沙门氏菌检测方法研究进展

沙门氏菌检测研究进展 摘要:沙门氏菌是一种重要的人畜共患病原菌～能够污染多种食物～引起严重的食品安全问～因此～建立一种快速而准确的检测方法一直是沙门氏菌检验研究的核心问题。本文对近年来沙门氏菌的检测进展进行了简单的介绍。 关键词:沙门氏菌,检测方法,研究进展 沙门氏菌是革兰氏阴性、细胞内寄生的一种肠道菌。该菌广泛存在于自然界中，不但能引起家畜家禽及其他动物发生急性、慢性或隐性感染，而且还能通过污染食物导致人的食物中毒，对人类造成很大的威胁。在世界各国的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常居榜首。在英国，就以沙门氏菌为首位，美国则为第二位。我国内陆地区以沙门氏菌为首位。世界上最大的一起沙门氏菌食物中毒是1953年于瑞典由于猪肉引起的鼠伤寒沙门 [1]氏菌中毒，7717人中毒，90人死亡。 沙门氏菌菌型繁多，已确认的沙门氏菌有2500个以上血型。因此，沙门氏菌的检测一直是沙门氏菌研究的核心问题。为了寻求快速、准确、简便、微量的检测技术和方法，国内外学者进行了大量的研究，从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法，并在实践中不断取得新进展。下面就对沙门氏菌的检测方法进行简单的介绍。 1 传统检测方法 用于检测沙门氏菌的传统方法是将食物样品分步增菌，以增加病原菌的检出率。这种培养方法总体可分为三个不同阶段，预增菌、选择性增菌及分离步骤。传统沙门氏菌检测法全过程需时至少4–7d，才能得出明确的诊断结果。 GB4789.4–94是目前我国规定的对畜产品中沙门氏菌的标准检测方法，主要是根据沙门 [2]氏菌的生化特性，进行前增菌、选择性增菌、分离培养、生化鉴定和血清分型五个步骤。在检测畜产品过程中，应注意根据不同的样品采取不同的检测步骤。 2 免疫学方法 免疫学技术是以抗原和抗体的特异性结合反应为基础，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌，通过病原体刺激机体产生免疫球蛋白(抗体)的方法。由于免疫法有较高灵敏度，样品经增菌后可在较短的时间内检出，抗原和抗体的结合反应可在很短时间内完成。因此免疫学法在食品微生物检测中应用广泛。 2.1 酶联免疫吸附 1977年，Kryinski与Heimsch首次将酶联免疫吸附测定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,简称ELISA )用于食品沙门氏菌的检测。相继许多学者都利用ELISA进行食品沙门氏菌的检测，但他们使用的多价抗血清不同程度地存在交叉反应，使ELISA产生假阳性，在实践中有一定困难。上世纪80年代，单克隆抗体技术问世并日趋成熟，建立了抗沙门氏菌各种O抗原、H抗原单抗，取代常规因子血清进行血清学鉴定、伤寒诊断、鸡白痢检疫，并显示出单抗卓越的性能。我国焦新安等应用淋巴细胞杂交瘤技术获得了4株具有沙门氏菌广谱结合特性的单克隆抗体，其中两株的反应互补，对已检菌株覆盖率达99,，而对其它受试肠杆菌均无交叉反应。文其乙等在前人基础上应用沙门氏菌属特异性单克隆抗体CB8 和de7建立了检测沙门氏菌的直接ELISA方法，并形成了快速检测试剂盒，此外，还应用 直接ELISA方法对500份蛋品检测，结果表明该方法可靠，且阳性率比国标方法高。黎兆滚等使用ELISA技术，对94份鱼粉样品增菌培养液检测沙门氏菌，结果表明阳性符合率为 [3]92,，阴性符合率为100,，总符合率98,以上。 