中药韭菜子醇提物雄性激素样作用及其机制研究（可编辑）

中药韭菜子醇提物雄性激素样作用及其机制研究（可编辑） 中药韭菜子醇提物雄性激素样作用及其机制研究 学校代码:10600 学 号:2005185 广 西 中 医 学 院 硕 士 学 位 论 文 中药韭 菜 子醇提 物雄 性激素样 作用 及其机制 研究 研 究 生: 何 娟 导师: 谢金鲜教授 院系 (部 所) : 药学院 专业: 药理学 研究方向 : 中药药理 完 成 日 期 : 2008 年 5 月 20 日 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样作 用 及 其机 制研 究 目 录 主 要 缩 略 语 英 汉 对 照 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 3 中文摘 要 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 4 英文摘 要 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 6 前 言 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 9 第 一 部 分 : 中 药 韭 菜 子 有 效 成 分 的 提 取? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 12 第 二 部 分 : 中 药 韭 菜 子 醇 提 物 雄 激 素 样 作 用 的 实 验 研 究? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 15 1.1 实验材 料 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 15 1.2 实验方 法 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 17 去 势 雄 性 大 鼠 模 型 实 1.2.1 验? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 17 1.2.2 氢 化 可 的 松 致 “ 肾 阳 虚 证 ” 动 物 模 型 实 验? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 19- 1 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样作 用及 其机 制研 究 1.2.3 悬 吊 应 激 性 性 功 能 低 下 雄 性 小 鼠 模 型 实 验? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 19 1.2.4 环 磷 酰 胺 所 致 生 殖 系 统 损 伤 动 物 模 型 实 验? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 20 1.2.5 幼 年 雄 性 小 鼠 模 型? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 21 1.2.6 中 药 韭 菜 子 醇 提 物 急 性 毒 性 试 验 MTD 测 定? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 21 2. 结 果 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 22 讨 3. 论 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 44 3.1 中药韭菜子对去势雄性大鼠模型的影 响? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 44 3.2 中药韭菜子对“肾阳虚 证”动物模型的影 响? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 45 3.3 中药韭菜子对悬吊应激性性功能低下模型的影 响? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 47 3.4 中药 韭菜 子 对 环磷 酰 胺 所致 生殖 系 统 损伤 模 型 的影 响? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 48 3.5 中药韭菜子对幼年雄性小鼠模型的影 响? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 49 3.6 与展 望 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 50- 2 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提 物 雄性 激素 样作 用及 其机 制研 究 4. 