中药降氮汤对5-6肾切除大鼠肾小球结缔组织生长因子表达的影响_1350

中药降氮汤对5-6肾切除大鼠肾小球结缔组织生长因子表达的影响_1350 中药降氮汤对5/6肾切除大鼠肾小球结缔组织生长因子表达的影响 作者：尹莲芳，胡丽华，窦国祥 [摘要]目的：研究中药降氮汤对5/6肾切除肾小球硬化大鼠肾小球 结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响，探讨其防治肾小球硬化的作用机 制。方法：采用5/6肾切除肾小球硬化大鼠模型，设立假手术组、模型 组、氯沙坦组和中药降氮汤组。检测各组大鼠术后12周末血清尿素氮、肌酐及胆固醇水平。光镜及电镜观察第12周肾组织病理变化，并应用免疫组化法检测肾小球内CTGF的表达水平。结果：中药降氮汤组 和氯沙坦组较模型组血清尿素氮、肌酐、胆固醇水平明显下降 （P<0.01），两治疗组间比较无显著性差异（P＞0.05）。肾脏病理学检查显示,两治疗组肾小球增生硬化程度明显减轻。免疫组化显示两治 疗组肾小球内CTGF表达较模型组明显减少（P<0.01），两治疗组比较无显著性差异（P＞0.05）。结论：中药降氮汤可显著抑制5/6肾切除肾小球硬化大鼠肾小球CTGF的过度表达，其防治肾小球硬化的作用机 制与抑制CTGF的过度表达有关。 [关键词]中药降氮汤;肾小球硬化;结缔组织生长因子;SD大鼠 肾小球硬化是几乎所有肾脏疾病进展到终末期肾衰的共同通路， 及早阻止或逆转肾小球硬化对防治终末期肾衰有重大意义。在肾小球硬 化的发病机制中，细胞因子网络始终是人们的研究热点。通过中和或抑 制某些细胞因子以阻止促炎症细胞因子网络已成为今后肾脏病治疗的重 要方向,近年大量研究显示中药在这一领域有巨大潜力。结缔组织生长 因子（CTGF）作为一种新发现的生长因子在转化生长因子β（TGFβ） 的诱导下介导TGFβ发挥促进肾小球硬化的作用，其作用日益受到重视 [1]。本研究旨在观察中药降氮汤对5/6肾切除肾小球硬化大鼠肾小球 CTGF表达的影响，探讨其防治肾小球硬化的作用机制。 1 材料与方法 1.1 动物模型建立及分组雄性SD大鼠40只，体重(200?20)g，测24 h尿蛋白<10 mg?kg-1?（24 h)-1，由南京军区总医院实验动物 中心提供。随机分为假手术组、模型组、氯沙坦组和中药降氮汤组4组，每组10只。假手术组大鼠在1.5%戊巴比妥钠30 mg?kg-1体重腹腔麻醉后暴露双侧肾脏，不予手术切除。其余3组大鼠在麻醉后行右肾 切除术，1周后切除左肾上下极各1/3。术后中药降氮汤组大鼠灌服中 药煎剂降氮汤10 g?kg-1?d-1，氯沙坦组大鼠灌服氯沙坦水溶液20 mg?kg-1?d-1，模型组与假手术组均灌服等量饮用水。大鼠集体笼 养，饲料（由本校医学院实验动物中心提供），自由饮水，观察 12周后处死。 1.2 药物试剂及仪器中药降氮汤由黄芪15 g、党参15 g、茯苓10 g、丹参10 g、六月雪15 g和桂枝10 g等组成，由本院药房提 供；氯沙坦为杭州默沙东制药有限公司产品；CTGF羊抗人多克隆抗体 为美国RD公司产品，SP试剂盒、胃蛋白酶和AEC显色剂均为福州迈新 生物公司产品；Techinc RA-XT U.S.A全自动生化分析仪由本校附属 中大医院提供；电镜为本校基础医学院电镜室H600型透射电镜。 1.3 血清生化指标检测术后12周采血，全自动生化分析仪测定血 清尿素氮、肌酐、胆固醇水平。 1.4 肾脏病理学检查肾组织经固定、脱水、包埋，切片厚2 μm，HE染色后光镜观察。取1 mm3的肾皮质组织数块，经戊二醛、锇酸 固定，乙醇脱水，环氧树酯包埋后超薄切片电镜观察。 1.5 免疫组化方法及4 μm肾组织石蜡切片，二甲苯脱蜡， 梯度酒精水化，其步骤为：（1）滴加过氧化物酶阻断液室温下孵育20 min,PBS冲洗；（2）加胃蛋白酶37 ?消化20 min，PBS冲洗；（3）滴加非免疫性动物血清，室温下孵育15 min；（4）滴加一抗（1?100）4 ?过夜，阴性对照不加一抗，加PBS缓冲液；（5）PBS冲洗后，滴加生物素标记的二抗，室温下孵育20 min；（6）PBS冲洗后滴加链霉菌抗生素蛋白过氧化物酶，室温下孵育15 min，PBS冲洗；（7）AEC显色，苏木素复染后封片。染色结果采用半定量分析方法， 根据肾小球内阳性染色的深浅与分布定为4级：0级，阴性；+，极少，高倍镜下阳性；2+，少量，散在，低倍镜下阳性；3+，大量，呈片状分布。由两个观察者对每个样本进行盲法评分，每个样本观察40个 肾小球，然后取两者的平均值[2]。 1.6 统计学处理统计学处理采用SPSS7.5统计软件，计量资料用x-?s表示，4组间比较采用方差分析，并用Bonferroni法进行组间的两两比较，等级计数资料的比较采用秩和检验。 2 结 果 2.1 血清生化指标5／6肾切除后12周，模型组大鼠血清尿素 氮、肌酐、胆固醇水平较两治疗组显著升高(P<0.01),两治疗组之间无显著性差异(P＞0.05),见表1。