2.2 斑点酶联免疫吸附 斑点酶联免疫吸附(Dot–ELISA)试验是一项免疫学检测技术，具有简单、快速、敏感、特异性强等特点，并具有较高的可重复性。 目前，应用该法检测食品中沙门氏菌的报道很多。张红见等应用Dot–ELISA法对85份猪胴体进行了沙门氏菌的检测。结果表明，在85份肉样中，Dot–ELISA 检出沙门氏菌阳性65份，阳性率为76.47,，检测结果与常规方法一致。雷风应用Dot–ELISA法检测鱼粉85份，对沙门氏菌最低检出量为每毫400个，沙门氏菌阳性检出率75.29,，常规分离培养法阳性检出率为62.35,，两者差异不显著。康明等应用Dot–ELISA检测鱼粉85份，结果表明，64份为阳性，常规分离培养法53份为阳性，两种方法差异不显著。由此可见，该方法 [4]简便、特异、快速、结果直观，便于在基层推广使用。 2.3 斑点免疫金渗滤法 斑点免疫金渗滤法(dot–immunogold filtration assay, DIGFA)是20世纪80年代初发展起来的一种以胶体金为标记物的快速免疫结合技术，它借助酶联免疫原理，使点在硝酸纤维膜上的样品与胶体金标记的兔抗沙门氏菌抗体结合，若样品中含有沙门氏菌，与胶体金标记的兔抗沙门氏菌抗体结合，形成金标抗原抗体复合物，滞留在硝酸纤维膜上并显色，可得到直观的检测结果，该法具有与酶联免疫吸附试验(ELISA)相同的特异性，且操作简便、快速，不需特殊仪器设备和操作技能。 2.4 免疫磁性分离技术 由于食品检样常为固液多相混合体，采用常规方法难以将少量致病微生物分离出来。借助免疫磁性分离技术，可以很快地在含有大量杂菌的悬液中有选择性地分离出目的微生物，节省时间。目前，应用该法分离检验食品中致病菌也有一些相关报道。Skjerve等报道了用免疫磁性分离技术从乳及乳制品、肉类和蔬 菜中分离出沙门氏菌，其检测限为每克100个 [5]细菌。Mansfield等比较免疫磁性分离技术和常规方法从食品中分离沙门氏菌。他们用120种食物样品，其中一半样品中加入低浓度的沙门氏菌。结果证实，就选择性而言，抗沙门氏菌磁珠和增菌方法中最有效的亚硒酸盐选择性培养基一样有效。值得强调的是，免疫磁性分离技术能捕获受损伤的靶细菌，而目前所用的几种常规方法则不具备这样的能力。 2.5 免疫荧光标记 Mumon应用自动荧光抗体检测系统检测食品中的沙门氏菌，每小时能检测到120个玻 [6]片样品，与常规试验比较，准确率达96,。Kyrinr和Heimarchm荧光抗体检测系统检测食品中的沙门氏菌，该系统可同时检测l4个样品，并且结果可靠，操作简单。Cloak等利用表面吸附将检测样品吸附于载于玻璃表面的一种薄膜上，然后用免疫荧光显微镜进行结果判 3定。该方法检测限为每毫升l0个沙门氏菌，且不呈现假阴性与假阳性反应。 2.6 自动酶标免疫检测仪 全自动荧光酶标免疫分析仪方法对沙门氏菌的检测鉴定结果比较成熟，并已先后被美国FDA、AOAC、USDA等部门认可，我国学者也有相关研究报道。寇运同等利用自动荧光酶标分析系统快速检测出口动物性食品中沙门氏菌，结果表明，其灵敏度高，操作简便，大大缩短检验周期，可用于检验出口动物性食品中沙门氏菌。陶军等利用法国生物–梅里埃公司提供的“自动酶标免疫检测仪”与常规培养法对冻肉中沙门氏菌进行检测，指出该仪器最大特点是对被检细菌不需要纯培养，只需在增菌培养基中即可检出。黄玲等利用自动酶标免疫测试仪和国标方法检测食品中沙门氏菌，结果表明，该法具有灵敏度高、无传染危险、检测速度快等特点。陈炜等运用自动荧光酶标分析仪和国家标准方法分别对同一种脱水蔬菜样品中 沙门氏菌进行检测，并对检测结果进行对比，运用自动荧光酶标分析仪检测脱水蔬菜中的沙 [7]门氏菌灵敏度高、速度快，完全满足检验检疫系统快速检测需要。 