结 论 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 51 参考文 献 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 52 综 述 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 55 致 谢 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 70 攻 读 学 位 期 间 发 表 的 学 术 论 文 目 录? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 71 作者声 明 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 72 个人简 历 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 73 - 3 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样 作 用及 其机 制研 究 主 要缩略语 英汉对 照表 英文缩写 英文全称 中文全称 ACTH adrenocorticotrophic hormone 促肾上腺皮质激素 cAMP cyclic Adenosine monophosphate 环磷酸腺苷 cGMP cyclic guanosine monophosphate 环磷酸鸟苷 CY Cyclophosphamide环磷酰胺 ED Erectile Dysfunction 阴茎勃起功能障碍 follicle-stimulating hormine 卵泡刺激素 FSH GC guanylate cyclase 鸟苷酸环化酶 follicle-sti hCG human chorionic gonadotropin 人绒毛膜促性腺激素 mulating HPA hypothalamic-pituitary-adrenal 下丘脑-垂体-肾上腺 hormine 垂体-性腺 HPG hypothalamic-pituitary-gonad 下丘脑- 卵泡刺激 LH luteinizing hormine 黄体生成素 素 NANC non-adrenergic, non-cholinergic 非肾上腺素能,非胆碱能 NO nitric oxide 一氧化氮 NOS nitricoxide synthase 一氧化氮合酶 nitricoxide synthase NTF Neurotrophic factor 神经营养因子 PDE Phosphodiesterase 5 磷酸二酯酶 5 5 T testoserone 睾酮 VEGF vascular endothelial growth factor 血管内皮细胞生长因子- 4 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样作 用及 其 机 制研 究 中 文 摘 要 目 的: 研究中药韭菜子醇提物对阳虚症动物模型的影响及其雄激素样作用 机制。 方 法:1. 取韭菜子药材 5kg用 70%乙醇提取三次,合并提取液,减压浓缩 至 流浸膏状提取物,4?下保存备用。 2. 建立幼年去势雄性大鼠模型,测定大鼠血清睾酮(T)、黄体生成 素(LH)、卵泡刺激素(FSH)含量及阴茎组织中一氧化氮合酶(NOS) 活性及一氧化氮(NO)水平;计算附性器官脏器系数,观察韭菜子醇提 物对去势大鼠垂体促性腺激素分泌的影响。3. 建立氢化可的松致肾阳虚雄 性小鼠模型,观察韭菜子醇提物对肾阳 虚小鼠肾上腺、免疫器官、性器官及附性器官重量的影响;对肾阳虚小 鼠体重、体温、自主活动和游泳时间的影响。 4. 建立悬吊应激性性功能低下雄性小鼠模型,通过测定血清睾酮和皮 质酮水平;计算性器官及附性器官脏器系数;记录雌雄小鼠同笼 14d 内 每组阴栓出现总数,来考察韭菜子醇提物对应激性性功能低下的改善作 用。 5. 建立环磷酰胺致生殖系统损伤雄性小鼠模型,测定附睾尾精子活动 率,HE 染色显微镜下观察睾丸组织学形态改变。考察韭菜子醇提物对模 型小鼠的影响。 6. 中药韭菜子醇提物的急性毒性试验(MTD 测定)。 结 果:1. 韭菜子醇提物可增加去势大鼠附性器官的重量;提高阴 茎组织中 NOS 活性和 NO 含量(P0.05 或 P0.01) ;提高去势大鼠血清 - 5 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样 作 用及 其机 制研 究 睾酮水平、降低卵泡刺激素及黄体生成素的水平(P0.05 或 P0.01),并 减少 FSH、LH在垂体中的表达。 2. 韭菜子醇提物对氢化可的松诱发的阳虚症模型动物各项指标有一 定的改善。高剂量组可明显增加肾阳虚小鼠的体重、升高体温、延长游 泳时间(P0.01),增加肾阳虚小鼠肾上腺及免疫器官的重量(P0.05), 可提高阳虚小鼠睾丸附睾、包皮腺、精囊腺重量的降低(P0.05) 。 3. 韭菜子醇提物可提高悬吊应激性性功能低下模型动物的血清睾酮 水平而降低皮质酮水平(P0.05 或 P0.01) ,增加性器官和附性器官的重 量(P0.05 或 P0.01),提高交配发生率。 