人类精子中HY抗原mRNA的缺失与精子mRNA功能探讨道

人类精子中HY抗原mRNA的缺失与精子mRNA功能探讨道 上海交通大学硕士学位论文人类精子中H-Y抗原mRNA的缺失与精子mRNA功能探讨姓名张志明申请学位级别硕士专业生物化学与分子生物学指导教师乔中东20070201上海交通大学硕士学位论文 人类精子中H-Y抗原mRNA的缺失与精子mRNA功能探讨 摘 要 作为生殖细胞的人类精子承担着将男性的遗传物质传递给下一代的重要任务。传统观点认为精子唯一的目的就是传递父本基因组本身是终末分化细胞已经关闭基因的转录与表达但最近有越来越多的研究发现成熟精子中存在有大量而复杂的mRNA群体。本项研究旨在通过在精子mRNA中寻找H-Y抗原mRNA来探讨精子mRNA的保留机制以及精子mRNA可能执行的功能。 本项研究采集健康男性志愿者的精液通过上游法纯化精子使用多克隆抗H-Y抗原的IgY抗体和FITC标记的兔抗鸡IgG对精子进行免疫组化和流式细胞仪检测观察成熟Y精子膜表面是否带有H-Y抗原。为研究成熟精子mRNA是否含有H-Y抗原的mRNA我们提取精子总RNA用RT-PCR的方法进行了。 免疫组化实验显示可在许多精子的头部与尾部的交界处非常清晰地看到H-Y抗原的荧光通过流式细胞仪检测被荧光素抗体标记的 。经RT-PCR分析没有从成熟精子mRNA中得到H-YH-Y抗原阳性精子的比例为49.86 抗原mRNA特异的条带。 以上结果证实了H-Y抗原存在于Y精子膜表面但成熟精子mRNA中不含H-Y抗原的mRNA表明H-Y抗原表达于精子发生的早期阶段该结果与健康人类精子SAGE表达谱的结果一致。并且H-Y抗原mRNA缺失的现象提示了保留在精子中的mRNA进入卵母细胞以后会表现至关重要的功能而非仅仅是精子发生过 H-Y抗原精子RNA精子mRNA的功能 上海交通大学硕程中遗留的残存物。 关键词 士学位论文 These results approved the presence of H-Y antigen on the membrane of Y-sperm but mRNA of H-Y antigen is not present in mRNAs persists in the ejaculate spermatozoa. These support that H-Y antigen express on the early stage of spermiogenesis and implicate that spermatozoal RNA is not only residual during spermiogenesis procedure but also performs an essential function on delivery to the oocyte. KEY WORDS: H-Y antigen Spermatozoal RNA function of spermatozoal mRNA 上海交通大学硕士学位论文 – 1 – 1 前 言 精子和卵子是人类生殖过程中起决定作用的重要细胞承担着人类繁衍的重任。精子功能的正常与否直接涉及受精过程的正常进行和子代个体的健康情况。以前人们认为精子唯一的工作就是传递父本基因组现在人们发现精子的功能远远不止这些特别是精子RNA可能在染色体重新组装、基因印记、基因沉默等中扮演重要的角色对诊断男性不育也具有非常大的应用潜力因此对精子mRNA进行深入研究的意义重大。 1.1 精子的结构和精子发生的生理学过程 1.1.1 成熟精子的结构 不同动物精子的性状、大小和内部结构有所不同但大体上是相似的。哺乳动物的精子主要由三部分组成头部、颈部和尾部。人精子形似蝌蚪全长60微米。精子的头部长约4-5微米主要由细胞核和顶体组成。细胞核含有高度致密的染色质和核蛋白核蛋白包括鱼精蛋白、组蛋白及另一种特异性碱性蛋白。核的前端有顶体顶体内有水解酶性质的颗粒当精子获能和发生顶体反应时释放其中内含物使精子可以穿过卵透明带进入卵内。核膜虽为双层膜结构但两层的间距很小而且只有在核后端与颈部相连的转褶处有核膜孔。精子颈部很短从近端中心粒到远端中心粒止。精子尾部分三部分即中段、主段和末段。