生物显微技术

生物显微技术 第一章 1、生物显微技术:是应用各种光学显微镜或电子显微镜观察和辨认微小生物(动物、植物和微生物)的细胞形态及其显微、亚显微结构，也包括植物染色体技术与原位杂交等新的方法和技术。 2、列文虎克发明显微镜。 罗伯特胡克用自己与制造的显微镜(放大倍数为40-140倍)观察了软木(栎树皮)的薄片，第一次描述了植物细胞的构造，并首次用拉丁文cellar(小室)这个词来称呼他所看到的类似蜂巢的极小的封闭状小室(实际上只是观察到到纤维质的细胞壁)。 第二章 1、材料采集注意事项:?选择新鲜的、健康的、有代表性的实验材料;?在保证材料完整的条件下，注意实验材料要“精而小”，而不是“大而多”;?注意实验材料的生长季节和发育时期;?选用刀刃锋利的刀片，切割时用力应均匀，避免组织破裂，影响制片效果;?实验材料选好后，应在极短的时间内杀死和固定。 2、切取纵切面时应注意使刀的切向与根茎的长轴方向平行。这种切面分为两种 ?、径切面?、切向切面(弦切面) 3、固定:应用某种方法以最快的速度，将生物细胞或组织杀死，投入某类化学药液中，借助化学药品的作用使细胞组织保持原来的形状与结构。 4、固定时的注意事项: ?材料新鲜:组织采集与分割后须立即固定。否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。一般以神经、造血组织自溶速度较快，胰腺、胃肠道的粘膜亦较易发生改变。?防止变形:对一些柔嫩或薄的材料如神经、肠系膜等，应先平铺于吸水纸上再固定，可防止因蛋白质凝固而引起的扭转变形。对含气而浮于液体表面的组织如肺等，可缚以重物使其下沉，或吸出肺内气体，使其下沉于固定剂内。?固定剂用量:一般为组织体积的10~20倍。避免组织内水分在固定时渗出，影响固定剂的浓度。勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。在平时往往用棉花垫以瓶底，而使固定剂能均匀地渗入。 ?固定时间:根据组织的不同种类、性质、大小，固定剂种类、性质、渗透力的强弱而定。有的需要1~2h至10~20h，有的长达几天。一些小的材料，仅需几十分钟。某些固定剂(如Carnoy)对组织的硬化作用较强，固定时间不宜过长;但有些固定剂(如Bouin)固定时间稍长也无关系，一般固定24h左右即可。固定时间的长短与温度也有密切关系。增加温度虽可缩短固定时问，但对组织变化较大，一般并不采用。?避免阳光:尽可能避免接触阳光以免引起化学变化失去固定作用。?加速固定:轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入。 5、冲洗:用洗涤剂渗透到材料组织中去，把固定液洗掉。 常用的冲洗剂:水、低浓度的酒精等 6、脱水:用一种药剂把材料中的水分全部去除干净。其目的是在组织中的水分完全去净后便于透明剂的透入。 常用的脱水剂:酒精、正丁醇、叔丁醇、丙酮、甘油 7、透明:是采用苯类有机溶剂，将组织或切片中的水溶剂取代，并达到透明的目的。分为包埋前的透明和封藏前的透明。 常用透明剂:二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油、丁香油等 8、包埋:将融化后的包埋剂连同浸透包埋剂的材料一同倾倒于特质的容器内的过程。 常用的包埋剂:石蜡、火棉胶。 9、粘片:切好的切片经显微镜检查合格后，即可用粘贴剂将切好的切片粘贴在载玻片上。 常用粘片剂:明胶粘片剂，蛋白粘片剂，火棉胶粘片剂 10、染色: 11、染色剂分类:(根据化学性质分) ?碱性染料此类染料具有一种有色的有机盐基，能与无色的醋酸盐、氯化盐或硫酸根等结合，一般能溶于水和酒精，如蕃红及苏木精 ?酸性染料此类染料具有通常为钠和钾的金属基，能与一种有色的有机酸根结合。也能溶于水及酒精，如固绿、曙红等 ?中性染料由酸性染料和碱性染料结合而成，也可称为复合染料。