口蹄疫病毒论文：口蹄疫病毒 VP1 原核表达 树突状细胞 T淋巴细胞

口蹄疫病毒：口蹄疫病毒 VP1 原核表达 树突状细胞 T淋巴细胞 口蹄疫病毒论文:口蹄疫病毒 VP1 原核表达 树突状细胞 T淋 巴细胞 【中文摘要】口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄 疫病毒(FMD virus, FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、高度接触性、 发热性传染病。FMDV衣壳由4种结构蛋白VP1,VP2, VP3, VP4各60 个拷贝组成。研究表明,结构蛋白VP1富含T细胞抗原表位与B细胞 抗原表位,是诱导产生中和抗体的主要成分,同时还是被宿主细胞识 别的主要病原体相关模式分子,在免疫应答中发挥着主要作用。树突 状细胞(dendritic cells,DCs)是功能最强大的专职抗原提呈细胞 (antigen presenting cell, APC),通过其吞噬受体或模式识别受体 捕获抗原,并将其提呈给T细胞,它能够调节机体对病原体的免疫应 答,但目前还不清楚它在抗FMDV感染中的作用。实验证明,FMDV野毒 株并不感染DC,但在培养基上驯化的FMDV则可以感染DC,并且与抗体 结合后的FMDV也可感染DC,导致其抗原提呈功能丧失,而当DC负载 灭活FMDV免疫复合物后却能够有效地刺激T细胞。众所周知,细胞免 疫应答在抗病毒感染过程中发挥重要作用。被DC活化的T细胞在 IL-12的作用下,可分化为Th1细胞,介导细胞免疫... 【英文摘要】Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly acute vesicular and contagious viral disease of cloven-hoofed animals caused by FMD virus (FMDV). FMDV capsid contains 60 copies of each of four structural proteins, VP1, VP2, VP3, and VP4. Studies have shown that the structural protein VP1 on the surface of the virus particles in the form of protrusions. VP1 is rich in B and T epitopes and it plays a major role in inducing FMDV neutralizing antibody and in the immune response. Dendritic cell(DC) is the most powerful... 【关键词】口蹄疫病毒 VP1 原核表达 树突状细胞 T淋巴细胞 【采买全文】 1.3.9.9.38.8.4.8 1.3.8.1.13.7.2.1 同时提供论文写作定制和论文发表服务.保过包发. 【说明】本文仅为中国学术文献总库合作提供，无涉版权。作者如有异议请与总库或学校联系。 【英文关键词】Foot-and-mouth disease virus VP1 prokaryotic expression dendritic cell T cell 【目录】负载口蹄疫病毒VP1抗原的树突状细胞启动的T细胞应 答 摘要 4-5 Abstract 5-6 缩略词索引表 7-11 1 引言 11-22 1.1 口蹄疫的研究进展 11-14 1.1.1 FMDV的生物学特性 12-13 1.1.2 FMD的流 行病学 13 1.1.3 FMDV的感染机制 13-14 1.2 树突状细 胞的研究进展 14-18 1.2.1 DC的起源和分类 14-15 1.2.2 DC的生物学特性 15 1.2.3 DC的抗原提呈 途径 15-17 1.2.4 DC与FMDV的关系 17-18 1.3 T细胞 介导的细胞免疫应答 18-19 1.3.1 CD4~+T细胞介导的免疫应 答 18 1.3.2 CD8~+T细胞介导的免疫应答 18-19 1.3.3 细胞免疫应答的基本过程 19 1.4 T细胞应答的生物学作用 19-20 1.5 本研究的目的和意义 20-22 2 实验材料、仪器及试剂 22-29 2.1 菌株、载体和细胞 22 2.2 主要实验材料 22-23 2.3 主要仪器设备 23 2.4 主要试剂配制 23-29 3. 