从远端中心粒到环之间称上海交通大学硕士学位论文 – 2 – 为中段主要结构是轴丝和外围的线粒体鞘。轴丝是精子的运动器官其结构与动物的鞭毛或纤毛相似基本组成上都是92型。轴丝外有9条粗纤维。线粒体鞘中线粒体相互连接螺旋地包在粗纤维之外是在精子形成时 线粒体汇集到一起彼此相互合并而成的连续结构。环位于中段的后端。为哺乳类精子所特有可能与防止精子运动时线粒体后移有关。主段是尾部最长的部分由轴丝和其外的筒状纤维鞘组成。末段纤维鞘逐渐变细而消失。图11 图11 精子的结构示意图 Fig. 1-1 The sketch map of spermatozoa structure 上海交通大学硕士学位论文 – 3 – 1.1.2 精子发生的生理学过程 1精子发生spermatogenesis 精子发生是指从精原细胞到形成精子的过程。精子在睾丸中产生并在附睾中成熟。睾丸的实质结构是曲细精管和间质细胞曲细精管是一种特殊的复层上皮管道这种上皮又称生精上皮。上皮细胞可分为两种一种是形成精子的生精细胞另一种是支持细胞。上皮外面有一薄层基膜。精子发生的过程分为3个阶段第一阶段精原细胞数次有丝分裂增殖更新分化为初级精母细胞第二阶段后者经过两次成熟分裂中间度过短暂的次级精母细胞阶段而变成精子细胞第三阶段精子细胞不再分裂经过一个变态过程由原形的精子细胞发育成蝌蚪状的精子。这个过程称为精子形成U11。 男性在性成熟时睾丸内的精原细胞并非在同一时间内都发育为精子而是每隔一定时间周期性地由一部分精原细胞发育成为精子U22。因此在精子发生中有着严格的同源群现象和周期性变化规律。从精原细胞到精子形成要经过数次细胞分裂。在多次分裂中除早期几次精原细胞分裂是完全分裂外其余的分裂都是不完全的即在分裂末期两个子细胞之间仍留有23??m的胞质这些胞质称为胞质桥Cytoplasmic bridge。通过胞质桥同源生精细胞可传递信息保持同步发育。胞质桥一直保持到精子形成。这种在生精过程中同源细胞有胞质桥相连同步发育同时成熟和释放的现象称为同源群现象。生精上皮上处于不同发育阶段的各级精细胞他们得数目和排布形式不是杂乱无章的而是有着一定的规律性形成一定的细胞组合Cell association不同的细胞组合严格有序地分布在生精上皮上并重复出现。这是因为各级生精细胞所出现的顺序和持续的时间都有共同的规律性。在同上海交通大学硕士学位论文 – 4 – 一时间内可以见到各个发育时期的生精细胞有秩序、有规律地沿着曲细精管的支持细胞排列。精原细胞紧靠曲细精管的基膜由基膜向管腔依次排列为不同发育时期的生精细胞精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和将要成熟的精子。所以嵌附在管腔表面的大多数细胞是精子细胞及精子图12。 图12 精子发生示意图 Fig. 1-2 The sketch map of spermatogenesis 2精子形成spermiogenesis 由精子细胞分化转变为蝌蚪状精子的过程称为精子形成。精子形成的主要变化为高尔基复合体形成顶体泡逐渐增大凹陷为双层帽状覆盖在核的头部成为顶体Acrosome细胞核染色质高度浓缩核变长移向细胞一侧构成精子头部胞质中两个中心粒迁移至顶体对侧发出轴丝轴丝逐渐增大精子细胞变长形成精子尾部大部分线粒体从细胞周围汇集于轴丝近端周围盘绕成螺旋形的线粒体鞘在细胞核、顶体和轴丝表面仅覆盖有细胞膜和薄层细胞质多余的细胞质逐渐上海交通大学硕士学位论文 – 5 – 汇集于尾侧形成残余胞质最后脱落由支持细胞吞噬U33。精子离开曲细精管上皮进入管腔。图13 图13 精子形成示意图 Fig. 1-3 The sketch map of spermiogenesis 3 精子在附睾中成熟 当哺乳动物精子离开睾丸时虽然形态上成熟了但既不能游动又无受精能力。只有当精子通过附睾后才获得受精能力这个过程称为精子的附睾成熟。为了能与卵子接触并使之受精精子必须具有高度活动能力。在附睾成熟过程中精子绝大部分胞浆脂滴丧失代谢发生变化逐渐积累起来cAMP为精子活动提供能量因而精子获得前向运动这是精子受精能力的重要指标关系到精子能否通过卵子外层的卵丘细胞。