食品中单增李斯特菌检测

食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测 实验目的 1）了解单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性。 2）熟悉单核细胞增生李斯特氏菌的分离鉴定。 基本原理 单核细胞增生李斯特菌 (L. monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌。李斯特菌是一种细胞内寄生菌，它不仅可能存在于肉类产品中，也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海产品等日常食物里面。此菌广泛分布于自然界中，在土壤、排污下水、地水、青贮饲料、烂菜中均可分离到。人也可作为无症状携带者。据报道，健康人粪便中该菌的携带率为0.6％～16％，4％～8％的水产品、5％～10％的奶及其制品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。李斯特菌能在1～45℃的温度下生存，能在家用电冰箱的冷藏室内较长时间生长、繁殖。 该菌为革兰氏阳性短杆菌，有的菌体略弯曲，两端钝圆，大小约为0.4～0.5µm ´ 0.5～2.0µm。多单在，有时是V字型排列。  无芽孢，不产生荚膜。在陈旧培养物中或粗糙型菌落的菌体长度可达6～20µm或更长的丝状。在20～25℃培养时可产生2～4根鞭毛而运动，但在37℃培养时鞭毛发育不良，无运动性。 本菌需氧或兼性厌氧，生长温度为1～45℃，最适温度为30～37℃。对营养要求不高，可在普通琼脂培养基中生长，但在血琼脂培养基或胰酪胴琼脂上生长更好。加入0.2％～1％(W/V)的葡萄糖及2％～3％(V/V)的甘油生长更佳。在含1%(W/V)NaCl的复合培养基中能生长。在4℃可缓慢增殖，形成菌落约需7d。 在液体培养基中培养18～24h后，肉汤呈轻度均匀混浊，数天后形成粘稠沉淀附着于管底，摇动时沉淀呈螺旋状，继续培养可形成颗粒状沉淀。不形成菌环、菌膜。 在营养琼脂上，光滑(S)型可形成直径0.5～1.5mm、圆形、露滴状半透明、低隆起、边缘整齐、表面有细致纹理的蓝灰色菌落，斜射光照射时，菌落呈特征性蓝绿光泽。粗糙（R）型菌落表面起伏不平，边缘不整齐，细菌难以乳化。 在血液琼脂培养基上，可形成狭窄的β-溶血环，常不超出菌落边缘，移去菌落才可见。弱溶血或疑似溶血菌株可用协同溶血试验(CAMP)鉴定。 半固体培养基：沿穿刺线呈云雾状，随后缓慢扩散，在培养基表面下3～5mm处呈伞状。 该菌接触酶阳性，氧化酶阴性。能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、果糖、海藻糖、乳糖、鼠李糖、麦芽糖、山梨糖，不发酵木糖、阿拉伯糖、棉子糖、蔗糖、甘露醇、蜜二糖、菊糖、纤维二糖和侧金盏花醇。不利用枸橼酸盐。不还原硝酸盐，不产生靛基质和硫化氢。甲基红及VP试验呈阳性。不液化明胶和凝固血清。可水解七叶苷和马尿酸钠。 实验材料 仪器  恒温培养箱：30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃；均质器；显微镜：10×～100×；电子天平：感量0.1 g ；锥形瓶：100 mL、500 mL；无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）；无菌平皿：直径90 mm； 无菌试管：16 mm×160 mm；离心管：30 mm×100 mm；无菌注射器：1 mL；金黄色葡萄球菌（ATCC25923）；马红球菌（Rhodococcus equi） 单增李斯特氏菌(L.monocytogenes)、伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii）、英诺克李斯特氏菌(L.innocua) 培养基和试剂   含0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）；含0.6 %酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）；李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）；盐酸吖啶黄（acriflavine HCl）溶液：见附录A 中A.3.2.1；1 %萘啶酮酸钠盐（naladixic acid）溶液；PALCAM 琼脂；革兰氏染液；SIM 动力培养基；缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P 试验用]；5 %～8 %羊血琼脂：；糖发酵管；过氧化氢酶试验；李斯特氏菌显色培养基。 样品：鲜肉、鲜奶、蔬菜等 实验内容 实验路线图： 1 增菌 以无菌操作取样品25 g（mL）加入到含有225 mL LB1 增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续 均质1 min～2 min；或放入盛有225 mL LB1 增菌液的均质杯中，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2min。于30 ℃±1 ℃培养24 h，移取0.1 mL，转种于10 mL LB2 增菌液内，于30 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 2 分离 取LB2 二次增菌液划线接种于PALCAM 琼脂平板和李斯特氏菌显色培养基上，于36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在PALCAM 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；典型菌落在李斯特氏菌显色培养基上的特征按照产品说明进行判定。 3 初筛 自选择性琼脂平板上分别挑取5 个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于36℃±1 ℃培养24 h；同时在TSA-YE 平板上划线纯化，于30 ℃±1 ℃培养24 h～48 h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。 4 鉴定 4.1 染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4 μm～0.5 μm）×（0.5 μm～2.0 μm）； 用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。 4.2 动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。 4.3 生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP 试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。 4.4 溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20 个～25 个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36 ℃±1 ℃培养24 h～48h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。 4.5 协同溶血试验 (cAMP)：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌， 挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30 ℃±1 ℃培养24h～48 h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。 表1.单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征表 实验结果 根据培养基培养结果和生化试验及溶血试验结果报告你所检测的食品中是否有单核细胞增生李斯特氏菌。 ： 注意在试验中用已知阳性菌和阴性菌进行对照验证实验操作正确与否。 