这类染料中，阴阳离子都各有一个发色团，也能溶于酒精和水，如吉姆萨。 12、封藏:将已经过染色、脱水、透明的材料，将用某种具有较大粘性，而且透明度较高、折光率大的溶剂进行封藏，制作成永久切片。 13、封藏剂: 水溶性封藏剂:水及甘油、甘油明胶、糖浆 脂溶性封藏剂:加拿大树胶、合成树胶 第三章 一、生物显微制片方法:切片法，非切片制片法 二、1、徒手切片:用手直接握住小刀，把选取的材料切成适用于显微镜观察的薄片。 2、徒手切片常用器具:?培养皿:盛清水及放切片用;?切片刀:刀口非常锋利的单面刀片或剃刀;?夹持物:选用软硬适当的物体，例如:向日葵的髓、萝卜或胡萝卜的圆锥根、马铃薯的块茎等。(有些较小或柔软多汁的制片材料，直接用手夹持切片比较困难，则可把夹持材料在夹持物中进行切片，这样在切片时，材料就不致弯曲，压坏或破裂，而能切出较完整的切片) 3、徒手切片方法: ?取材:一般选择正常、软硬适中的植物器官或组织为材料，所取的新鲜材料应及时放入水中，以免徒手切片时萎蔫。 ?切片:?把欲切的材料削成大小适宜的段块，并将切面削平，然后将材料和刀片蘸水湿润。 ?用左手的拇指、食指和中指夹住材料。为防止切片时割伤手指，应使材料上端(切面)略高与食指，拇指略低于食指。用右手的拇指和食指捏住刀片一端，置于右手食指之上，刀片和材料切面平行，刀刃放在材料左前方稍低于材料断面的位置。 ?以均匀的力量和平稳的动作使刀刃自左前方向右后方斜滑拉切，注意不要直切，中途不停顿，拉切速度要快，不要推前拖后(拉锯式)切割，左手食指向下稍微移动，使材料略有上升，从而调动每张切片的厚度。切片过程中右手不动，只是右臂移动，动作用臂力而不用腕力。 ?切片要薄、平而完整，将切下的切片用毛笔刷蘸水从刀片上轻轻移入培养皿的清水中或直接将刀片浸没于水中使切片漂洗下来。 ?选片 三、1、石蜡切片:用石蜡将处理的材料经浸透、包埋、切片，制成玻片标本的方法。 ?优点:操作比较容易，能切成很薄的连续切片。 ?缺点:脱水和浸蜡后组织容易收缩，坚硬易碎的和易变脆的材料以及较大的材料块不适合制作石蜡切片。 2、石蜡切片常用器具及药品:固定液、染色剂、各级酒精(用于脱水)、二甲苯(用于透明)、石蜡、粘片剂、单面保安刀片(用于修蜡块)、包埋台、烫板、旋转式切片机、刀片(用于切片)、毛笔。 3、石蜡切片法的一般为:取材?固定?抽气?洗涤?脱水?透明?浸蜡?包埋?修块?切片?粘片?染色?封片。 ?、取材 用锋利的刀片切取新鲜的植物材料，选定适宜的材料，立即固定。取材的注意事项如下: ?取材料要新鲜。动作要迅速，以免挤压损坏组织;取病理材料时，应设置对照材料。 ?所取材料大小要适当:根和茎一般直径?5mm，切取成5-10mm小段;叶片一般取过中脉处，切成2-5mm宽、5-8mm长。在切材料时，必须注意刀片与中轴成直角，两切面平行，否则制成的切片细胞是斜的。雌、雄蕊一般不需分割。 ?取材时间可根据切片要求有所区别。如:在进行植物发育的研究过程时，需要找到细胞分裂相，一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材，此时植物细胞分裂活动较明显。 ?取材不易过老，否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行);对纵切的材料适当多取材，如根尖、茎尖等，因为切到材料正中的概率较低。 ?、固定 ?将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中。借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止，并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化。从而达到使组织变硬从而便于切片、增强内含物的折光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。以新鲜配制固定液效果较好。