甲型流感病毒检测步骤

甲型流感病毒核酸检测步骤 所用仪器与试剂盒：实时荧光定量PCR仪、Simply P总RNA提取试剂盒 试剂盒组成： Component Amount Solution R1 20ml Solution R2 60ml Wash buffer 30ml(使用前加入90ml无水乙醇) Elution Buffer 20 Spin columns 100 需要的配套设备和材料 无菌无酶的1.5ml离心管          无菌无酶的各种规格移液器吸头 离心机（最大转速〉14000rpm）  无酶无水乙醇   操作步骤： 1、 样品预处理 a）抗凝全血 直接取全血（≤100μｌ）加等量的Solution R1，振荡混合30s，室温静置1min，放入1.5ml离心管中进行下一步。 b）白细胞 全血取出后尽快离心（3000rpm×10min）吸取白膜层，或用红细胞裂解液／淋巴细胞分离获取白细胞进入下一步。 c）组织块 取不大于30mg组织，于液氮中研磨，取出放入1.5ml离心管中进入下一步。 d）液体及其它液体样本（尿液，腹水，胸水，脑积液等） 可以直接取样本100μｌ放入1.5ml离心管中进入下一步。 e）细菌 取适量细菌培养液（最多2×10＾6个细菌），离心5000rpm×1min，弃去上清。加入100μｌSolution R1，振荡混合30s，室温静置1min，进入下一步。 2、 处理好的样品中，加入Solution R2 600μｌ充分振荡混匀，室温静置3-5min，此步骤不可离心，取上清时尽量避免吸到悬浮杂质，以避免下步离心时堵塞离心柱。 3、 将上清液吸入Spin columns，Spin columns要套上离心管离心30s。 4、 弃去外管中液体，向Spin columns中加入600μｌWash buffer，离心30s弃去接液管中液体，重复洗涤一次，然后空柱于10000rpm离心1min后将离心柱转移到一个新1.5ml离心管。 5、 将Spin columns移入新的1.5ml离心管中，在膜中央加入Elution Buffer 20-50μｌ，室温静置1min,离心30s，获得总RNA。 6、 取适量PCR反应管，每管加入IVA PCR反应液A17ul、IVC PCR反应液B3ul。 7、 于上述PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测核酸、IVA强阳性质控品、IVA临界阳性质控品、各5ul，8000rpm离心数秒，放入PCR扩增仪。