猪各级卵泡内EGF

猪各级卵泡内EGF 8HeilongjtangJournalofAnlmalScienceandVeterinaryMedicine黑龙江畜牧兽医2002年第6期 用EeoRI双酶切pURMI)VEgB,回啦切下的28kb片 段即gB基因.将基因插入用EcoRl酶切的pcDNA3中,用 BamHI酶切重组质粒几可酶切得到1Kh和8Kb两个片段 的质粒为gB基因正向插入的重组真核表达质粒pcDNA3一 gB. 22MY3,死亡率和保护率 Mr3,发病率,死亡率和保护率见表l. 表1攻毒后各组鸡的发病,死亡及保护情况% 3讨论 DNA疫苗的研制已经成为国际疫苗研究领域摄为热门的 课题之一,它不仅可诱导体液免疫应答.而且可诱导细胞免疫 应答.近年来.棱酸疫苗在抗病毒,抗细菌,抗寄生虫,抗肿瘤 等方面取得了进展.目前tIIV,轮状病毒及HBV的DNA免 疫已进入了1期临床试验.DNA疫苗可激发机体产生较强的 细胞免疫,如果将不同形式的疫苗联合应用它们可取长补 短,互相协同,基因疫苗与基因疫苗JdlT;之间具有掷同 作用为例如Rothe[对羊缘虫的研究,Hammond对猪瘟的研 究,结果提示,两种不同形式的疫苗联合应用,取得了最佳的免 疫保护. Mr3,的免疫应答反应包括细胞免疫和体液免疫.一般认 为抗Mr3,抗体不能消除感染.但可降低感染程度.抑制病毒 跗免疫器官的损害.CT],反应在消除病毒诱导疾病,肿瘤中 超重要作用,为最重要的特异性免疫反应.根据Mr3,免疫应答 的特点,认为用基因疫苗防制MD应该是可行的. 本研究初步探讨了DNA疫苗对MD的防制HVT组的保 护率为69%,pCDNA3一gB组和rFPV组的保护率分别为 75ok和69ok.与HVT组保护率相近.先用pCDNA3gB免 疫,第二次用rFPV加强免疫组的保护率仅为50%,明显低于 前面三组.结果表明,pCDNA3gB和rFPV对防制MD没有 协同作用,面DNA疫苗,rFPV苗的免疫效果与HVT一致. 因此单独使用DNA疫苗和活载体鸡痘病毒疫苗可为预防MD 提供一个有力的补充. 参考文献: [1:N~zerianK.WitterRILandLeeLFPretecfionandsynergismby …n1h…tfowlpoxvaccinesexpressinggfromMarek’disease virus[J]A…iDi1996.40(2):368—376(003) 猪各级卵泡内EGFmRNA表达的研究 昔允考,严云勤,周志远 (1.东北农业太学动物医学院,黑龙江哈尔滨1500302东北农业大学 生命科学院.黑龙江哈尔滨150030) 中图分类号:$8281文献标识码:A文章编号:10047034c2002】 0008—02 06— 关键词:EGF;RT—PCRi各级卵泡:卵母细胞;颗粒细胞:猪 摘要:研究EGFmRNA在猪各级卵泡内的表达.采用RT—PCR技术 拴测猪大卵泡,中卵泡和一1,卯泡中厦各级卵 泡卵母细胞和颗粗细胞中E(酌mRNA的表达.结果表明大卵泡,中卵 泡和一1,卵泡中都有EGF的mRNA表选.但看 不出明显的强弱变化,卵母细胞和颗粒细胞中也有表达.且从一1,卵 泡到中卵泡到大卵泡有明显减少的趋势,卵母细胞比 颗粒细胞表速强烈,进一步证实EGF在猪卵泡及卵母细胞发育中起 着重要作用. AStud),OilExpressiiloofEGFmRNAinthePigOvary CAOYun—kao.YANYu12一qin,ZHOUZhi—vuan (1Departmento1veterinarymedicinel2Departmemofbiot~nology.North~t AgrieulttweUniversity.HarbinHeilongji~g150030.China) Keywords:EGF;RT—PCR;foilides(yleS;Er…;pig AbslractToexaminethea”ivh. va-EGFmRNAinthepigovaryIWedifferentiatethefollicleintot1-rkindofbi g.mediumandsmaU.?tt theexpr~sionofEGFmRNAinhkindof1oIlicles.its~cytes蛐 dgranul~cellsbyRT—PCRWefounditexpressedinlkindso1Hides. mcytesnndgran,flo~acetls.f…)T11I1l1,11ic’utaro?andEmnbiggeronesit’sexpressiondecreased.wefonditexpressedstronger inll~mn1:gr~ulosacellsFheseresuhstlggestthatepidermalgmwtbfactorhas import~teffectOFtthede~lopmentofthefollicl~and …tes 1962年Cohen等首先从小鼠颁下腺苹取物中提取出一种 物质,由于其有诱导小鼠服瞳提早张开和较早臣出牙齿的作用 而被命名为表皮生长因子(Epidcrmalgrowthfactor,EGF)…. 