL激发波长为503rlrtl,发射波长为515ran; DiI荧光染料扩散入AcLDL中,但并不改变 AcLDL的生物活性.DiI—AcU)I|激发波长为 554rim,发射波长为571rim.利用具有较为 相近激发波长,但不同发射波长的两种荧光染 料对样品进行双标记,可以在LSCM上同时 得到两种荧光染料的荧光信号.在37?, BODIPYFI,u)L,DiI—AcU)L终浓度为 5mg/L和细胞负载约5h条件下,即可获得良 好的标记效果.由于LDL,AcLDL是通过细 胞膜上特异性受体介导的内吞作用而进入细胞 内的,因此BODIPYFL-LDL,D.I-AcLDL进 入细胞后不会发生外泄. 2.2两种受体活性的同时测定 激光扫描共聚焦显微镜系统采用激光扫描 原理,激光光源发出的光在入射光孔处发生会 聚.然后聚焦到样品的某一特定深度即某一特 定焦平面上其反射光再聚焦经出射光孔至成 象平面只有某一特定波长的出射光才能为光 电倍增管所检测并将信号级联放大.目前几乎 所有的LSCM都平行设置一个以上的通道, 荧光被分为两束,选用不同的滤光片可以在不 同波长处对发射荧光进行检测.以?)DIPY Fl,标记U)L,以Dil一标记AcLDL并选用 488IllTI激发波长,双通道分别选用515nm, 575rim的滤光片,可以在;CM系统清晰地 观察到LDL,AcLDL被细胞摄入后在细胞内 的分布情况(图2见图版I). 从图2左中可以看出在激发波长488nrn, 检测发射波长515rlrll条件下,BODIPYFL- LDL发绿色荧光;而在激发波长488nm,检 测发射波长575nlTl条件下,DiI—AcLDL发红 色荧光(图2右).这提示,在37?, c57BL/6J小鼠巨噬细胞用终浓度为5mg,L DiI-AcLDL和BODIPYFL—LDL负载5h左右, 即可获得良好的标记效果.细胞内的BODIPY FL-LDL(绿光)和DiI.AcLDL(红光)的激 光共聚焦图象说明,巨噬细胞膜上具有活性的 LDL受体和清道夫受体的存在,具有活性的 LDL受体和清道夫受体可同时摄取LDL及 AcU)L进入细胞内.由于BODIPYFLLDL, DiI-AcLDL进入细胞的量与细胞膜LDL受体 及清道夫受体活性成正相关性,因此,利用激 光扫描共聚焦显微镜系统的微机部分对图象信 号(即荧光强度)进行处理,根据荧光强度的 变化,可定量得出巨噬细胞膜上LDL受体, 清道夫受体的相对转运活性.LDL受体与清 道夫受体活性其总荧光强度(不)分别为 1321429,484349?.?同时我们还运用该方法测 定和比较了巨噬细胞及其泡沫化和凋亡过程中 LDL受体及清道夫受体活性的变化. 目前体外研究脂蛋白在细胞内的代谢以及 脂蛋白受体活性主要应用同位素I标记的脂 蛋白作为示踪剂,虽然该方法灵敏度高,但由 于放射性同位素对人体非常有害,并且要求严 密的防护措施,复杂的中间处理步骤以及严格 的废物处理过程使同位素标记这一方法繁琐. 而且.同位素测定的结果只是反映细胞群体的 变化,不能同时了解单细胞LDL受体及清道 夫受体活性的变化,更不能反映出LDL及 AcLDL被细胞摄入后在细胞内的分布情 况【,.本方法由于两种荧光探剂的使用并结 合LsCM技术使得在单细胞水平上同时测定 LDL受体及清道夫受体活性成为可能.迄今 还没有任何一种方法可以同时测定单细胞 LDL受体及清道夫受体的活性.因此,利用 荧光染料DiI—AcLDL,BODIPYFLLDL结合 LSCM同时测定LDL受体及清道夫受体活性 的方法明显优于同位素标记的测定方法.本方 法简便易行且灵敏度高,荧光配基用量可以小 到5mg/L,它可用于常规测定不同细胞的脂 蛋白受体介导的内吞作用的研究.这一方法对 于研究巨噬细胞泡沫化形成过程中,单细胞 LDL受体以及清道夫受体活性的变化提供了 一 种可行而有效的研究手段,对于探入探讨动 脉粥样硬化发病机理具有重要意义. 参考文献 1PitasRE,[nnerarityTL,MB11RWFe~rtcellsin 462?生物化学与生橱物理进展Prog.Bh哪.B ~plan?tsofathem~leroficrabbitaona5haverecorsfor beta-verylowdensitylit:~protelnsandmc~fiedlowdensity tipoproteirtsAtherk-em]emsis.1983.3(1):2,12 2BiIbeimerDW.HoYK.BrownMSGenetiesofthe towdensitylipopro?teir~sreceptorDiminishedreceptorac6v— ityinlyraphocytesfromheterc~ygoteswlthfamilialhyperc— holesterclemiaJc【inInvest,1978,61(3):678--696 3Vo.vt~JC.ViaDP.ButterfietdCEalIder~dfication and1sohtionofmdothelcetlshased?theirEncre~sed uptakeotacetytated—lowdensitylipoproteinJCellBlot. 