固定的时间依材料的种类、性质、大小等而定。材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上标签。 ?良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固;不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。 常用固定液:(简单固定液) ?乙醇为凝固型固定剂。常用无水乙醇或95,乙醇。 ?甲醛为非凝固性固定剂。具强烈刺激性气味。纯净的甲醛为无色透明液体。固定用的浓度为4%-10,。 ?醋酸为凝固型固定剂。为无色透明的液体，刺激性极强，低温下凝结成冰，故又名冰醋酸。 1、切片不成带 原因解决方法 ?切片刀不够锋利。 ?切片刀与蜡块的角度不当。 ?蜡块四周留蜡边太少。 ?石蜡硬度过大，黏度不够。?重新磨刀。 ?调整切片刀的角度。 ?可重新包埋或将蜡块四周熔化，再放人包埋框中补蜡，修理蜡块时组织块周围保留的石蜡以2mm左右为宜。 ?蜡块过硬可适当加些蜂蜡，或更换熔点较低的石蜡重新包埋。 ?将蜡块放入冰箱内延长冰冻时间，然后迅速切片。 2、切片弯曲 原因解决方法 ?组织成分及形状不规则。 ?蜡块上下或左右两边不平行。 ?蜡块与切片刀刀口不平行。 ?切片刀各处的锋利程度不一致。?修整组织块时，注意修切整齐，切成方形或矩形，尽量不要切成三角形。 ?将蜡块四边反复修平对称。 ?调节蜡块夹持器，使其与切片刀平行。 ?移动切片刀，更换刀口位置。 ?使用负离子发生器直吹切片处可防切片卷曲。 3、切片上出现裂纹 原因解决方法 ?切片刀上有小缺口，或刀口不平整。 ?刀口上粘附有细微纤维(如毛发、纸或布丝等物)。 ?组织过硬变脆，如凝血块、胶冻样物质、囊腺瘤、甲状腺、腺瘤等。 ?组织中可能含有较硬之物质，如固定液之结晶石灰质。 ?展片的水温太高。 ?包埋时石蜡冻结太慢。?切片刀某处有缺口，可调换刀口部位或重新磨刀。刀口上缺口过 多且不平整，可先将刀锋垂直在磨刀石上轻轻磨数次，然后按常规磨刀。 ?擦净刀口。 ?适当减少脱水、透明、浸蜡时间。 ?组织中硬性物质太多，则不宜用。 ?展片的水温以45?左右为宜。 ?包埋时待蜡块周围凝结一层，即放入冷水中。 4、切片厚薄不均 原因解决方法 ?脱水、透明、浸蜡过度、时间过长、温度过高。 ?蜡块太大，过硬，转动时刀刃受震动。 ?切片微动部分失灵，齿轮跳格。?调整脱水、透明、浸蜡时间和温度。 ?如蜡块过大，以后取材时注意取材的大小。蜡块组织过硬，可返回水中浸泡，再重新脱水 和包埋。 ?修理切片机失灵的部分，调整螺旋，加机油润滑零件，必要时需请专业技术人员调整切片 机。 5、切片皱褶 原因解决方法 ?石蜡太软或室温过高。 ?切片刀上粘有残余的石蜡，刀口不干净。 ?组织浸蜡时间不够，或脱水、透明不够。 ?切片刀不锋利。 ?展片的水温过高或过低。?可将蜡块放人冰箱中冰冻后切片，并在切片时一边切片一边用 冰块冰冻或换蜡。如室温过高，可开空调降低室温。 ?切片刀不干净，可用棉花沾少许二甲苯将刀口拭干净。 ?重复浸蜡过程或延长脱水、透明时间。 ?将切片刀磨锐利再行切片。 ?展片的水温以45?为宜。 ?组织蜡带先放入35,的漂片酒精中，再捞出放人温水中即可。 6、切片粘刀 原因解决方法 ?切片时有静电作用，产生静电吸引，在冬季或气候干燥时常出现这种情况。?可用加湿器， 以增加空气中的水分，而减少静电作用。 ?把卫生纸用凉水浸湿后围在切片机操作台，可以在切片机台周围形成静电屏蔽。 ?把展片时所用毛笔在湿纸上进行蜡屑清理。 7、切片脱落 原因解决方法 ?取材太厚或组织含血成分多、脂肪多。 ?组织固定不佳，脱水、透明不彻底，致使石蜡无法浸入组织内。 ?组织脱水透明过度，浸蜡时间过长或温度过高，引起组织收缩硬脆。 ?载玻片清洗得不洁净。 ?用急水冲洗或震荡过于剧烈。 ?染液或试剂的酸碱度不适宜或停留时间较久。 ?