韭菜子醇提物对环磷酰胺所致生殖系统损伤模型小鼠可提高每毫 4. 升精浆液中的单位精子密度及精子活动率(P0.01),睾丸组织学形态观 察显示对环磷酰胺所致生殖系统损伤模型小鼠睾丸形态及功能具有较好 的改善作用。 5. 韭菜子醇提物小鼠经口的最大耐受量为 300g 生药/kg。相当于临 床成人日用量 15g生药(0.25g 生药/kg)的 1200 倍。 结 论: 中药韭菜子醇提物对去势及药物所致的阳虚症动物模型有较好的改 善作用,提示具有雄激素样作用。其作用机制可能与调节下丘脑-垂体- 性腺HPG轴及影响 NOS-NO-cGMP 系统有关。 关键词:中药韭菜子;促性腺激素;一氧化氮合酶(NOS);一氧化氮 (NO);精子活力;睾丸形态学;下丘脑-垂体-性腺轴 - 6 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样 作 用及 其机 制研 究 The study of androgenic effect and mechanism of alcohol extract of Chinese chive seed ABSTRACT Objective:The research was designed to observe the effect of Chinese chive seed to deficiency of kidney-YANG models and its mechanism of androgen Methods:1.Chinese chive seed about 5 kilogram were extracted by 70% alcohol for three times, combined the extract and destiled them to fluidextract, Saved in 4? 2. The castrated models in juvenile male rats were established, the content of testosterone, follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone in blood serum, nitricoxide synthase and nitrogen monoxidum in penis weredetermined, then calculated the coefficient of accessory sex organ, the effect of alcohol extract of Chinese chive seed on hypophysis to excrete gonadotropin releasing hormone in castrated male rats were observed 3. The deficiency of kidney-YANG male mice models were set up by injecting hydrocortisone, observed the effect of alcohol extract of Chinese chive seed to weights of adrenal, immunity organ, sexual organ and the auxiliary sexual organ. The body weight, temperature, autonomic movement and swimming time were determined 4. The sexual deficiency models were established by repeated hanging stress in male mice. The protective effect of alcohol extract of Chinese chive seed to sexual deficiency were investigated by determine the content of- 7 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样作 用及 其机 制研 究 testosterone and cortisol in blood serum, the sexual organ coefficient and the auxiliary sexual organ coefficient were calculated, the sum total of vaginal plug in female and male mice together for fourteen days were recorded 5. The reproduction genital system disturbance models were established by injecting cyclophosphamide in mice. The activity ratio of sperm and morphous of testis by HE