实验八果蔬中维生素C的提取和定量测定(26-二氯酚靛酚滴定法)

实验八果蔬中维生素C的提取和定量测定(26-二氯酚靛酚滴定法) 实验八 果蔬中维生素C的提取和定量测定(2,6-二氯酚靛酚滴定 法) 【原理】 1.学习并掌握定量测定维生素C的原理和方法。 2.了解蔬菜、水果中维生素C含量情况。 维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，缺少它时会产生坏血病，因此又称为抗坏血酸(ascorbic acid)。它对物质代谢的调节具有重要的作用。近年来，发现它还有增强机体对肿瘤的抵抗力，并具有化学致癌物的阻断作用。 维生素C是不饱和多羟基物，属于水溶性维生素。它分布很广，许多水果、蔬菜中的含量更为丰富。 维生素C具有很强的还原性。还原型抗坏血酸能还原染料2,6-二氯酚靛酚(DCIP)，本身则氧化为脱氢型。在酸性溶液中，2,6-二氯酚靛酚呈红色，还原后变为无色。因此，当用此染料滴定含有维生素C的酸性溶液时，维生素C尚未全部被氧化前，则滴下的染料立即被还原成无色。一旦溶液中的维生素C已全部被氧化时，则滴下的染料立即使溶液变成粉红色。所以，当溶液从无色变成微红色时即表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。如无其它杂质干扰，样品提取液所还原的染料量与样品中所含还原型抗坏血酸量成正比。 【试剂和器材】 一、试剂 2%草酸溶液: 草酸2g溶于100mL蒸馏水中。 1%草酸溶液: 草酸1g溶于100mL蒸馏水中。 标准抗坏血酸溶液(1mg/mL): 准确称取100mg纯抗坏血酸(应为洁白色，如变为黄色则不能用)溶于1%草酸溶液中，并稀释至100mL，贮于棕色瓶中，冷藏。最好临用前配制。 0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液: 250mg 2,6-二氯酚靛酚溶于150mL含有52mg NaHCO，冷却后加水稀释至250mL，贮于棕色瓶中冷藏(4?)约可保存的热水中3 一周。每次临用时，以标准抗坏血酸溶液标定。 二、:水果、蔬菜 三、器材 研钵，组织匀浆器，吸量管，抽滤设备，离心机，滤纸，容量瓶，滴定管，锥形瓶。 【操作方法】 1 一、提取 水洗干净待测的新鲜蔬菜或水果，用纱布或吸水纸吸干表面水分。然后称取20g，加入10—20mL 2%草酸，研磨成浆状，抽滤，合并滤液，滤液总体积定容至50mL。或者研磨后以2%草酸洗涤离心(4000r/min，10min)2—3次，合并上清液于50mL容量瓶中，定容至刻度。 二、标准液滴定 准确吸取标准抗坏血酸溶液1mL置100mL锥形瓶中，加9mL 1%草酸，以0.1% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并保持15秒不褪色，即达终点。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少毫克抗坏血酸(取10mL 1%草酸作空白对照，按以上方法滴定)。 三、样品滴定 准确吸取滤液两份，每份10mL, 分别放入2个锥形瓶内，滴定方法同前。另取10mL 1%草酸作空白对照滴定。 【计算】 (V-V)×C×T×100 AB 维生素C含量(mg/100g样品)= ??????????????? W D× 式中:VA为滴定样品所耗用的染料的平均毫升数; VB为滴定空白对照所耗用的染料的平均毫升数; C为样品提取液的总毫升数; D为滴定时所取的样品提取液毫升数; T为1mL染料能氧化抗坏血酸毫克数(由操作二计算出); W为待测样品的重量(g)。 【注意事项】 (1) 某些水果、蔬菜(如橘子、西红柿等)浆状物泡沫太多，可加数滴丁醇或辛醇。 (2) 整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1mL或多于4mL，如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改变提取液稀释倍数。 (3) 本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下，干扰物反应进行得很慢。 (4) 2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1%草酸无此作用。 (5) 干扰滴定因素有: 若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白陶土脱色，或加1mL氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红色。 ，，，22Fe可还原二氯酚靛酚。对含有大量的样品可用Fe8%乙酸溶液代替草酸溶液提取，此时不会很Fe2快与染料起作用。 样品中可能有其它杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏血酸慢，因而滴定开始时，染料要迅速加入，而后尽可能一点一点地加入，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于15秒内不消退为终点。 【思考题】1(为了测得准确的维生素C含量，实验过程中都应注意哪些操作步骤,为什么, 2 2(试简述维生素C的生理意义。 【小资料】 一、维生素C 维生素C是人类膳食中必需的维生素之一，如果缺乏维生素C，将导致坏血病发生。因此，维生素C又称为抗坏血酸，有防治坏血病的功效。抗坏血酸在自然界分布十分广泛，存在于新鲜水果和蔬菜中，尤其是柠檬果实和一些绿色植物(如青辣椒、菠菜等)中含量特别丰富。 抗坏血酸在机体同具有广泛的生理功能，已知体内许多重要物质的代谢反应都需要抗坏血酸的参与。它是脯氨酸羟基化酶的辅酶，故有增进胶原蛋白合成的作用。机体中许多含疏基的酶，需要依赖于作为还原剂的抗坏血酸的保护，使酶分子的疏基处于还原状态，从而维持其催化活性。由于抗坏血酸的氧化还原作用，它可促进免疫球蛋白的合成，增强机体的抵抗力。同时还能使氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽(简称GSH)，而GSH可与重金属结合而排出体外，因此维生素C常用于重金属的解毒。此外，抗坏血酸尚有许多其他生理功能，但其作用机理还不十分清楚。抗坏血酸是一种不饱和的多羟基内酯化合物，稍有酸味的糖类白色晶体，易溶于水，故属于水溶性维生素。在溶液中其分子内C2和C3之间的烯 +醇式羟基上的氢极易解离并释放出 ，而被氧化成 H脱氢抗坏血酸，氧化后仍具有维生素C的生理活性，但它易分解为二酮古洛糖酸，此化合物不再具有维生素C的生理活性。维生素C有很强的还原性，在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，易被氧化而破坏。还原型和氧化型抗坏血酸可以互相转变，在生物组织中自成一氧化还原系统。 由于维生素在营养学和临床方面的重要意义，故对食物和生物材料中维生素含量的测定是十分必须的。抗坏血酸的定量测定方法很多，有2,6—二氯酚靛酚(简称DCIP)滴定法、碘滴定法、2,4—二硝基苯肼法、 Folin试剂比色法、紫外吸收法等。其中广泛采用的是DCIP 滴定法，它具有简便、快速、比较准确等优点，适用于许多不同类型样品的分析。缺点是不能直接测定样品中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的含量，易受其他还原物质的干扰。如果样品中含有色素类物质，将给滴定终点的观察造成困难。在酸性环境中，抗坏血酸(还原型)能将染料2,6—DCIP还原成无色的还原型2,6—DCIP，而抗坏血酸则被氧化成脱氢抗坏血酸。氧化型2,6—DCIP在中性或碱性溶液中呈蓝色，但在酸性溶液中则呈粉红色。因此，当用2,6—DICP滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸未被全部氧化前，滴下的2,6—DCIP 立即被还原成无色，一旦溶液中的抗坏血酸全部被氧化时，则滴下微量过剩的2,6—DCIP 便立即使溶液显示淡粉红色或微红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化。