烤片时间过短、温度过低或时间长、温度过高。 ?石蜡、二甲苯使用时间过久。?取材不能太厚，载玻片下2/3处用右手的大鱼际肌均匀涂 擦蛋白甘油，厚薄适中。 ?按组织大小厚薄选择固定、脱水、透明时间。或者在不影响诊断的原则下将组织重新脱水， 透明浸蜡，包埋蜡熔度要比浸蜡熔点高3,5?。 ?先用温水润泽，再用冰硬化，然后再切片。 ?彻底清洁载玻片，使之成中性。 ?切片不能直接放于水流下冲洗或者改为浸泡，同时经过煮沸，再次净化和蒸馏处理后的水 可增加了蜡片与载玻片之间的吸引力，用冷开水漂片,既方便又经济应首选。 ?染液或试剂的酸碱度适宜、停留时间合理。 ?一般在60?，2小时为宜。 ?二次浸蜡、更换二甲苯。 8、切片灰染(红蓝对比度差、组织结构和细胞核浆模糊不清) 原因解决方法 ?固定液浓度太低，或者组织固定不及时、不彻底。 ?取材太厚。 ?水洗不够。 ?脱蜡不充分。?固定及时彻底。脱尽原染色，复染时延长苏木精的染色时间来补救。 ?取材不宜太厚。 ?水洗充分。 ?脱蜡彻底。 9、染色浅、深、不均、色素沉着 原因解决方法 ?固定液久存或者脱蜡不干净。 ?苏木精过染或伊红过染。 ?切片不均匀。 ?封固时二甲苯已挥发完毕。 ?福尔马林色素(黑色沉淀)。?在备用的甲醛中放入适量大理石或白色粉笔作为中和剂，或 经常更换脱蜡剂。 ?苏木精过染使组织呈深紫色，可延长分化和返蓝时间;伊红过染可通过水洗减轻伊红颜色。 ?切片均匀。 ?封固前当二甲苯挥发后应重新放人到二甲苯中透明。 ?在脱蜡水洗后可用10,饱和苦味酸无水乙醇溶液处理30min。 10、切片褪色 原因解决方法 ?染色前脱蜡不彻底。 ?染色过程中脱水不干净。 ?苏木精染液pH值过小，或者伊红染液加促染剂冰醋酸过多。 ?载玻片和盖玻片不呈中性。 ?在潮湿多雨时封片，使湿气进入。 ?二甲苯被氧化而呈酸性，使碱性燃料褪色。 ?切片在阳光下爆晒。?染色前彻底脱蜡。 ?染色过程中脱水时间要充足。 ?彻底清洗载玻片和盖玻片，使之呈中性。 ?最好在干燥季节制作切片。 ?切片复染。 ?封固剂和切片避免阳光直射，以免氧化变酸。 ?避光保存。 11、切片封固不良 原因解决方法 ?封固时二甲苯已挥发完毕。 ?封固剂过稀或太稠。 ?切片厚薄不匀。 ?切片未展开。 ?封固方法不当。 ?组织脱水不彻底。?封固前当二甲苯挥发后应重新放入到二甲苯中透明。 ?封固剂浓度要适当。 ?切片完全展开，无皱褶、无气泡。 ?封固时先将盖玻片一侧放置于滴有树胶的组织切片上，然后缓慢放下将空气完全排除避免产生气泡。 ?彻底脱水。 ?、抽气 ?植物材料内部多由于含有空气，导致固定液不能完全深入。材料投入固定液后需要立即进行抽气。以便让固定液有效透入材料组织中，并排除材料内气泡的干扰。 ?一般抽气时间为20-30min。抽过气的材料在停止抽气，应沉入底部。 ?、洗涤 固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶，影响观察;有的还会继续作用，使材料变质等。因此，在使用材料时，需根据固定液的种类，用水、缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液。 ?、脱水 ?材料经洗涤后含有部分水分，会使材料分解。而且透明剂与水是不相混合的，不利于材料的透明和包埋等后期处理。因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分，以便让石蜡渗透进细胞。所以，脱水是制片的关键环节。脱水剂要求能与水混合，而且能与其他有机溶剂互相替代。 ?脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行，防止吸收空气中的水分;在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料，以免损坏材料。 ?、透明 ?