stain in microscope were observed.Then considered the protective effect of alcohol extract of Chinese chive seed in models 6. The imum tolerable dose of alcohol extract of Chinese chive seed was estimated Results: 1. The alcohol extract of Chinese chive seed could increase the weights of accessory sex organ in castrated models, increase the content of nitrogen monoxidum and activity of nitricoxide synthase in penis P0.05orP0.01, the content of testosterone, while could lower the follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone in blood serum of P0.05orP0.01, and it also could decrease the content of follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone in hypophysis2. The alcohol extract of Chinese chive seed had amelioration effect on hypothalamic-pituitary-gonadal in the deficiency of kidney-YANG male mice models set up by injecting hydrocortisone. High dosage group could increase weights, high body temperature, last swimming time P0.01, increase the weights of suprarenal gland and immune organ P0.05, and it had opposed effect to low of testis epididymis, preputial glands and seminal vesicle P0.053. The alcohol extract of Chinese chive seed could increase the content of andrusol in model mice established by repeated hanging stress while lower- 8 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样 作 用及 其机 制研 究 the content of cortisolP0.05orP0.01, also increase the weights of sexual organ and the auxiliary sexual organ.The rate of coition had raised 4. The alcohol extract of Chinese chive seed had the favourable protective effect on morphous and function of testis, raised the ctivity ratio of sperm, increased the unity density of sperm in every millilitre semen P0.05orP0.015. The imum tolerable dose of alcohol extract of Chinese chive seed by intragastric administration in mice was 300g crude drug per kilogram. It was 1200 times equal to adult 0.25 crude drug per kilogram in one day Conclusion:The alcohol extract of Chinese chive seed had better effect on deficiency of kidney-YANG models by castration and drug. Its mechanism maybe was to accommodate hypothalamic-pituitary-adrenal and hypothalamic-pituitary-gonadal, also affect NOS-NO-cGMP systemKeywords: Chinese chive seed; gonadotropic; nitricoxide synthase; motility of sperm; the morphology of testis; hypothalamic-pituitary-gonadal - 9 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样 作 用及 其机 制研 究 前 言 阴茎勃起功能障碍erectile dysfunction, ED是指男性持续或反复的 阴茎勃起功能不良,出现不能获得或维持充分勃起而无法完成满意性行 [1] 为的情况 。