此外精子在附睾中不断成熟还表现为精子膜结构的有序 改变包括膜脂、膜蛋白、膜上糖基成分、膜电荷以及膜流动性与通透性的改变U44。 上海交通大学硕士学位论文 – 6 – 1.2 人类成熟精子mRNA 研究进展 精子是一种终末分化细胞成熟的精子携带着由基因和环境因素共同决定的遗传信息直接影响到一个健康孩子的出生。尽管现在已经了解Y染色体删除的确会使男性患上无精或少精症U55但正常生育男性精子的形态异质性很大提示大多数先天的男性不育并非简单的单基因突变所致U66。因此精子的代谢在男性科学研究中一直都意义重大。为了弄清遗传信息流向早在50年前人们就开始研究精子中的RNA。然而直到前不久人们还认为受精过程中精子的贡献只是把父本基因组导入到受精卵中而已。后来发现随同精子一起进入受精卵的还有一种作为卵活化因子的磷脂酶成分7以及U7精子细胞中心粒它是受精卵微管组织中心的一个必须成分U88这才改变了以往人们对合子形成过程中精子所起作用的看法。除了有些啮齿类动物以外对于所有已经研究过的哺乳动物的正常配子结合精子中的其他成分也是必须的。事实上在精子形成过程中精子基因组的转录逐渐关闭这样才能让高度带电体积更小的鱼精蛋白代替组蛋白使得基因组浓缩的更充分U99。然而为了克服核转录的关闭并提供足够的蛋白质用于浓缩染色质就必须依靠足够的储存mRNA因此精子中保留着复杂的mRNAs体系这其中包括精子DNA 重新包装的相关蛋白质的信息以及在精子细胞核转录关闭前已经转录出的各种信息10 还有micro-RNA11。但是成熟精子已经丢弃了rRNA没有足够的28S和18S rRNA用于支持翻译不再具有蛋白合成能力这就说明在精子成熟过程中储存的RNA会被消耗移除或是降解那么RNA选择性保留的机制是什么呢这些精子mRNA到底如何被再次翻译呢而且既然精子的mRNA 也被导入了受精卵12那么这些mRNA 在胚胎早期发育中有什么样的作用这些问题都具有十分重大的研究价值。最近15上海交通大学硕士学位论文 – 7 – 年来关于有关精子RNA的报道日益增多但是精子RNA的存诤凸δ苋匀皇茄 踅缯 鄣幕疤狻,鲇谔骄烤 由 镅Чδ艿哪康暮透 臃奖憧旖莸囟阅行圆辉胁挥 辛俅舱锒嫌斜匾 宰钚碌氖笛橹ぞ莩吻宥跃 覴NA真实存在的质疑阐述精子RNA的功能和应用前景。对这些内容的详细讨论将有利于使精子RNA 这个正在不断深入的研究领域受到更多的关注。 1.2.1 精子RNA存在的历史争议和最新证据 整个精子发生过程发生在睾丸的曲细精管中并且处于严格的调控之下有着明显的生精上皮周期和同源群现象。精子的DNA最初是被组蛋白包装的在精子发生过程中组蛋白经由过渡性蛋白transition proteins逐渐被高电荷的鱼精蛋白所替换使精子DNA 压缩地更为致密体积更小。显然这些用于精子DNA 重新包装的蛋白以及精子形成时所需要的其它各种蛋白必须源源不断地及时供给正在发育中的精母细胞虽然此时其细胞核已经关闭了转录13。为能克服在时间顺序上基因转录已经停止、而蛋白翻译仍然必要这种基因表达上的矛盾于是出现精母细胞内转录和翻译的解偶联。在核转录关闭前抢先转录精子形成期所需要的各种mRNA并保留较长一段时间再投入蛋白质翻译使得精子细胞核转录关闭后还能保证蛋白质的供应。在精子形成的最后阶段精子细胞转变成精子这期间巨大的形态变化造成精子细胞胞质几乎全部丢失只在精子胞核与顶体和/或质膜之间剩下薄薄的一层胞质夹心。剩余的细胞质包括所有与蛋白质翻译相关结构装置都被支持细胞sertoli cell所吸收。因此人们逐渐接受了在精子的染色质浓缩过程中核转录机器关闭继而转录终止成熟精子不再合成蛋白质的观点普遍认为成熟精子是转录“沉默”细胞其目的仅是将父本的基因组DNA成功地带入到卵子中。从而也导致上海交通大学硕 士学位论文 – 8 – 人们认为此时精子不再需要RNA推测成熟精子不含mRNA。因此有关精子中存在RNA的报道常常被认为是精子中含有未被支持细胞吸收的胞质小体cytoplasmic droplets而造成或是有未成熟的精子细胞的存在或是传统方法分离出的精子中有体细胞的混杂等等。然而随着现代分子生物学分析技术的发展越来越多的证据不仅表明mRNA在精子中有广泛分布而且在特殊的环境下精子细胞核转录和翻译的抑制可以被解除。 