实验方法 29-42 3.1 重组质粒 pET32a(+)-VP1的构建 29-33 3.1.1 重组质粒pUC57-VP1的小量制备 29-30 3.1.2 重组质粒pUC57-VP1的酶切鉴定 30 3.1.3 目的基因VP1的回收 30-31 3.1.4 原核表达载体pET32a(+)的制备 31 3.1.5 原核表达载体pET32a(+)质粒的酶切鉴定 31 3.1.6 目的基因pET32a(+)的回收 31 3.1.7 VP1与pET32a(+)的定向连接 31-32 3.1.8 连接产物转化感受态细胞DH5a 32-33 3.1.9 重组质粒的酶切鉴定 33 3.2 重组质粒pET32a(+)-VP1的DNA序列测定 33 3.3 重组质粒pET32a(+)-VP1转化感受态细胞BL21(DE3) 33-34 3.3.1 重组质粒pET32a(+)-VP1和pET32a(+)质粒转化感受态细胞BL21(DE3) 33 3.3.2 转化质粒pET32a(+)-VP1和pET32a(+)的酶切鉴定 33-34 3.4 转化BL21(DE3)的重组质粒pET32a(+)-VP1的DNA序列测定 34 3.5 重组菌pET32a(+)-VP1的诱导表达 34-35 3.5.1 重组表达菌的诱导表达 34 3.5.2 重组蛋白最佳诱导表达条件的确定 34-35 3.5.3 表达蛋白的可溶性检测 35 3.6 重组蛋白的纯化回收 35-38 3.6.1 包涵体的分离 35 3.6.2 包涵 体的洗涤 35-36 3.6.3 包涵体的溶解 36 3.6.4 包涵体的梯度透析复性 36 3.6.5 SDS-PAGE 36-37 3.6.6 电洗脱以及蛋白质的浓缩 37-38 3.6.7 蛋白质浓度的测定及保存 38 3.7 重组蛋白的western blot鉴定 38 3.8 实验动物 38-39 3.9 细胞培养 39-40 3.9.1 骨髓源树突状细胞的制备 39 3.9.2 小鼠淋巴结T细胞的制备 39-40 3.10 负载FMDV VP1的DC激活淋巴结T细胞的检测 40-41 3.10.1 负载VP1的BMDC与淋巴结T细胞共培养 40 3.10.2 共培养上清中IFN-γ和IL-4的检测 40-41 3.11 统计学 41-42 4 结果 42-55 4.1 重组质粒pUC57-VP1的酶切鉴定 42 4.2 重组质粒pET32a(+)-VP1的构建 42-43 4.3 重组质粒pET32a(+)-VP1的序列测定 43-44 4.4 重组表达质粒pET32a(+)-VP1的测序鉴定结果 44 4.5 重组表达菌的诱导表达和SDS-PAGE分析 44-45 4.6 重组蛋白最佳诱导条件的确定 45-47 4.6.1 最佳诱导时间的确定 45 4.6.2 最佳诱导温度的确定 45-46 4.6.3 最佳诱导剂浓度的确定 46-47 4.7 重组蛋白的超声波裂解 47-48 4.8 重组蛋白的纯化及浓度测定 48-49 4.8.1 蛋白质的纯化 48-49 4.8.2 蛋白质浓度的测定 49 4.9 重组蛋白的western blot鉴定 49-50 4.10 BMDC体外培养生长情况 50-51 4.11 负载FMDV VP1的BMDC激活T细胞表达IFN-γ和 IL-4的检测 51-55 5 讨论 55-61 5.1 重组菌pET32a(+)-VP1在大肠杆菌中的诱导表达 55-56 5.2 重组蛋白包涵体的纯化 56-59 5.2.1 包涵体的分离 57 5.2.2 包涵体的洗涤与溶解 57-58 5.2.3 包涵体的复性 58-59 5.3 负载FMDV VP1的DC激活淋巴结T细胞的研究 59-61 6 结论 61-62 参考文献 62-69 附图及说明 69-71 在读期间发表的学术论文 71-73 作者简历 73-74 致谢 74