1984,99(6j:2034,4(I 4BenneUtMW,CaulfiddJPSpecificbindingofhumanlow— densitylipoproteintothesurfaceofschlstc~omulaschisto- s0?rnansoniandingestionbytheparasiteAmJPatho1. 1991.138(5):1173,82 5PitasRE.Ex[m~ssionoftheaeety[1owdet~ityliw4~mteLn receptorbyrabbitfibrobhstsandsrnoothmusclecellsUp- regulationbyphc~hotestt~rs.JBidChem.1990.265 (21):12722,7 6TeupserD.TbieryJtWalliAKaf.1)etenninatic0aof LDL-az~Iscavetlger-reeeptoractivityinadherentnon— adherentculturedcellswithanelevngk-stepfluom~netrlo ayBiccbimNophysAeta,1996.13n3(3):193,198 SimultaneousDeterminationofLDL-and Scavenger-eeeeptorActivityinaSingle Macrophage.BIANXin,YANGXiao-yi, HUANGYou—guo(NationalLaboratoryof InstituteofBiophysics 丁kChineseAcademyofSciences,Beijing 100101,China) AbstractBycombinationoflaserscanningcon— focalmicroscopy(LSCM)andthehighlysensi— tivefluorescentdyesBoDIPYFL-LDLandDil— AcLDL.itispossiblethatactivitiesdbothLDL andscavengerreceptorsinasinglecellcanbe measuredsimultaneouslyandquantitativelyFor example,inC57BL/6Jmacrophage,itwas foundthatthecellswereincubatedfor5hat 37”Cwith5mg/LDil—AeLDLand5rng/L BoDIPYFL-LDLresultedinexcellentcolor imagingunderLSCM.theLDLreceptorwith greenandscavengerreoeptorwithredThehigh selectivityandvisulizationofthismethodprovide detailedinformationonthelocalizationandactiv— ityofbothreceptorsinasinglemacrophage.The rapidityandaccuracyofthisassayallowsits applicationforstudyingreceptor-mediated lipoproteinuptake. Keywolds1aNerscanningconfocalmicroscopy (LSCM),fluorenceselectivelabelling,low densitylipoproteinreceptor,scavengerreceptor 乳酸脱氢酶与酯酶同工酶同板染色法 ……,…删 0> 摘要介绍一种在同一块凝肢板上染乳酸脱氧酶(IJDH)与酯酶(EsT)的染色方法该同板染色法 利用两种同工酶显色反应互不干扰和颜色不同的特点,先染LDH.后染EST,可以在同一块肢板上得 到两种同工酶清晰的酶带,每一种酶的酶带与单板染色的酶带完全一样.这种染色法,能节省同工酶 分析所需的试剂,时间和经费,也便于样品的鉴定与比较,是一种经济有效的方法.此方法,同样适用 于苹果酸脱氢酶(MDH)与醋酶等同工酶的同板染色 关键词捌遭:盛醢,,匣望 学科分类号(155 收稿Et期:19974)9-15.修回日瓶l199g-01.12