透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质，可以将材料中的脱水剂置换出来，使石蜡能顺利进入材料中。 ?二甲苯是目前应用最广的透明剂，作用迅速，但易使材料变脆。 ?、浸蜡 ?是指逐步清除材料中的透明剂，以使石蜡充分渗透于材料内部的过程。这样，材料的各部分都能保持原来的结构与位置，切片不致发生破裂或其他变形。 ?浸蜡是一个渐进的过程，常用的正丁醇 ?每次浸蜡的时间，视材料大小而调节。 ?、包埋 ?材料经过足够时间的浸蜡后，需包入蜡块，以备切片。 ?操作方法:根据切片材料大小，确定所需纸盒的尺寸，用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒。 ?、修整和固定蜡块 ?修整蜡块:切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，两边必须平行。 ?蜡块固定:修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。 ?、切片 ?即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带。 ?切片前的准备工具:切片刀、酒精灯、烫蜡铲、木块、垫桌纸、火柴、毛笔、镊子、染色架、切片机、小木板，等。 ?、贴片和烘片 ?是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上，以便于染色和观察。 ?常用的粘片剂有下列二种:(1)明胶黏片剂(2)蛋清黏片剂 ?烘片方法:(1)烫片台法(2)温水捞取法 ?、染色 即根据植物细胞中不同的化学性质，用染料分别进行染色，以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等。染色基本的程序为脱蜡、染色、分色封片。 ?、封藏 ?封藏于中性树胶中，使材料能在显微镜下清晰地显示出来，并能长期保存。 ?方法:将含材料的载玻片放在吸水纸上(切片一面向上)，迅速地在切片的中央滴一滴树胶(必须在二甲苯干燥前进行)，用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触，然后再缓慢地放下，避免产生气泡。 4、石蜡切片中的常见问题 三、1、冰冻切片:将已固定或新鲜的组织块不经脱水而先进性冰冻，然后在切片机上进行切片的一种方法。 2、冰冻切片优点: ?制作过程较石蜡切片相对简便、快捷,可应用于手术中快速病理诊断。 ?可保存组织中脂溶性物质，防止组织块收缩，保持原形 3、冰冻切片步骤:取材?固定?明胶包埋?切片?粘片?烤干?染色?封片。 四、1、半薄切片:用超薄切片机切出1—2μm厚的切片。 2、半薄切片步骤:取材?固定?漂洗?脱水?渗透?包埋?切片?贴片?染色?封片。 第四章 一、1、整体封片法:适用于封藏小型植物整体或植物体的某一部分。如藻类、细小的苔类、蕨类的原叶体和孢子囊，被子植物的表皮、花粉粒等。 2、地木耳装片(蓝藻门、念珠藻科、念珠藻属) ?取材、固定:用清水洗净，固定于甲醛-醋酸-酒精固定液(FAA)中。 ?贴片:将固定的藻体先移入50%酒精，在放入蒸馏水中漂洗，各经0.5h。用小镊子从藻体上撕离小块薄片组织，置于事先涂有粘贴剂的载玻片中央，加水压薄吸去多余水分，放到展片 台上展平后移入烘箱中，使其干燥。 ?染色:媒染-水洗-苏木精-分色-水洗 ?脱水、透明、封固:经30%?50%?60%?70%?80%?90%?95%?无水酒精脱水(两次)，每级10min。无水乙醇+二甲苯?二甲苯(2次)透明，每级5~10min。当材料上二甲苯尚未挥发时，加一滴加拿大树胶或中性树胶于材料上，盖上盖玻片。 3、水绵装片(绿藻门、水绵科、水绵属) ?取材:湖泊、水沟、池沼、稻田中，营养时期标本全年可得，5~6月和秋末得到接合生殖标本 ?培养:于宽敞口的容器中，用池水或Knop液培养。