尽管在男性的各个年龄阶段都可能发生ED,但其在中老年 人群发病率明显上升,且研究发现其发病率、严重性同年龄密切相关。 流行病学调查显示:当前在全世界有15200 万男性受到ED的困扰,仅仅 在美国就有3000 万人。据推测,至2025 年全世界将有32200 万人会经 [2] 历ED 。ED 是男科中的常见疾病,给患者本人和家庭均带来了极大的 痛苦,而且不利于社会和家庭的稳定。随着世界人口老年化的发展趋势, 以及人们对生活质量的要求不断提高,关于ED的研究与治疗越来越引起 全世界医药工作的关注。 西医学认为阴茎的生理勃起基本条件包括完整的神经传导通路、健 三者缺一不可。NOS对NO的 全的阴茎组织结构以及充足的动脉充盈压, 调控在阴茎勃起中起重要作用。性刺激时,分布在阴茎的副交感和非肾 上腺素非乙酰胆碱能神经NANC末梢、血管和阴茎海绵体窦内皮细胞在 一氧化氮合酶NOS催化下释放一氧化氮NO,NO可激活鸟苷酸环化酶 GC,使环磷酸鸟苷cGMP合成增加,从而松弛阴茎海绵体动脉和海绵 体窦平滑肌,使血液灌流量增加诱发阴茎勃起。在这一过程中,磷酸二 酯酶5 PDE 选择性降解cGMP 而抑制阴茎勃起。目前,枸橼酸西地那 5 非(俗称“伟哥”)已被证实是一种有效治疗ED的口服制剂,它通过对 PDE 的抑制作用从而增强一氧化氮(NO)诱导阴茎海绵体平滑肌细胞的 5 松弛,使ED病人能够在性刺激作用下获得自然勃起。然而,长期的临床 应用表明西地那非会对患者产生一定的副作用。如:卧位血压下降; 诱发 心脏异常, 致心输出量下降、心率增加;头晕、恶心、心绞痛发作; 还可 引起一过性的视觉异常。加之该药长期服用可产生药物依赖,甚至产生 心理依赖,造成病患永久性阳痿。再者,西地那非治疗费用昂贵,不适 - 10 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样 作 用及 其机 制研 究 合我国的基本国情及广大人民群众的用药水平。 中医中药治疗阳痿历史悠久,源远流长。早在两千多年前的《内经》 中就有“阴痿不用,阴器不用,阴缩”关于性功能障碍的描述。《济生 方》指出:“五劳七伤,真阳衰惫,阳事不举”。《外台秘要》、《千 [3] 金要方》、《景岳全》对壮阳治法更有详尽的论述 。中医壮阳之法经 历代医家探索研究,不断丰富和发扬光大。至现代,中医学已确立了阳 ,著 痿从肾辩治、从肺辩治、从心辩治、从脾辩治等治疗体系。1985年名中医专家王琦在临床实践中总结经验,创立了“阳痿从肝论治”的理 论,带来了男科病诊治的重大变革,增加了治疗阳痿的手段和方法。与 此同时,现代药理学研究证明:中药治疗阳痿是多途径、多靶点起效。 一方面促进性激素在人类性功能的内分泌调节机制中发挥平衡、和谐的 作用,另一方面重视增强人体的免疫功能,改善体质,增强抗病能力。 标本兼治,固本培源。 韭菜 Allium tuberosum Rottb 见图 1,别名起阳草、壮阳草,是多年 生百合科草本植物,在全国各地都有广泛种植,现在一年四季市场都有 供应。其种植方法简单,不需要精心栽培,虽割随长,尤为农民喜爱。 韭菜同时也是一味很好的中药,《本草纲目》中记载其有温中、补虚、 益阳、调和脏腑的作用它具有补肝肾、暖腰膝、壮阳固精等功效。 韭菜子(Semen Allii Tuberosi)见图 2为韭的成熟种子。 《本草纲目》: “韭子补肝及命门,治小便频数,遗尿。”根据大量的文献资料,我们 发现国内医药研究领域仅有对韭菜子乙醇提取物中化学成分及其所含微 [4] 量元素的相关报道 ,药理效应方面前人仅研究其醇提物抗衰老的药用价 [5] 值 ,而未有对韭菜子的补肾壮阳功效进行系统的药理学研究。就这一目 的,本课题将韭菜子用 70%乙醇粗提,然后从从器官和细胞水平开展研 究,探索和阐明韭菜子雄激素样作用及其可能的作用机制,为韭菜子的 进一步研究与开发提供药理实验依据。 - 11 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样 作 用及 其机 制研 究 图 1 韭菜(Allium tuberosum Rottb) 图2 韭菜子(Semen Allii 12 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激Tuberosi)- 素 样作 用及 其机 制研 究 第一部分 中药韭菜子有效成分的提取 引 言韭菜子(Semen Allii Tuberosi)为百合科植物韭菜的干燥、成熟种子, 呈半圆形或半卵圆形,略扁,长 2~4mm,宽 1.5~3mm,表面黑色,我 国大部分地区均产。本实验所用药材购自广西南宁市中药材批发站,按 常规制备韭菜子乙醇提取物。 