人们从50年多前即已开始研究哺乳动物精子的转录和翻译能力早期的研究工作主要集中在动物身上。1952年MauritzenU14等14就用比色的方法检测精子中的RNA。随后Bhargava等U151516采用比较灵敏的放射性同位素标记示踪的方法可以在牛的精子中找到RNA和蛋白质。70年代初MacLaughlin、Terner17 和 Premkumar、BhargavaU1718 做了大量细致地工作同时独立地证明大鼠和仓鼠成熟精子具有代谢活性并且这种活性与转录有关但受限制于线粒体推测线粒体RNAs可以在精子中翻译最近Gur和Breitbart的研究证实了这个推测。此后Hecht和WilliamsU1819证明如果在实验条件下加入RNA聚合酶可以在精子核内发现明显的RNA合成尽管这种RNA聚合酶在精子中正常情况下是沉默不表达的。接下来有科学家提出尽管精子细胞核不能正常转录RNA但是储存的mRNAs仍然具有被翻译的潜能在线粒体组分的参与和指导下核蛋白的合成还是可能发生的U1920。这个假说引起了很大争议有些科学家认为这个假说不大可能成立因为浓缩的成熟精子缺乏细胞质而且没有足够的细胞质核糖体来支持蛋白质的从头翻译。然而最近在人和牛精子中通过利用放射性自显影法和显微荧光技术观察35S蛋氨酸、35S赖氨酸和BODIPY赖氨酸tRNA的摄取很有说服力地证实了精子RNA具有翻译活性上海交通大学硕士学位论文 – 9 – 而且基于测定其对亚胺环己酮的反应发现线粒体翻译抑制剂而非胞质抑制剂阻断了这种翻译U2021。这些工作证实了精子线粒体转录翻译机制是活跃的表明线粒体核糖体也许能支持核编码的细胞质mRNAs的翻译再次确认了50年前在这个领域中得到的结论。 尽管如此学术界对成熟精子RNA存在的真实性仍然存在质疑。有人认为得到上述结果是因为精子中含有没有充分分离的体细胞污染或者在样本中混有未成熟的精子又或者是由于未被支持细胞吸收的胞质小体而造成的。据估计人类每个精子中含有0.015 pg的总RNA10而每个体细胞含有大约10 pg的总RNA两者相差约600倍。在用十分敏感的现代分子生物学实验技术如RT-PCR等来检测的时候究竟检测到的是精子中低水平保留的RNA还是残留在胞质小体中本应被抛弃的RNA还是来自一个体细胞污染的RNA呢但是制备样本时严格地做好预防措施可以有效地排除这些干扰。用两次上游法或密度离心继之以含0.5 Triton X-100和0.1 SDS的水溶液做低渗处理可以有效地排除样本中非成熟精子成分特别是体细胞和圆型精子细胞的污染。实验结果表明经过上述多种手段处理后体细胞RNA的影响即使不能完全排除但也到了可以忽略的地步2223。精子RNA中不含28S和18S rRNA这可以作为一个特征用来衡量精子RNA样本的纯净程度24。U23另外精子的RNA 也不可能是精子胞质小体的残余所致因为首先胞质小体本身高度不稳定低渗处理就已经破坏了胞质小体U242526其次最近在对精子中的胞质小体的起源及其存在做了研究26之后发现诸如正常小鼠精子并没有明显的胞质小体也没有任何的rRNA 背景但仍然存在丰富的mRNA。 1.2.2 精子RNA的组成和定位 上海交通大学硕士学位论文 – 10 – 对于精子中存在RNA 这一事实不仅限于哺乳动物的精子中亦见于蕨类植物27和谷类植物28的雄性配子中。1988年Rejon等对蕨类植物进行观察时第一次在组织 学上发现精子中存在RNA。他们使用胶粒金和电子显微技术得到雄性配子RNA存在U28的证据随后利用多尿苷酸探针证明观察到的胶粒金标记的RNA是mRNA27。Pessot29等人使用组织学方法验证了大鼠精子存在RNA并且通过丙烯酰胺凝胶电泳发现RNA分成许多不连续的条带其中包括5.8S RNAs5S RNAs以及tRNA 这是第一次将精子细胞核RNA定位。在人类精子方面1993年ConchaU3030报道定位了U1和U2 两个人类精子中的小分子核RNAssnRNAs验证了人精子核内RNA的存在。随后Kumar31等人证实了人精子中c-MYC mRNA 存在于精子的尾部中段和末段。Miller等人用RT–PCR10和RNA-显示32技术提供证据证实上游法获得的精子中存在多种mRNA包括HSP70 HSP90 and β-actin。