[doc] 体外转录法制备小反刍兽疫病毒荧光定量RT—PCR检测标准阳性模板

[doc] 体外转录法制备小反刍兽疫病毒荧光定量RT—PCR检测阳性模板 体外转录法制备小反刍兽疫病毒荧光定量 RT—PCR检测标准阳性模板 中国动物检疫2008年第25卷第12期@嘲一28一 体外转录法制备小反刍兽疫病毒 荧光定量RT—PCR检测标准阳性模板 赵文姬1l2,包静月’,李林’,王志亮 (1.中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心,山东青岛266032; 2.扬州大学兽医学院,江苏扬9’I,I225009) 摘要:针对小反刍兽疫病毒的F基因了一对荧光定量RT—PCR的引物和探针.在正向引物的5端加上 T7启动子后与反向引物扩增小反刍兽疫病毒株Nigeria75/1细胞培养液RNA.切胶回收目的条带作为体外转录 模板.体外转录后测RNA浓度以及OD值.线性试验和特异性试验结果明,该模板具有良好的线性范围和特异 性.当稀释度为4.9x108~4.9x103拷贝/L时,相关系数为0.999.该模板稳定性好.一80cIC保存一个月后无显着变化 对起始浓度为4.9×10,4.9×10s,4.9×10拷贝/Ixl的标准品分别检测10次,变异系数分别为1.09%,1.47%.1.34%.表明 以此模板进行荧光定量PCR具有较好的重复性 关键词:小反刍兽疫病毒:体外转录:实时定量RT—PCR 中图分类号:$862.659.5文献标识码:A文章编 号:1005—944X(2008)12-0028—03 InVitroTranscriptionforPreparation QuantitativeReverseTranscriptasePCR RuminantsVirus ofStandardPositiveTemplateforReal-Time (qRT-PCR)fortheDetectionofPestedesPetits ZhaoWenji,BaoJingyue,”Lin,WangZhiliang (1.NationalDiagnosticCenterforExoticAnimalDiseases,ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,Qingdao Shandong266032;2.CollegeofVeterinaryMedicine,YangzhouUniversity,YangzhouJiangsu225009) Abstract:PrimersandprobeforqRT—PCRweredesignedbasedonthefusion proteingenesequenceofPPR virus.RNAextractedfromthecellcultureinfectedwithPPRVvaccinestrainNigeria75/1wasamplifiedbyusing theforwardprimeraddedwithT7promoteratthe5terminalandreverseprimer,andthePCRproductswerere. claimedastheinvitrotranscriptiontemplate.Afterinvitrotranscription.0Dvaluewasdetected.Thetemplate showedgoodlinearityandspecificity.Thecorrelationcoemcientis0.999whe nthetemplatewasdilutedto4.9×lO0, 4.9x10copies/~L.Afterstoringat一 80oCforonemonth.thetemplatewasalsostableasbefore.Andthecoefficient experimentalreproducibilityrangedfrom1.09 ofvariationvalueforintra— %to1.47%,showinganexcellentrepeti— tivenessofthetemplate. Keywords:pestedespetitsruminantsvirus;transcriptioninvitro;one-steprea l-timeqRT-PCR 小反刍兽疫fPestedesPetits Ruminants.PPR)是一种感染小反刍 兽f特别是山羊和绵羊)的严重的烈 性,接触性传染病,临床上以高热,坏 死性胃炎,胃肠炎和肺炎为特征.发 病率和死亡率分别高达100%和 90%该病流行于非洲的赤道到撒哈 拉地区,大部分中东国家和印度,尼 泊尔等与我国接壤的南亚国家.近年 来呈蔓延的趋势2007年7月.我国 西藏阿里地区首次暴发PPR.