依据滴定时2,6—DCIP 标准溶液的消耗量 (ml)，可以计算出被测样品中抗坏血酸的含量。氧化型2,6—DCIP与还原型抗坏血酸常在稀草酸或偏磷酸溶液中进行反应。即先将样品溶于一定浓度的酸性溶液中或经抽提后，再用2,6—DCIP标准溶液滴定至终点。 食物和生物材料中常含有其他还原物质，其中有些还原物质可使2,6—DCIP还原脱色。为了消除这些还原物质对定量测定的干扰，可用抗坏血酸氧化酶处理，破坏样品中还原型抗坏血酸后，再用2,6—DCIP 滴定样品中其他还原物质。然后从滴定未经酶处理样品时2,6—DCIP标准溶液的总消耗量中，减去滴定非抗坏血酸还原物质2,6—DCIP 标准溶液的消耗量，即为滴定抗坏血酸实际所消耗的2,6—DCIP标准溶液的体积，由此可以计算出样品中抗坏血酸的含量。另外，还可利用抗坏血酸和其他还原物质与2,6—DCIP反应速度的差别，并通过控制样品溶液在pH1 — 3 范围内，进行快速滴定，可以消除或减少其他还原物质的作用，一般在这样的条件下，干扰物质与2,6—DCIP的反应是很慢的或受到抑制。生物体液(如血液、尿等)中的抗坏血酸的测定比较困难，因为这些样品中抗坏血酸的含量很低，并且存在许多还原物质的干扰，同时还必须预先进行脱蛋白处理。在生物体液中含有巯其、亚硫酸盐及硫代硫酸盐等物质，它们都能与DCIP反应，但反应速度比抗坏血酸慢得多。样品中巯基物 3 质对定量测定的干扰，通常可以藉加入对—氯汞苯甲酸(简称PCMB)而得到消除。 二、坏血病 几百年前的欧洲，长期在海上航行的水手经常遭受坏血病的折磨，患者常常牙龈出血，甚至皮肤淤血和渗血，最后痛苦地死去，人们一直查不出病因。奇怪的是，只要船只靠岸，这种疾病很快就不治而愈了。水手们为什么会得坏血病呢, 一位随船医生通过细心观察发现，水手在航海中很难吃到新鲜的水果和蔬菜。这位医生试着让水手天天吃一些新鲜的柑橘，奇迹出现了——坏血病很快就痊愈了。那么，柑橘为什么会有如此神奇的本领呢,经过长期的研究，科学家后来从新鲜的水果和蔬菜中提取出维生素C(又叫抗坏血酸)，并证实坏血病就是维生素C缺乏症。 疾病简介 坏血病(scurvy)，由维生素C缺乏引起，所以维生素C缺乏病主要是指坏血病。但维生素C缺乏不仅能引起坏血病，还与炎症、动脉硬化、肿瘤等多种疾患有关。坏血病在历史上曾是严重威胁人类健康的一种疾病。过去几百年间曾在海员、探险家及军队中广为流行，特别是在远航海员中尤为严重，故有“水手的恐怖”之称。关于坏血病的明确记载始于十三世纪十字军东征时代，有的学者追溯至公元前希波克拉底(Hippocrates)时代。另据称，在原始社会人类的遗体上也曾发现坏血病的遗迹。关于坏血病的防治，早在17-18世纪就已经发现可以利用新鲜蔬菜、柑桔及柠檬等防治。1753年Lind的坏血病名著问卷心菜、肾上腺中提取出抗坏血病物质——“已糖醛酸”(hexuronic acid)。与此同时，它的化学结构，1933年Reichstein人工合成成功，从而，人类终于征服了坏血病。但有关维生素C的理论和应用的研究则远未结束。 病因和发病情况: 主要由于食物中缺乏维生素C而致病，人工哺乳婴儿及成人食物中长期缺乏新鲜果蔬(嗜酒、偏食等)、或长期感染对维生素C需要量增多时，可患本病。 症状: 维生素C缺乏后数月，患者感倦怠、全身乏力，精神抑郁、虚弱、厌食、营养不良，面色苍白，牙龈肿胀、出血，并可因牙龈及齿槽坏死而致牙齿松动、脱落，骨关节肌肉疼痛，皮肤淤点、淤斑，毛囊过度角化、周围出血，小儿可因骨膜下出血而致下肢假性瘫痪、肿胀、压痛明显、髋关节处展，膝关节半屈，足外旋，蛙样姿势。 预防: (1)选择含维生素C丰富的食物，改进烹调方法，减少维生素C在烹调中丧失。人工喂养婴幼儿应添加含维生素C食物或维生素C。疾病，手术后，吸烟者、口服避孕药时、南北极地区工作者均应适当增加维生素C摄入量。 (2)对症处理 如保持口腔清洁，预防或治疗继发感染，止痛，有严重贫血者可予输血，给铁剂。重症病例如有骨膜下巨大血肿，或有骨折，不需要手术治疗，用维生素C治疗后血肿可渐消失，骨折自能愈合。 4