表1 4组大鼠血清尿素氮、肌酐、胆 固醇水平（略） 2.2 光镜观察结果模型组肾小球系膜细胞中、重度增生，细胞外 基质增多，球囊粘连，大部分肾小球呈局灶节段性硬化，小部分肾小球 呈代偿性肥大；肾小管多灶状萎缩，部分肾小管腔内见蛋白管型，肾间 质多灶状或弥漫单个核细胞浸润和间质纤维化。两治疗组肾小球系膜轻 度增生和基质增多，肾小管间质病变明显减轻。假手术组肾脏形态结构 基本正常。 2.3 电镜观察结果模型组大鼠肾小球基底膜不均匀增厚，肾小球 系膜和系膜基质中、重度增生，可见增生系膜细胞胞浆插入基底膜以及 足突融合（图1 A）。两治疗组肾小球系膜增生程度明显减轻，基底膜 及足突大多正常（图1 B、C）。假手术组肾脏超微结构正常（图 1D）。 2.4 免疫组化检测结果模型组肾小球内有大片红色CTGF染色颗粒，主要位于肾小球系膜及系膜基质，肾小管间质纤维化区域亦有表达 (图2 A)。两治疗组肾小球内有散在CTGF表达(图2 B、C)，较模型组表达量显著减少（P＜0.01），两治疗组之间表达无显著性差异（P＞0.05）。假手术组肾小球内CTGF有微弱表达（图2 D）。免疫组化半定量分析结果见表2。表2 4组大鼠肾小球内CTGF的表达结果 3 讨 论 进行性肾脏损害导致肾小球硬化纤维化并最终导致慢性肾功能衰竭， 属于祖国医学“水肿”“溺毒”、“关格”“癃闭”等范畴。其病理机 制为本虚标实，本虚即脾肾亏虚，标实为湿邪、浊毒、瘀血，寒热错 杂，虚实并见为其病理特征[3]。治疗当以扶正祛邪，标本兼顾。中药 降氮汤以参芪五苓散加减组方，具有益气温阳、利水泄浊、活血解毒之 功。全方标本兼顾切中病机。多年临床应用证实可改善氮质血症患者肾 功能，延缓肾小球硬化进展。本研究揭示降氮汤可明显改善5／6肾切除大鼠肾功能，减轻肾小球系膜增生及细胞外基质 rats积聚，抑制CTGF在肾小球内的过度表达，以上作用与氯沙坦组相比无显著性差 异，并推测其防治肾小球硬化的作用机制与抑制CTGF的过度表达有关。肾小球硬化是肾小球全部或部分被一些纤维组织替代全过程的总 称。多种因素如免疫介导、高血糖、肾小球血流动力学改变等均可通过 细胞因子及炎性介质导致系膜持续增生和系膜基质过量积聚，最终导致 肾小球硬化。目前已证实几乎所有的肾脏固有细胞包括系膜细胞、上皮 细胞、内皮细胞等均具有产生细胞因子的能力，同时又是细胞因子生物 学作用的靶细胞。1991年Bradham等[4]首次在人的脐静脉内皮细胞条 件培养基中，发现了这种新的细胞因子CTGF。对于正常肾组织，原位 杂交显示在肾小球壁层上皮细胞、脏层上皮细胞、肾间质成纤维细胞和 管周毛细血管内皮细胞等均可检测到少量的CTGFmRNA；在一些病理状态下，在伴有细胞增生和细胞外基质合成增加的肾小球系膜和小管间质 病变区，CTGF表达量显著增加，Frazier等[5-6]采用原位杂交法观察 到在人类以细胞增生和基质沉积为主的肾小球疾病如IgA肾病、局灶节段性肾小球肾炎和糖尿病性肾小球硬化症等，CTGFmRNA的表达显著增加。Riser等[7]用重组hCTGF刺激培养的大鼠肾小球系膜细胞可显著增加纤维连接蛋白和?型胶原的合成，并观察到在db/db糖尿病小鼠DN早期系膜轻度增生尚无间质病变及蛋白尿时，即可有CTGFmRNA显著增高，提出CTGF作为TGFβ的下游因子其上调是系膜基质积聚及肾小 球硬化进展的一个重要因素。以上研究均提示CTGF是参与肾脏纤维化的重要细胞因子。各种肾小球疾病的病变类型不同，分泌CTGF的细胞种类也不同。系膜细胞、毛细血管内皮细胞、上皮细胞均可分泌 CTGF。在我们的研究中也观察到5／6肾切除肾小球硬化大鼠肾小球呈 局灶节段性硬化，系膜中、重度增生，系膜基质增多，CTGF主要表达在增生的系膜细胞及系膜基质中，肾小管间质损伤区也有表达。两治疗 组肾小球增生硬化程度明显减轻，CTGF的表达量也明显减少。TGFβ不仅能直接促进细胞外基质（ECM）分泌增 rats ×200加，而且能抑制ECM降解，是人们公认的导致ECM积聚的重要细胞因子，在肾脏损伤 中扮演重要角色。已经发现TGFβ可诱导多种细胞分泌CTGF，如系膜细胞、上皮细胞、成纤维细胞等[8]。因TGFβ的作用效应复杂，阻断TGFβ可引起如细胞生长失控、严重炎症等副作用，而且最近已发现肾脏中 存在不依赖于TGFβ的CTGF分泌[9]，因此阻断TGFβ的下游因子CTGF 表达或抑制其活性已成为防治肾纤维化的新靶向。Yokoi等[10]应用CTGF反义寡核苷酸转染到肾脏成纤维细胞中，结果减少了TGFβ刺激的纤维连接蛋白和?型胶原的合成。目前，血管紧张素?（Ang?）受体拮抗剂的肾脏保护作用正日益受到重视。国内有研究证实Ang ?可能通过促进系膜细胞CTGF的表达而促进肾纤维化进展，Ang?受体拮抗剂氯沙坦可以部分抑制Ang?