作为一 种重大的跨国动物疫病.PPR严重威 胁着我国的动物卫生安全 聚合酶链式反应是高度灵敏,专 一 性强的定性方法.也是一种对核酸 分子进行定量的有效工具各国研究 者先后建立了针对N基因的RT一 洼用于PPR的病原检测【l_.I,但 通讯作者:王志亮 是普通RT—PCR方法都需要通过凝 胶电泳来分析PCR扩增产物.耗时较 长.不适合大批量样品处理近年来发 展的一步法实时定量PCR方法以其 快速,简便,适合大规模化的优点,越 来越多的应用于动物疫病的病原诊断 [4-6] .2007年.包静月等建立了针对N 基因的一步法实时定量荧光RT-PCR 检测PPRV.该法特异性强.灵敏性 高.具有很高的I临床诊断应用价值同 研究表明.定量PCR的质量保证最为 重要的一个因素就是标准品的使用. 定量结果的准确性在很大程度上依赖 于标准品的准确性.因此定量标准品 的制备就显得尤为重要本文以 PPRVRNA定量标准品的构建为例 介绍一种既简单快速又准确可靠的 RNA定量标准品的制备方法 1材料与方法 1.1生物材料 PPRVNigeria75/1疫苗株细胞 培养液由本中心提供犬瘟热病毒 (CDV)细胞培养液由本中心提供健 康羊组织从青岛市胶南地区采集 1.2主要试剂和仪器 Trizol试剂和荧光定量RT—PCR 试剂盒购自Invitrogen公司.胶回收 试剂盒购自QIAGEN公司.RiboDrobe InvitroTranscriptionSystems购自 Promega公司.普通RT—PCR试剂盒 购自Takara公司荧光定量PCR仪 为美国ABI公司的7500核酸蛋白 分析仪为AlphaMaster公司产品 1.3引物和探针设计 根据PPRV毒株Turkev2o0O的 F蛋白基因fGenBankNo.NC一 006383)序列,利用MegAlignfDNAS. tar)软件~ClustalW程序.与其他不同 一 29一中国动物检疫2008年第25卷第l2期 PPRV毒株的F基因片段序列 (EU267274EU267273NC-006383 EU344743,EU344740,AY560591进行 比对.选择高度保守的区域设计一对 引物和Taqman探针探针5端标记有 荧光基团6一羧基荧光素f6_ca卜 boxyfluoreseein,FAM).3端标有荧光 淬灭基团6-羧基四甲基诺丹明f6_car- boxy—N,N,NN-tetramethylrhodamine. TAMRA1此外.在上游引物PPRF5F 的5端引入1v7启动子.即PPRF5FT7 引物和探针由上海生工生物工程公司 合成引物和探针序列见表1 PCR定量RTCR反应体系为25 L,每个反应3个重复.加入提取的 RNA模板或cRNA标准品5L,Invit. rogen公司的SuperscriptIII一步法 RT,PCR反应混合液12.5L,Invitro. gen公司的SuperscriptIII反转录酶与 PlatinumTaqDNA聚合酶混合液0.5 L,正向和反向引物(1oixM)各1L. TaqMan探针f】0M)0.5txL,Takara公 司的RNase抑制剂1L,其余体积用 Takara公司的无RNase的水补齐扩 增和检测反应条件为:50?反转录 15rain.95~CPCR预变性5rain.然后进 表1荧光定量RT-POR所用引物和探针 序列名称序列 GTGCGTCAGTTTTGTGCAA ATCCACCTCAACTACAGGACACT FAM一5一CACAACGGAGACAGTCATCA一3’一TAMRA TAATAC(C丁CACTA丁AGGGCGAGTGCG下CAGT丁 TTGTGCAA 1.4RNA提取和体外转录模板制备 病毒细胞培养液取200~1.组织 取100mg.用Trizol法提取RNA(按 说明书操作)以提取的RNA为模 板.PPRF5m.PPRF6R为引物扩增 的目的片段即为体外转录模板反应 液用Takara公司的普通PCR试剂 盒.扩增条件为:50?反转录30min: 95?预变性5min;94?20s,55?30s. 72c【=30s.35个循环.最后72qc延伸 10minPCR产物用1.5%的琼脂糖凝 胶电泳.凝胶成像观察结果切下阳 性条带.用胶回收试剂盒回收目的片 段.用核酸蛋白分析仪定量. 1.5cRNA标准品的合成 取200ngPCR产物按照Ribo一一 ? probeInvitroTranscriptionSystems 的说明进行体外转录产物经DNase I酶消化,3MNaAc乙醇沉淀.溶解 于适量DEPC处理过的水中用核酸 蛋白紫外分析仪准确定量(连续测定 5次.取均值).用公式换算成拷贝/ l,并进行10倍系列稀释,分装作为 标准品.一80?冻存. 