Wykes等人33用原位杂交的方法证实鱼精蛋白2 mRNA存在于精子的胞核或胞核周围。最近几年来通过靶向RT-PCR技术鉴定出来的人类精子mRNA种类越来越多增长稳定包括编码HLA 34L-型钙通道35N-cadherin 36 雌激素受体37 cyclic-nucleotide phosphodiesterases PDEs 38 integrins 39 aromatase 40 以及nitric oxide synthase NOS 等等的mRNA23。这些证据都表明精子中含有一套非常复杂的RNA。一般来说这些精子RNA大多都储存于精子核内或核的四周但尾部中段中心粒线粒体及尾部主段和末段的纤维鞘也都有可能携带精子RNA。 基因芯片技术的广泛应用使人们可以更快速、更全面地了解精子mRNA的种类和组成。OstermeierU3222等将来源于人类睾丸和精子的mRNA进行了基因芯片分析。他们分别从睾丸混合群体样本库精子混合群体样本库和单个健康人个体精子上海交通大学 11 – 样本中获得了cDNA探针与包含27016个特异性表达序列标签硕士学位论文 – ESTs的芯片进行杂交分别得到了71573218和2780个标签结果显示精子中所有mRNA 都存在于睾丸mRNA中而睾丸中所有的mRNA 并非都存在于精子中几乎所有的仅4个例外个体精子mRNA都能在群体精子mRNA库中找到。精子mRNA 包含各种明显不同类别。正如所推测的那样用polyA RNA 所得到的RNAs 类别与总RNA 所得到的RNAs 类别是类似的。有人用基因芯片联合RT-PCR的方法对精子RNA 复杂群体进行了检测同时检出至少3500 种功能各异的mRNA 估计正常精子mRNA种类大约有5000种。类似的研究还发现有生育能力和不育的男性有关精子运动性的基因表达有所不同因此精子RNA 可以用于区分这两类人群41 。 精子RNA还包括一些反义RNA11其中有些是具有编码蛋白质功能的正义mRNA的反义RNA还有些是siRNA的反义RNA。后者有可能通过RNAi对受精卵的发育起着关键的作用42。 1.2.3 精子RNA 保留的原因和可能执行的功能 我们已经很清楚的知道精子RNA都存在于睾丸RNA中U3622但是为什么一个终末分化并且本质上核基因表达“沉默”的细胞要保留mRNA这些RNA又执行什么功能呢 1精子RNA可能是作为精子发生过程中的残存物而遗留下来。 由于在精子形成过程中发生了转录关闭精子染色体上的组蛋白被鱼精蛋白所取代精子RNA只是这些作用的“副产品”属于被动地留下。在基因组发生鱼精蛋白取代作用之前分化中的精子细胞暂时把精子发生过程中的mRNA的转录和翻译分开方便基因组的重新包装U3743。在这个阶段RNA和蛋白质可以通过同源上海交通大学硕士学位论文 – 12 – 群现象由细胞间桥相互连接的精子细胞的胞质共享在相邻细胞中间自由移动U3844。当mRNA的工作完成它们就被留在胞质中排出而对具有精子发生中基因表达翻译调控有关的生物学活性的mRNA由于其特殊的稳定性度过了精子核转录的关闭时期而逃避了被排入残余胞质中的命运rRNA则未能逃过。在这种情况下如同受精时导入受精卵中的精子其它成分一样这些精子 RNA 的命运将交由受精卵去处理U3945。而且在精子发生中等位基因因减数分裂而造成的分裂后不平衡可能会对那些接受了隐性等位基因的精子细胞有潜在的危害而此时来源于“正常”等位基因的mRNA则能补偿染色体分离所造成的等位基因不平衡使精子和它同群的其它精子最大化地共享产物。对于性染色体转录的mRNA的交换尤其如此。这样mRNA通过同源群胞质共享机制可以保证那些接受了X染色体的精子细胞有机会得到Y 染色体的mRNA反之亦然U4046。在转录终止之后很长一段时间内这样的补偿机制可能是不可缺少的而且这种状况一直持续存在到精子细胞胞核浓缩和随后的rRNAs 丢失之后。此外最新的证据表明一些残留mRNA的翻译也是精子获能过程中所必须的U4121。这种机制可能是造成成熟精子内RNA 存在的原因之一。 2 精子染色质的重新包装也可能是精子RNA存在的原因 在哺乳动物精子.