置于窗口向光处，不宜阳光直晒，可经常辅以较强灯光照射。逐渐减少培养缸中水分，在缸外用黑纸遮挡，能促进水绵接合生殖。 ?固定:Licent固定液(1%铬酸80mL+冰醋酸5mL+福尔马林15mL)固定24h。 ?浸洗:蒸馏水换洗多次，12~24小时。5%~10%氢氧化钠洗数小时除去接合生殖结合管处的赃物，再流水洗干净。 ?染色:4%铁矾水溶液媒染2h?水洗5min?0.5%苏木精2~4h?2%铁矾水溶液分色?水洗 ?脱水:经30%?50%?60%?70%?80%?90%?95%?无水酒精脱水(两次)，每级20min。 ?复染0.2%固绿酒精10min ?透明无水酒精+叔丁醇?无水酒精+叔丁醇?无水酒精+叔丁醇?无水酒精+叔丁醇?无水酒精+叔丁醇?叔丁醇透明，每级20~30min ?封固:将树胶逐滴加入叔丁醇中至浓度适度。加上水绵丝，再加少许树胶，盖上盖玻片。 二、1、玉米花药减数分裂制片(涂抹法):取材?固定?保存?染色?涂片?烤片?压片?分色?透明、脱水?封片 2、洋葱根尖细胞压片法示有丝分裂:取材?固定和离析?染色?压片?镜检?透明脱水?封固 第六章 一、伞菌子实体的压片观察 第七章 一、1、染色体常规压片方法:是指近代发展起来的染色体分带与电子显微技术相区别的，只显示染色体一般形态和结构的技术。 常用技术分为两种:压片法，低渗法 2、预处理作用效果:?阻止或破坏纺锤体微管的形成，使细胞有丝分裂过程被阻抑在分裂中期阶段;?可以导致染色体高度浓缩，使染色体变短，从而利于染色体的分散。 4、压片法: ?取材:于细胞分裂旺盛时期取样。一般取根尖、茎尖。 ?预处理:防止纺锤体的形成，使细胞分裂停止在中期阶段;使染色体收缩变短，便于观察统计。常用药剂有秋水仙碱溶液、8-羟基喹啉、对二氯苯饱和水溶液、富民隆。预处理的时间一般为2-12小时。 ?固定:把细胞迅速杀死，使蛋白质变性沉淀，尽量保持材料结构的原有状态，以备进一步处理。 ?解离:根尖、茎尖等体细胞组织，需经过某些处理，除去细胞之间的果胶层并使细胞软化，这种细胞分离和软化后的组织才便于压片。最常用的是酸水解和酶处理两种。 ?染色:常可用孚尔根染色法或醋酸洋红等核染色剂进行染色(常用染色剂及其配制方法见教材)。 ?压片:将材料移至载玻片上，盖上盖玻片，用解剖针或用铅笔的橡皮头在盖玻片上轻轻敲击，使细胞分散，再用拇指轻挤压盖片使组织成为一薄层。 ?镜检:将压片置于显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞进行统计记数，并可照相绘图，以便进行核型。同时可用记号笔在载玻片和盖玻片上分别做记号，以便再次观察和照相。 ?封固:好的压片，可采用冷冻干燥后，用光学树胶封固保存。也可进行脱水透明等步骤制成永久切片。若临时保存，可以用石蜡封边，放于培养皿中于冰箱冷冻室内短期保存。 5、低渗法: ?取材:同常规压片法。 ?预处理(前处理):同常规压片法。 ?前低渗:将处理后的材料防灾0.075MKCl低渗液中，在20-25?条件下处理30分钟左右. ?去壁:倒去KCl溶液，加入2.5%混合酶液(纤维素酶与果胶酶各占2.5%)，在温度25-30?下处理2-5小时左右。酶液与材料的比例适当，酶液不能过少。 ?后低渗:倒去酶液，用蒸馏水冲洗2-3次，然后在蒸馏水中停留5-10分钟左右后进行后低渗。 ?固定:用甲醇:冰醋酸(3:1)固定液固定。 ?涂片:将去壁固定的材料放在载玻片上，加一滴固定液，然后用镊子将材料夹碎，去掉大块残渣，然后从载玻片一侧向材料轻轻吹气，使组织分散成一薄层。 ?火焰干燥:将载片于酒精灯上微微加热烤干。 ?染色:用40:1的Giemsa染液染色4-30分钟或更长，蒸馏水清洗，空气干燥后可用树胶封片。 ?镜检:于显微镜下观察。 二、1、植物染色体分带方法:荧光分带，Giemsa分带 2、C带:主要显示着丝粒、端粒、核仁形成区，或染色体上某些部位的组成异染色质。 步骤:取材和预处理?固定?解离?制片?脱盖玻片?