2.7 葡萄球菌A蛋白协凝试验法 Staphylococcal Protein A简称SPA即葡萄球菌A蛋白。目前，国外已将SPA用于沙门氏菌的快速检验，所用的葡萄球菌菌株多为Cowan I 株。国内应用该法检验食品中沙门氏菌报道很少，曹同雪等采用SPA协凝试验法检测100个肉样中的沙门氏菌，结果表明该法 [8]快速、准确、灵敏度高、检出率高、并且节省费用。 3 分子生物学方法 3.1 聚合酶链反应(PCR)技术 PCR技术是一项体外酶促扩增DNA技术，具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点。目前，PCR技术是一种快速、简便、特异、灵 敏检测沙门氏菌的方法。Rahn等首先出1对引物，用PCR检测沙门氏菌，检出率为97%，但许多肠道杆菌能同时扩增出来，特异性较差。章新生等根据Cohen报道的寡核苷酸序列合成1对引物用于沙门氏菌的诊断，并对其特异性和扩增产物进行了验证。黄金林根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列设计引物序列，成功扩增出495bp沙门氏菌特异条带，而阴性对照则无此条带，从而建立了应用PCR进行沙门氏菌快速检测的方法。汪琦等利用PCR方法快速检测食品中的沙门氏菌。以全脂奶粉、生牛肉和加工过的鸡肉为试验对象，人为添加沙门氏菌，检测结果与 [9]传统培养方法系统检测结果一致，检出限为100CFU/25g，准确性达100%。 3.2 核酸探针 目前，检测沙门氏菌属特异性沙门氏菌探针已从鼠伤寒沙门氏菌菌株染色体DNA克隆成功，并用于检测食品中沙门氏菌的存在。Fitts等人在食品沙门氏菌检测中引入DNA–RNA杂交技术，此法应用的探针含有用放射性同位素标记的伤寒沙门氏菌DNA片断，其敏感性高，经大约48h增菌步骤后，检测极限可达每毫升108个细菌，但由于要使用放射性同位素，只能在专门的实验室中进行，因此阻碍了该方法的推广应用。为此，以核酸杂交为基础的比 [10]色计技术目前已发展起来。这种方法依赖于沙门氏菌核糖体RNA(rRNA)及核糖体发育过程中储存的核酸成分进行检测。这种天然富含rRNA标靶序列的情况使得无辐射检测成为可能，同时又保持了与放射性同位素方法相当或更高的敏感性。 3.3 扩增片段长度多态性技术 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism,简称AFLP)技术方便快速，实验结果既稳定又可靠。因此，在微生物研究领域有着极为广泛的应用，但以沙门氏菌为研究对象的报道还很有限。Aarts等人在对62个血清型的78株Salmonelh菌株进AFLP指纹分析时，发现所有的血清型都具有独特AFLP指纹图，并且AFLP指纹具有较高的分辨率，可以区分其 [1]他方法无法区分的不同菌株。 3.4 基因芯片技术 Chizhikov等采用寡核苷酸芯片研究沙门氏菌抗原和毒力因子与其致病性的关系，发现细菌毒力因子可用于肠道致病菌的分析检测。靳连群等利用基因芯片技术检测肠道中沙门氏菌等致病菌，结果显示制备的基因芯片能够检测出致病菌，利用基因芯片3 h能够完成对未 [3]知菌属的鉴定。 3.5 环介导等温扩增方法 环介导等温扩增方法(LAMP)是一种新的核酸扩增方法，它依赖Bst聚合酶进行自动的成环链置换及DNA合成。与普通PCR的不同之处在于它在一段不大于300bp的目的片段上设计6–8(含促环引物)条特异性引物，因此具有很高的特异性和扩增效率，而扩增过程只需在60–65?反应60min。其扩增产物为一系列以目的片段长度为单位的等差长度DNA片 段。