猪卵泡中的EGF一方面通过自分泌调节卵泡自身发育.卵母 细胞成熟,排卵和黄体的形成,维持与退化:另一方面又通过旁 分泌的形式调节输卵瞥和子宫的的形态变化和功能 为了检测猪卵泡中EGF表达的时间和位置,掌握EGF在 猪卵泡中表达的规律.我们采用RTPCR技术榆测了绪各期 收稿日期;20020326 基金项目:黑龙江省白然科学基金资助项目(i997) 作者简介:曹丸考(1969一),男.江苏赣榆人讲师.硕士. 卵泡,胞卵母细胞和颗粒细胞中EGFmRNA表达情况 l材料与 ll组织材料的获得 从屠宰场取得刚屠宰黑龙江省哈尔滨地区肉用青年母绪的 生殖器官.选取发育良好的正常卵巢,直径为l,3mm的卵池 定为小卵泡:直径为3,6Ttla~t的为中卵池;直径为6,11mm的 卵泡为大卵泡.小心剥离出卵泡尽量去净卵泡膜周围结缔组 织获取卵泡各两个{用20mI注射器分别吸取各级卵泡的卵 泡液,在显微镜下检出卵母细胞.吸取卵母细胞卵丘细胞复合 物,放人PIKS液滴中,用直径小于或等于卵母细胞直径的吸管 反复吹打.去掉卵丘细胞,得大,中,小卵母细胞各50枚:将获 得的卵泡十字切开后.用钝物轻轻刮下壁颗粒细胞取出卵泡膜 猪各级卵泡内EGFmRNA表选的研宄一曹允考 Heilon~iangJournalofAnimal ScienceandVeternaryMedicine9 和卵母细胞,剩下的颗粒细胞和卵泡液混台物在离心管内 5000r/s离心Lmin,倒掉液体部分,沉淀用1mLPBs液冲 洗,再离心lmin,反复洗3砍.最后将沉淀用适量PBS液吹 打均匀.吸取适量在细胞计数器中计数,取大约tOO万个细胞, 用于实验. 1.2总RNA的提取 上述组织细胞的总RNA提取,采用美国GIBCOBRI公 司生产的总RNA分离试剂盎TRIZOI,实验步骤参照,试剂盎 说明书进行.RNA沉淀物在室温下自然干燥5min,用0.01% DEPC水溶解,取一部分样品经紫外分光光度计检测RNA的 含量和纯度.分离的RNA样品OD160/OD28(I值应大于 18O(目样品量少,这一步可省略). l3PCRjl物的合成 猪的EGF引物是按照Singh等的报道序列由大连宝生物 技术公司合成的:上游引物:5’一FCq’GAACCCGGACG GATTTG一3’,下游I物3’一GACATCGCTCGCG.~s,CGTAG 一 5’.扩增片段长度:214bp[2】.由于备类细胞中部有口一actin 表达,所以我们用一actin检测样品中总RNA的完整性.口一 actin13I物是按照Tokunaga等的报道序列合成的:上游弓l物 5’一GTCg~;CCGCTCTAGC.CA一3’.下游引物3’:5’一 CT广lvrGATGTCAGCACGA一3’扩增片段长度:243bp”. 14RT—PCR RT(反转录)提取的7儿】总RNA加入lI,(005g)Olt go(dT),在7O?孵育10mln置于冰上5mln,然后加人4【.5 ×FirstStrandBuffer,225mM的MgC[i.2It(1mM的 dNTP,2I.0.1M的DTT.1Rnaset)utRnaseInbib,lI M—MI,V.反应液在37?孵育111.然后95?力?热5min,灭活 反转录酶活性. PCR反应体系如下:反应产物eDNA5fj.上下赫引物箨 100,ug.10×ReactionBuffer5I.25mMMgcl.1I10mM dNTP1,uI,甘油25I,?甲基亚砜15I.灭茼DEPC水加 到总体积49I,50I石蜡油封顶,95?予变性5min.迅速 加入L.Taq酶,PCR程序为:95?.40s:52?,4(1s:72? ,1rain;35个循环,最后一个循环72?延伸5min结束 15电泳 将PCR物郓分子量物(pBR322DNA/HiMI酶切 产物)在18%的琼脂糖凝脏中电;承.土浊后在紫外透射仪上观 察并照柑. 2结果 l太卵渔的EGFmRNA表选 2中卵泡的E(FnlRNA表达 小卵泡的EGFmRNA表选 jnmrker;~BR322DNA/Hdl的酶切产物 5小卵母细胞的EGFmRNA表达 6中卵母细胞的EGFmRNA表达 7太卵母细胞的EGFInRNA表选 A在猪卵泡和卵母细胞中的表选 1lllarke:”:Pbr31:DHinlI的酶切产物 2小卵泡颗粒蛔胞中EGF的mRNA表达 3中卵泡颗粒细胞中GF的mRNA表达 4丈卵饱颗粒细胞中EGF的mRNA表选 图2EGF的mRNA在猪卵颖粒细胞中的表达 从1中可看出:EG-F的mRNAl任太,中卵泡中表 达较强烈,小卵泡中较弱,但三者细胞数量差异较大没有可比 性.EGF的mRNA在大,中,小卯池的卵母细胞中均强烈表 达,且从小卵泡卵母细胞一中卵池卵母细胞一大卵泡卵母细胞 中EGF表达有逐渐减少的趋势 从图2中可看出.EGF在颗粒细胞中都有表达,但因细 胞数日较多,牧有卵母细胞中表达的强烈,从小卵泡颗粒细胞 一 中卵泡颗粒细胞一大卵泡颗粒细胞也有逐渐减少的趋势. 