对CTGFmRNA表达的诱导，从而延缓肾纤维 化的进展[11]。本研究中应用氯沙坦作为治疗对照，观察到降氮汤与氯 沙坦二者均可抑制CTGF在肾小球内的表达，且差异无显著性。近年来 借助分子生物学等现代研究手段证实多种中药或复方可通过抑制TGFβ、内皮素等多种细胞因子及炎性介质的产生而起到肾脏保护作用，如 复方丹参注射液、肾康注射液及大黄酸等，显示了中药在肾病领域应用 的巨大潜力。本研究在国内首次观察到中药复方制剂降氮汤延缓肾小球 硬化的机制与其显著抑制TGFβ下游因子CTGF的表达有关。目前中药 应用于肾病领域尚存在药物有效成分分析、提纯及组方配伍研究等方面 的问题，有待于进一步探讨。 ［参考文献］ [1]GUPTA S,CLARKSON M R,DUGGAN J.Connective tissue growth factor:potential role in glomerulosclerosis and tubulointerstitial [J]. Kidney Int, 2000,58（4）：13891399. [2]袁曙光，刘瑞洪，夏运成，等.血管紧张素?受体拮抗剂对5／6肾切除大鼠的肾脏保护作用[J].中华肾脏病杂志,2001,17（1）：4145. [3]赵宗江，张新雪，师锁柱，等.肾康注射液延缓5／6肾切除大鼠慢性肾功能衰竭进展的机理探讨[J].中国中医基础医学杂志,2000,6（10）：1619. [4]BRADHAM D M,IGARASHIN A,POTTER R L ,et al.Connective tissue growth factor:a cystetinerich mitogen secreted by human vascular endothelial cells is related to the SRCinduced immediate earlygene product CEF10 [J]. J Cell Biol,1991,114(6):12851294. [5]FRAZIER K S,PAREDES A,DUBE P,et al.Connective tissue growth factor expression in the rat remnant kidney model and association with tubular epitheliar cells ungergoing transdifferentiation [J]. Vet Pathol ,2000,37(1):328335. [6]ITO Y,BENDE R J,OEMAR B S,et al. Expression of connective tissue growth factor in human renal fibrosis [J]. Kidney Int, 1998,53(4):853861. [7]RISER B L,CORTES P. Connective tissue growth factor and its regulation:a new element in diabetic glomerulosclerosis [J]. Ren Fail ,2001,23(34):459470. [8]OEMAR B S,WERNER A,GARNIER J M,et al.Human Connective tissue growth factor is expressed in advanced atherosclerotic lesions [J]. Circulation ,1997,95(4):831839. [9]HAMMES M S,LIESKE J C,PAWAR S,et al.Calcium oxalate monohydrate crystals stimulate gene expression in renal epithelial cells[J]. Kidney Int ,1995,48(2):501509. [10]YOKOI H,SUGAWARA A,MUKOYAMA M,et al.Role of connective tissue growth factor in profibrotic action expression and tubulointerstitial fibrosis [J]. Am J Physiol Renal Physiol,2002,282(5):F933942. [11]黄颂敏,刘芳,刘小菁,等.血管紧张素?及其受体拮抗剂在系膜细胞培养中对结缔组织生长因子表达的影响[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2000,9(5)：420423. 声明：版权归原作者所有，如果侵犯了你的版权，请第一时间和我联 系，我将立刻做出处理！！！