1. 实 验材 料与 方法 1.1 实验药材 韭菜子购自广西南宁市中药材批发站,经鉴定为百合科植物韭菜 (Allium tuberosum Rottler)的干燥成熟种子。 1.2 实验试剂 95%乙醇(广西中医学院制药厂,批号:060943) 1.3 实验仪器 R-2002 旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司) SK-0.4 水循环式真空泵(淄博真空设备厂) 恒温水域锅(常州国华电器有限 公司 型号:HH-2) 1.4 方法 取 5kg韭菜子药材适当碾碎,于烘箱内 60?干燥 2 小时,用 70%的乙 醇浸泡过夜后回流提取三次,每次提取 2 小时。合并提取液,减压回收乙 醇后得浓缩液,将韭菜子提取浓缩液?恒温水浴锅上挥至无乙醇味,制成 1g膏相当于 10g原药材的流浸膏。于 4?冰箱密封保存,供实验用。提取 过程简示如下图:- 13 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提 物 雄性 激素 样作 用及 其机 制研 究 提取图示: 5kg韭菜子药材 ? 研磨 ? 60?干燥 2h 干燥药材颗粒 8倍量 70%乙醇,回流提取 2h 药渣 提取液 6倍量 70%乙醇, 回流提取 2h药渣 提取液 4倍量 70%乙醇回流提取 2h 药渣,弃去提取液合并三次提取液 减压回收乙醇 浓缩液 挥至无乙醇味 流浸膏 - 14 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样 作 用及 其机 制研 究 1.5 讨论 现代科学研究表明,中药韭菜子中含有生物碱、挥发油、皂苷、蛋 [6] 白质及氨基酸等成分。桑圣民 等对韭子的化学成分进行分析,分离并鉴 定了 5 个化合物,分别为烟草甙 C,1-O-α-L-鼠李糖22S-胆甾-5-烯-1 β,3β,16β,22-四羟基-16-O-β-D-葡萄糖甙,β-胡萝卜甙,腺嘌呤 核苷和胸腺嘧啶核苷。亦有文献报道韭菜子中蛋氨酸含量较高,还富含 大量人体必需的微量元素,其中 Fe、Zn、Mn 的含量明显高于蛇床子、 [4] 菟丝子、锁阳、淫阳藿等补肾壮阳类中药 。本课题采用 70%乙醇为溶媒 对中药韭菜子有效成分进行提取。然后用韭菜子醇提物进行雄激素样作 用及其机制研究。 15 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样- 作 用及 其机 制研 究 第二部分 中药韭菜子醇提物雄激素样作用的实验研究 1 实验材 料与方 法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动 物雄性 Wistar 大鼠,清洁级,体重 90~120g,由广西医科大学实验动 物中心提供(许可证号:SCKX 桂 2003-0003)。昆明种小白鼠,体重 28?2g,雄性 60 只,雌性 180 只。由广西壮族 自治区药品食品检验所实验动物中心提供(合格证号: SCKX 桂 2003-0001 )。 昆明种小白鼠,体重 28?2g,雄性 50 只,由广西中医学院实验动物 中心提供(桂动医字第 11004 号),使用许可证:SYXK 桂 2003-0001。 1.1.2 药 品与试 剂丙酸睾丸素注射液(1mL:50mg),上海通用药业股份有限公司,批 号:030503 氢化可的松注射液(10mg:2mL),广西南宁制药企业集团公司,批 号:0104001 男宝胶囊(天津力生制药股份有限公司,批号:0604013) 皮质醇放射免疫分析试剂盒( Union Medical &Pharmaceutical Technology Tianjin Ltd,批号:060925) 睾 酮 放 射 免 疫 分 析 试 剂 盒 ( Union Medical &Pharmaceutical Technology Tianjin Ltd,批号:060727) 丙酸睾丸素注射液1ml:50mg,上海通用药业有限公司,批号: 030604 一氧化氮合酶NOS检测试剂盒,南京建成生物工程研究所,批号: 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 20070404- 16 - 激素 样作 用及 其机 制研 究 一氧化氮NO检测试剂盒,南京建成生物工程研究所,批号: 20070405 黄体生成素放射免疫分析试剂盒,天津协和医药科技有限公司,批 号:GR1307 卵泡刺激素放射免疫分析试剂盒,天津协和医药科技有限公司,批 号:GR2307鼠抗人 FSH 单克隆抗体试剂盒,鼠抗人 LH 单克隆抗体试剂 盒,SP 免 疫组化试剂盒均由北京中山生物技术开发公司。 