3讨论 检测结果显示:EGF在各级卵泡中都有表达,其中在卵母 细胞中表达比较强烈,且小卵泡卵母细胞一中卵泡卵母细胞一 大卵泡卵母细胞中,EGF的mRNA表达有逐渐减少的趋势同 样的结果在颗粒细胞中也发现,但颗粒细胞中表达没卵母细胞 中那么强烈. 卵巢的颗粒细胞,卵丘细胞和卵母细胞之间存在着缝隙连 接,外界信息和低分子量物质可通过缝隙连接小管传递给卵母 细胞,EGF通过它对卵子发挥生物学效应.?在卵子的减数分 裂恢复之前.这些缝隙连锁目减少,它可能对生长日子在卵泡 中的分布起一定的作用.?小卵泡中颗粒细晦和卵母细咆中 EGF的mRNA及EGF都较高表达,可能是这一较高剂量的 EGF抑制了小卵泡的生长,而中,大卵泡中的颗粒细胞和卵母 细胞中表达较少,这一较低剂量的EGF可能促进卵泡的生长 及卵母细胞的成熟和颗粒细胞的扩增. 本实验没检测卵泡膜中EGF的mRNA的表达情况,哺乳 动物卵泡膜中有EGF和/或EGFR存在,说明自分泌或旁分 泌的形式调节卵泡壁细胞的分化,增殖,及类固醇的生成. EGF促进卵泡中颗粒细胞的扩展,排卵时卵巢的生殖上皮和 卵泡膜破裂,EGF有促进伤口的的功能,因此排卵后EGF可促 进伤口尽快愈合.同时促进颗粒细胞向黄体细胞转化及其孕激 素和合成与分泌. GorhzF等证明EGF在家猫卵巢内三级卵泡的间质细 胞,卵巢皮质细胞,卵泡膜细胞和黄体细胞都有表达.SinghB 等用免疫组化和RT—PCR方法证明EGF在猪卵巢内的颗粒 细胞和卵丘细胞中都有表选,在卵子中也存在.在原始卵泡一 初级卵泡一排卵前卵泡的卵子中有逐渐减少的趋势排卵前印 泡的颗粒细胞中较多,而膜细胞中较少或检测不到.ReekaV N等用免疫组化方法证实在人的卵巢中,原始的和早期的腔前 卵泡的卵子中有EGF存在,膜细胞中无EGF表述,随卵泡的 进一步发育.卵子中的EGF逐渐消失.而卵泡噗细胞中开始显 示EGF的免疫染色,到卵泡发生后期.只有膜内部细胞显示 EGF存在,在整个卵泡发生过程中,颗粒细胞始终显示馓弱的 染色.以上EGF表达情况在不同动物卵巢中得到的不同结 果.可能是由于所检动物种属和/或所用研究方法的灵敏度不 同引起的,但这都证明EGF在卵巢的生理事件中起重要的调 节作用. 参考文献: [1ChinSIsolationofanlou~suhmmxitlaryglandpmtetna~elerating incisoreruptioaandeyelidopiningiathenewbornnfilnd[J]1Bb3[ 1562 Chem.1962.237:1555— [2]SinghB.RUledgeJM,A~stmngDTEpidemagrowthfactorand i~receptorgeneexpr~ionandt.prideL~aLizationinporcineovarian foLlicles[J]MoLecu[~RpreducfionandDeveLopment.1995.40:391 — 339 [3]TokumagaK.T~iguchiH.Yodak,etalNudmtidesequ~eeofa fulllengthcDNAforcytoskdet~口一at(inmRB[J]NucLeicAcids res1986.14(6):289 [4]VaughanTJ,JamesPS,PamM]JC,egalExperssionofTGF EGFandEGF~ceptorduringearly”pigdevelopment[]Develop …【.1992,116:663—669 【5]ReekaVN,BergFD,Bruckerc’Pr~enceoftrmlsfowainggrowth— factoratphaandepidermalgrowthfactarinhumanovariantissue ~dfolticutarfluid[J.HumanReprodacdon1998,13(8】{2199 2205 [6]GoritzF,JewgenowK,MeyerHHDEpiderma[growthfactorand epidem~lgrowfactorreceptorin,he…rvofthedf?1let1[J] Re口ordFerii,1990,106:117124(004j 一羞