思考： 1. 单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征有哪些？与英诺克李斯特氏菌有何区别？ 2.单核细胞增生李斯特氏菌可能存在在哪些食品中，冷藏食品中是否有存在可能？ 3.单核细胞增生李斯特氏菌有哪些危害？日常生活中如何进行防控？ 参考文献: [1] 中华人民共和国卫生部.GB 478930-2010 食品安全国家 食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验.北京:中国标准出版社,2010. [2] 李平兰,贺稚非.食品微生物学实验原理与技术[M].北京:中国农业出版社,2005. 附录： A.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE) A.1.1 成分 胰胨 17.0 g 多价胨 3.0 g 酵母膏 6.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.2～7.4 A.1.2 制法 将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。 A.2 含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE) A.2.1 成分 胰胨 17.0 g 多价胨 3.0 g 酵母膏 6.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钾 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.2～7.4 A.2.2 制法 将上述各成分加热搅拌溶解，调节pH，分装，121 ℃高压灭菌15 min，备用。 A.3 李氏增菌肉汤(LB1，LB2) A.3.1 成分 胰胨 5.0 g 多价胨 5.0 g 酵母膏 5.0 g 氯化钠 20.0 g 磷酸二氢钾 1.4 g 磷酸氢二钠 12.0 g 七叶苷 1.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.2～7.4 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A.5.2 革兰氏碘液 A.5.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.5.2.2 制法 将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。 A.5.3 沙黄复染液 A.5.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95％乙醇 10.0 mL 蒸馏水 90.0 mL A.5.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A.5.4 染色法 A.5.4.1 将纯培养的单个可疑菌落涂片，火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗。 A.5.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。 A.5.4.3 滴加95％乙醇脱色，约15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。 A.5.4.4 滴加复染液，复染1 min，水洗、待干、镜检。 A.6 SIM 动力培养基 A.6.1 成分 胰胨 20.0 g 多价胨 6.0 g 硫酸铁铵 0.2 g 硫代硫酸钠 0.2 g 琼脂 3.5 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.2 A.6.2 制法 将上述各成分加热混匀，调节pH，分装小试管，121 ℃高压灭菌15 min，备用。 A.6.3 试验方法 挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺接种到SIM 培养基中，于30 ℃培养24 h～48 h，观察结果。 A.7 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR 和VP 试验用) A.7.1 成分 多胨 7.0 g 葡萄糖 5.0 g 磷酸氢二钾 5.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.0 A.7.2 制法 溶化后调节pH，分装试管，每管1 mL，121 ℃高压灭菌15 min，备用。 A.7.3 甲基红（MR）试验 A.7.3.1 甲基红试剂 A.7.3.1.1 成分 甲基红 10 mg 95 %乙醇 30 mL 蒸馏水 20 mL A.7.3.1.2 制法 10 mg 甲基红溶于30 mL 95 %乙醇中，然后加入20 mL 蒸馏水。 A.7.3.1.3 试验方法 取适量琼脂培养物接种于本培养基，36 ℃±1 ℃培养2 d～5 d。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结 果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。 A.7.4 V-P 试验 A.7.4.1 6 % α-萘酚-乙醇溶液 成分及制法：取α-萘酚6.0 g，加无水乙醇溶解，定容至100 mL。 A.7.4.2 40 %氢氧化钾溶液 成分及制法：取氢氧化钾40 g，加蒸馏水溶解，定容至100 mL。 A.7.4.3 试验方法 取适量琼脂培养物接种于本培养基，36 ℃±1 ℃培养2 d～4 d。加入6% α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL 和 40 %氢氧化钾溶液0.2 mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴 性，应放在36 ℃±1 ℃继续培养4 h 再进行观察。 A.8 血琼脂 A.8.1 成分 蛋白胨 1.0 g 牛肉膏 0.3 g 氯化钠 0.5 g 琼脂 1.5 g 蒸馏水 100 mL 脱纤维羊血 5 mL～10 mL A.8.2 制法 除新鲜脱纤维羊血外，加热溶化上述各组分，121 ℃高压灭菌15 min，冷到50 ℃，以无菌操作加 入新鲜脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。 A.9 糖发酵管 A.9.1 成分 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 3.0 g 磷酸氢二钠(Na2HPO4⋅12H2O) 2.0 g 0.2 %溴麝香草酚蓝溶液 12.0 mL 蒸馏水 1 000 mL A.9.2 制法 A.9.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5 %加入葡萄糖,分装于有一个倒置小管的小试管内， 调节pH 至7.4，115 ℃高压灭菌15 min，备用。 A.9.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100 mL，115 ℃高压灭菌15 min。另将各 种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。将5 mL 糖溶液加入于100 mL 培养基内，以无菌操作分装 小试管。 A.9.3 试验方法 取适量纯培养物接种于糖发酵管，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察结果，蓝色为阴性，黄色为阳 性。 A.10 过氧化氢酶试验 A.10.1 试剂 3%过氧化氢溶液：临用时配制。 A.10.2 试验方法 用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落, 置于洁净试管内，,滴加3 %过氧化氢溶液2 mL，观察 结果。 A.10.3 结果 于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。