1.1.3 实 验仪器 1 EL204 型电子天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司; 2台式高速冷冻离心机,型号:TGL-16M,湖南赛特湘仪器有限 公司; 3紫外可见分光光度计型号:TU-1901,北京普析通用仪器有限责 任公司; 4彩色精液质量图文分析系统:SQIAS-2000, (武汉维尔康医疗仪 器有限公司); 5JY92-2D 超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所); 680-2 台式低速离心机(上海手术器械厂); 7YLS-1A 多功能小鼠自主活动记录仪:山东省医学科学院设备供应 维修站; 8水银替代型数码电子体温计,型号:MT1671,(深圳华略电子有 限公司); 9SN-695B型智能放免 γ测量仪(上海原子核研究所日环仪器一厂); TDL-5000B(上海安亭科学仪器厂); 10放免专用冷冻离心机 111/10000 电子天平,L1BROR AEU-210(日本岛津)。 1.2 实验方法- 17 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样作 用及 其机 制研 究 1.2.1 去势雄 性大鼠 模型实 验 [7] 1.2.1.1 韭菜 子对去 势雄性 大鼠血 清性 激素水平 的影响 选用健康 wistar 雄性大鼠 60 只,体重 90~120g,10%氨基甲酸乙酯 腹腔注射i.p.)麻醉。无菌下摘除双侧睾丸(50 只),常规缝合皮肤。去 势手术后肌内注射(i.m.)青霉素 40 万 U/kg,以抗感染。术后第 7 天, 随机分为 5 组(每组 10 只),即去势模型组灌胃 0.9%生理盐水NS,韭 菜子高、中、低剂量组(灌胃韭菜子醇提物溶液 30g/kg、 15 g/kg、 7.5g/kg )。 阳性对照组(隔日皮下注射(i.h.)丙酸睾丸素 10ml/kg),另取非去势雄 性大鼠 10 只作为正常对照组,灌胃 0.9%生理盐水。灌胃容量 20ml/kg, 连续 20 天。末次给药后 24 小时(h),股动脉采血,分离血清,用放射 免疫法测血清中睾酮(T)、卵泡刺激激素(FSH) 、黄体生成素水平LH。 [7] 1.2.1.2 韭菜 子醇提 物对去 势大鼠 附性 器官脏器 系数的 影响 选用健康 wistar 雄性大鼠 60 只,体重 90~120g,10%氨基甲酸乙酯 腹腔注射(i.p.)麻醉。无菌下摘除双侧睾丸(50 只),常规缝合皮肤。 去势手术后肌内注射(i.m.)青霉素 40 万 U/kg,以抗感染。术后第 7 天, 随机分为 5 组(每组 10 只),即去势模型组灌胃 0.9%生理盐水NS,韭 菜子高、中、低剂量组(灌胃韭菜子醇提物溶液 30g/kg、 15 g/kg、 7.5g/kg )。 隔日皮下注射(i.h.)丙酸睾丸素 10ml/kg),另取非去势雄 阳性对照组( 性大鼠 10 只作为正常对照组,灌胃 0.9%生理盐水。灌胃容量 20ml/kg, 连续 20 天。末次给药后 24 小时(h)后,空腹称重,处死动物,剖取阴 茎、包皮腺、精液囊、提肛肌,称其湿重,计算各附性器官的脏器系数。 脏器系数器官重量/动物体重。 1.2.1.3 韭菜 子醇提 物对去 势大鼠 阴茎 组织中 NOS 活性及 NO 水平 的影 [8] 响 选用健康 wistar 雄性(?)大鼠 60 只,体重 90~120g,10%氨基甲 酸乙酯腹腔注射(i.p.)麻醉。无菌下摘除双侧睾丸(50 只),常规缝合 皮肤。去势手术后肌内注射(i.m.)青霉素 40 万 U/kg,以抗感染。术后 - 18 - 2005 级 硕士 学位 论文 何娟 :中 药韭 子醇 提物 雄性 激素 样 作 用及 其机 制研 究 第 7 天,随机分为 5 组(每组 10 只),即去势模型组灌胃 0.9%生理盐水 NS,韭菜子高、中、低剂量组(灌胃韭菜子醇提物溶液 30g/kg、15 g/kg、 7.5g/kg)。阳性对照组(隔日皮下注射(i.h.)丙酸睾丸素 10ml/kg ),另 取非去势雄性大鼠 10 只作为正常对照组,灌胃 0.9%生理盐水溶液。灌胃 容量 20ml/kg,连续 20 天。末次给药后 24 小时,处死动物,迅速剖取整 条阴茎组织,分离周围皮肤及结缔组织,称重。按 1:19(W/V)加入预 冷的生理盐水?冰浴中,剪碎后,用超声波细胞粉碎机粉碎 5min,制成 5%匀浆,于 4 ?低温离心 8min(2000r/min) ,取上清液。用化学比色法 测定阴茎组织匀浆中 NOS 水平,用硝酸还原法测定阴茎组织匀浆中 NO 含量。方法及步骤严格按照试剂盒进行。 [8] 子对去 势大鼠 垂体促 性腺 激素分泌 的影响 。选用健康 1.2.1.4 韭菜 wistar 雄性(?)大鼠 60 只,体重 90~120g,10%氨基甲 酸乙酯腹腔注射(i.p.)麻醉。无菌下摘除双侧睾丸(50 只),常规缝合 皮肤。去势手术后肌内注射(i.m.)青霉素 40 万 U/kg,以抗感染。术后 第 7 天,随机分为 5 组(每组 10 只),即去势模型组灌胃 0.9%生理盐水 NS,韭菜子高、中、低剂量组(灌胃韭菜子醇提物溶液 30g/kg、15 g/kg、 7.5g/kg)。阳性对照组(隔日皮下注射(i.h.)丙酸睾丸素 10ml/kg ),另 取非去势雄性大鼠 10 只作为正常对照组,灌胃 0.9%生理盐水溶液。灌胃 容量 20ml/kg,连续 20 天。末次给药 24h 后,处死动物,迅速剖取脑垂 体放入 10%中性福尔马林固定,固定的组织经梯度乙醇脱水、二甲苯透 明、石蜡包埋,切片厚度为 5μm,贴于涂有多聚 L赖氨酸胶的清洁玻璃 片上。采用单克隆抗体链菌素亲生物蛋白过氧化酶SP免疫组化法