换算公式为:f6.02x10z拷贝/mo1) ×f浓度g/m1)/(MWg/mo1)=拷贝/ml 1.6cRNA标准品特异性和线性试 验 Trizol法提取CDV细胞培养液 RNA和健康羊组织RNA用提取的 RNA以及本试验室体外转录合成的牛 瘟病毒(RPV)的cRNA为模板并以空 白作为对照与本实验合成的10倍系 列稀释的cRNA标准品f浓度分别为 4.9xl08,4.9~107,4.9~106,4.9xlO5,4.9X 104,4.9xlO3拷贝L)进行定量RT一 行40个循环的扩增f94c(=15s.60? 30s).在60?30s的时候收集荧光信 号. 1.7cRNA标准品稳定性试验 取4批浓度的4.9xlO7,4.9×104 拷贝/IxL的cRNA标准品.分别在第 1,10,30天以荧光定量PCR检测4 批不同浓度的cRNA样品.每浓度重 复测定10次.以Ct值的变化作为评 价样品稳定性的指标分别重复10 次检测标准品含量为4.9xlOs,4.9× l0,4.9×l0拷贝/iLL的样品,评价本 样品检测的重复性 2结果 2.1电泳检测PCR扩增产物 以Trizol提取的RNA为模板.用 PPRF5FT7.PPRF6R为引物.经PCR 扩增后应得123bp长的片段.经1.5% 琼脂糖凝胶电泳.结果显示扩增出的 带1_7启动子的目的片段大小与预期 值相符合f图l1. 2.2cRNA标准品浓度测定 体外转录的cRNA经核酸蛋白 测定仪测定.其质量浓度为368.6ng/ }xL,D260nn1/D280I1m为2.04,符合纯度 要求.根据公式计算可知.所得标准 品的溶液浓度可以换算为拷贝/L, 将其分别稀释为4.9xlOn,4.9~100拷 贝/?L,一80?小管分装保存. 2.3cRNA标准品特异性和线性试 验 以4.9×108_4.9~103拷贝/uL的 cRNA标准品作为模板.同时以提取 的非靶RNA及空白对照为模板进行 实时荧光定量分析.结果表明非靶模 板和空白反应无荧光曲线扩增.表明 合成的cRNA标准品具有良好的检 测特异性.当其稀释度为4.9x108, 4.9xlO拷贝/IxL时.相关系数r= 0.999,具有很高的线性关系阍2). CycleNumber 1:4.9x10S-~}贝/L;2:4.9x10拷贝/L; 3:4.9×1拷贝/L;4:4.9x10拷贝/L; 5:4.9x10拷贝/L;6:4.9x1()3拷贝/L; 7:犬瘟热病毒;8:牛瘟病毒;9:键康羊组 织:10:空白对照 图2PPRVaR卜PCR的线性试验和特异性试验 2.4cRNA标准品稳定性试验 不同浓度的cRNA标准品在冷 冻条件下有较好的稳定性.对4管不 同浓度的cRNA标准品在不同时间 所测的Ct值无显着性差异f表21对 起始浓度为4.9x106,4,9x10,4.9xl04 拷贝/IxL的cRNA标准品分别检测 10次,统计其变异系数分别为: 1.09%,1.47%.1.34%表示此方法具 有良好的准确性和重现性 3讨论 标准曲线对病毒的定量结果非 常重要.有的研究者直接以病毒颗粒 作为标准品.虽然病毒颗粒与待测样 品有很好的相似性.但是标准品介质 用什么介质溶解.以什么方式提取核 酸等问题都会影响标准曲线的稳定性 [8-1q内对照法能消除PCR干扰因素的 影响.但由于同时扩增两种模板.使检 测的线性范围大为减少.往往只有2,3 个数量级.而且反应体系中不同模板 扩增效率的不一致.会影响到目的基 因在单位时间内的产量发生变异.从 阱盯一 中同动物检疫2008年第25卷第l2期一30一 表2冷冻保存的cRNA标准品再不同时间测得的Ct值(平均值?标准 差) 而影响定量结果的准确性【l1,131对于 RNA病毒定量的标准品通常采用质 粒.不能很好的对样品处理及逆转录 过程进行有效控制本研究中制备体 外转录模板时.通过在引物合成时直 接在上游引物的5端加上,I17启动子. 扩增的片段中的5端含有rI7启动子. 可以直接用1”7RNA聚合酶进行体外 转录.避免了以往质粒标准品制备过 程中片段克隆等过程.大大简化了标 准品的制备过程 实时定量RT—PCR操作简单.快 速高效.具有较高的灵敏度和特异 性.并且不需要PCR后处理.大大降 低了污染的可能性.因其显着的优越 性.不仅已广泛地应用于分子生物学 的各个领域.而且也开始作为一种诊 断技术应用于临床.尤其是病毒含量 的检测本研究制备的标准品.稳定性 好.具有良好的特异性和稳定性.为 建立PPRV荧光定量RT—PCR检测 方法奠定了基础 参考文献 f11LibeauG.PrehaudC,LancelotR,et a1.DevelopmentofacompetitiveELISA fordetectingantibodiestothepestedes petitsruminantsvirususingarecombi- nantnucleoprotein[J1.ResVetSci, 1995,58(1):50—55. 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