紫外吸收法

紫外吸收法 紫外法测定蛋白质含量 一 实验原理:蛋白质中的含苯环氨基酸具有共轭双键，在 280nm处有最大光吸收，所以可以用于蛋白质的定量测 定。 二 实验试剂: 1:蛋白质溶液 2:样品溶液:蛋清精确称重后，溶于2%的氯化钠溶中， 浓度为5g蛋清/100g溶液。 三 实验步骤: 1、标注曲线制定: 1 2 3 4 5 6 7 8 试管号 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 标准蛋白 (1mg/ml) 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 水 摇匀后，测定280nm处的吸光度。 • 2、样品测定; 0 1 2 3 4 5 6 7 试管号 样 品 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 2.0 标准蛋白 0.5mg/ml 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 2.0 水 以零号管为空白对照调零，在280nm处测定吸光度，然后算。 四 实验结果: 0 1 2 3 4 5 6 7 试管号 样品 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 2.0 标准蛋白 0.5mg/ml 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 2.0 水 0 0.0625 0.125 0.1875 0.25 0.3125 0.375 0.4375 标准蛋白 质浓度 mg/ml 0 0.097 0.107 0.137 0.147 0.183 0.249 0.272 0.585 吸光值 280nm 标准曲线 由图得:样品中蛋白质的浓度c=(0.585-0.0281*20/0.5528=20.1483(mg/ml) 由此结果得:蛋清中蛋白质含量相对较高。 五 思考题: 1蛋白质的定量测定的两种方法(紫外法和考马斯亮蓝法)各有什么优缺点, 答:(1)紫外法 1) 优点:简单、灵敏、快速而且不消耗样品。在低浓度的盐类不干 扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中被广泛使用，特别是 在柱层析分离中最常使用。 2) 缺点:利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差 (2)考马斯亮蓝法 1) 优点:灵敏、快速、操作简单，干扰物质少，另外考马斯亮蓝G250 染料与蛋白质结合后，其最大吸收峰由465nm转变为595nm,其复 合物光吸收系数很高，所以用于蛋白质的含量测定灵敏度很高， 是目前应用很广泛的蛋白质定量检测方法。 2) 缺点:多糖、杂多糖、去污剂等严重干扰测定 2两种方法侧同一种样品，所得结果不一致，原因, 答:两种方法侧同一种样品，所得结果不一致。是因为两种方法所用的原理、试剂均不同，各自的测量精度和使用范围也不同，再加上两种方法的干扰因素有很大的区别，各种干扰的程度差异也比较大。这就造成了测量结果各不相同的主要原因。另一方面，各种系统误差、人为误差以及仪器、试剂等误差都会造成结果的相互不一致。 06级生物科学2班 小组成员: 宋茜 40608064 刘芳 40608089 魏小丽 40608091 黄玮 40608095