更重要的是，由于反应中产生的副产物–焦磷酸镁是一种白色沉淀，因此反应结果可通 [11]过浊度判断。Okamura等用环介导等温扩增方法(LAMP)检测O沙门氏菌特异的插入成分93 6片段。LAM检测法的检测限是10CFU/mL。比PCR法更敏感(10CFU/mL)。LAMP法完成检测只需30min，而PCR需要120min。总之，LAMP法是对O属沙门氏菌血清型的一种有9 效的特异的检测方法。 3.6 荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术是广泛应用于快速检测的现代方法之一，它不仅实现了对DNA的定量检测，而且具有较高的敏感性、特异性、可靠性和时效性，且自动化程度高、无污染 [12]性，能够同时完成多样品的扩增及定量，适宜于大批样品的检测。钟伟军等研究发现，根据编码 鼠伤寒沙门氏菌肠毒素stn基因的核苷酸序列设计1对引物和荧光探针，通过对荧光定量PCR反应体系和反应条件的摸索，建立了检测沙门氏菌的核酸荧光定量PCR方法。对该方法的特异性与敏感性研究结果显示，该方法检测沙门氏菌结果均为阳性，而非沙门氏菌均为 阴性，具有简便、快速、特异性强、敏感性高等特点。此研究为食品中沙门氏菌快速检测试 剂盒的研制打下了良好的基础。 3.7 噬菌体裂解试验 噬菌体对细菌有特殊的裂解作用。Thal–Kalings对l181株沙门氏菌和323株其它菌株进行沙门氏菌噬菌体O–I裂解试验，结果表明沙门氏菌裂解率为99.5,，而非沙门氏菌裂解率为0.3,。截至1973年，Keils及Seeliger等人通过大量观察证实，沙门氏菌属内裂解率在95.0,–99.6,之间，属外误差为0,–2.33,之间。何晓青等发现一种肠杆菌科分属诊断 [13]噬菌体，其鉴定沙门氏菌只要6分钟，加上培养菌落时间只需2天。张碧波等应用噬菌体快速检测沙门氏菌，对100个肠杆菌菌株进行噬菌O–I裂解试验，30株沙门氏菌全部为阳性，而其余非沙门氏菌株全部为阴性，与前人研究结果一致。由此可见，应用沙门氏菌噬菌体O–I对沙门氏菌进行检测方便可靠。 3.8 原位荧光LAMP技术 原位荧光L AMP技术具有很高的特异性和灵敏度，可以达到单拷贝基因检测水平，同时不需要对细胞或组织破碎以提取DAN或RNA，从而简化试验步骤。该技术能够对细胞或组织中的病毒或基因进行定位，方便结果观察。原位荧光LAMP技术只使用恒定且较低的反应温度(63?)，因而可以减少细胞的破坏，利于使用荧光标记抗体进行细胞鉴定。比起PCR，原位荧光L AMP技术中使用的低分子DNA聚合酶更容易进人细胞，使反应更容易进 [14]行。叶宇鑫等以沙门氏菌为研究对象，探讨了将原位荧光LAMP技术应用于检测沙门氏菌所需的具体试验方法和数据，并成功将原位荧光L AMP技术应用于检测人工污染食品中的沙门氏菌，检测限约10个菌/mL。 4 小结 随着检测技术的发展，检测技术越来越快速，检测结果也越来越准确，操作程序也越来越简单。目前使用的沙门氏菌快速检测技术与传统检测方法相比都表现出很多优点，但同时也存在一定的缺陷。通过各种技术间相互结合和补充不仅使各自优点得到最大发挥，也弥补了单独一种检测技术的不足。此外，随着人们对食品安全的日益重视和对食品卫生时时监控的需要，开发便于携带、低使用成本、操作简单的沙门氏菌快速检测技术是今后研究的主要方向。 参考文献: [1] 王毳, 闫磊, 曾庆祝. 沙门氏菌的检测技术与方法[J]. 现代食品科技,2007,23(5):82–85. 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