空气干燥?分带处理?显带效果的鉴别和处理 3、BSG流程:氢氧化钡处理?水洗?盐溶液处理?水洗?Giemsa染色 4、N带:指核仁组成区带——核仁组成区的异染色质与其他部位的异染色质有所区别。 5、G带:分布于染色体全部长度上，以深浅相同的横纹形式出现。 三、1、Ag-NOR技术:在各类银染色方法中是最有价值的方法，可以对核仁组织区的数目、位置及其变异进行定性和定量研究。 四、1、核型:是指体细胞染色体在光学显微镜下所有课测定的表型特征的总称。主要包括染色体的数目和形态结构特征。 2、核型分析:对核型的各种特征进行定量和定性的表述。 3、着丝点的命名 命名(简称)着丝点位置 M正中部着丝点 m中部着丝点区 sm亚中部着丝点区 st亚端部着丝点区 t端部着丝点区 T端部着丝点 4、次缢痕:在一些植物中，尤其是在具大染色体的植物中，每个细胞的染色体中，至少有一对同源染色体除着丝点(主缢痕)外，还有另一个收缩的部分，即次缢痕。 5、核仁组织区:细胞中某一对或几对染色体上负责组织核仁的区域，它含有rDNA基因，能合成rRNA。 6、随体:指在少数染色体的臂的末端可见到有小而圆球状的附属物，宛如染色体的小卫星。 第八章 一、1、原位杂交:也称为杂交组织化学或细胞学杂交，是一种能够从形态学上证明特异性的DNA或RNA序列存在于制备的个别细胞、组织部分、单细胞或染色体中的技术。 2、原位杂交基本原理:含有互补序列标记DNA或RNA片段(即探针)，在适宜的条件下与细胞内的DNA或RNA形成稳定的杂交体。无论是DNA探针还是RNA探针，均能用于定位DNA和mRNA，并且均能用于两个主要类型的标记策略，即直接标记和间接标记。 直接标记主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核苷酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜或成色酶促反应直接显示。 间接标记一般用半抗原标记探针，最后通过放射免疫组织化学对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 3、原位杂交技术是从Southern和Northern杂交技术衍生而来的 Southern杂交是进行基因组DNA特定序列定位的方法。 Northern杂交是将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 4、原位杂交可分为染色体原位杂交和RNA原位杂交。 二、1、染色体原位杂交技术步骤 ?植物核,,,的的提取;?探针及标记;?染色体制备;?杂交前处理;?杂交反应;?杂交后处理;?杂交信号检测;?复染和封片;?观察和摄影;?载玻片的再杂交 ,、探针:是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核酸片段，因而可检测待测样品中特定的核酸序列。 ,、染色体原位杂交的探针:克隆的核酸，双链,,,探针，单链,,,探针，合成寡核苷酸，总基因组,,,探针。 三、,、,,,原位杂交技术步骤: ?取材和固定;?标本制备;?探针及标记;?杂交前处理;?杂交反应;?杂交后处理;?杂交信号的检测和对比染色;?,,,原位杂交结果的评定 ,、,,,原位杂交探针:特异性cDNA，cRNA探针，寡核苷酸探针 第九章 一、,、生物显微化学:是应用化学药剂处理动物、植物的器官、组织或细胞，使其中某些微量的化学物质发生化学变化，从而产生特殊的染色反应，并通过显微镜来鉴定这些物质及其分布状态的方法。 ?对某些物质(如核酸、酶等)的鉴定，需要做对照的制片进行比较。 第十章 显微镜分类(光源种类):紫外光:荧光显微镜 可见光:生物显微镜，相差显微镜，体视显微镜，倒置显微镜 激光:激光共聚焦显微镜 第十二章 生物显微摄影:是利用光学显微摄影装置或数码显微摄影装置来拍摄显微镜或解剖镜视野中所观察到的物像技术。