啤酒酵母转化次黄嘌呤核苷酸生成三磷酸腺苷的研究

啤酒酵母转化次黄嘌呤核苷酸生成三磷酸腺苷的研究 啤酒酵母转化次黄嘌呤核苷酸生成三磷酸 腺苷的研究 2008No.17 ?24?SerialNo.194ChinaBrewingR esearchReport 啤酒酵母转化次黄嘌呤核苷酸生成三磷酸腺苷的研究 常景玲,任敏2,张军霞, (1.河南科技学院生物工程系,河南新乡453003;2.新乡学院应用生物系,河南新乡453000; 3.河南省食品药品检验所生化室,河南郑州450003) 摘要:啤酒厂废酵母经培养可转化次黄嘌呤核苷酸(IMP)生成三磷酸腺苷(ATP).研究了初始葡萄糖,磷酸盐,M,IMP底物浓 度,pH值等主要参数对转化率的影响以及纯化过程中洗脱液的选择.利用酵母体内的酶成功地对IMP进行了转化,结果表明,在优化 条件下ATP转化率稳定在90%以上,含量超过85%,纯度超过99%. 关键词:黄嘌呤核苷酸;三磷酸腺苷;啤酒酵母;转化 中图分类号:TQ926.4,0524文献标识码:A文章编号:0254—5071(2008)17—0024-03 StudyOntheprocessofconvertingIMPtoATPbybrewer’syeast CHANGJingling,RENMin,ZHANGJunxia (1.BioengineeringDepartmengHenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003,China;2. AppliedBiologyDepartmengXinxiang Universi~Xinxiang453000,Cln’na;3.Biochemis己abo斌0ofHenanPmvinciamstimteofFbodan’lDmgC0n昀’Zhengzhou450003,China) Abslxa~:Wasteyeastinbeerbrewingcanbeusedtoconveghypoxanthinenucleotide(IMP)toAdenosin etriphosphate(ATP)aftercultivation.This studyfocusedontheeffectsofconcentrationsofinitialglucose,phosphate,Mg,substra~ofIMPandvalu eofpHontransformratioofBrewer’yeast convertingIMPtoATP.Besides,selectionoflotionamplifiedinpufific~ionprocesswasalsodiscussed.I MPwasconvertedtoATPsuccessfullyby usingenzymesinboayofyeast.Underoptimaltheconversioncondition,theresultsindicatedthatthecon vertingratioofATPkeptabove90%,the contentreached85%andthepuritywas99%. Keywords:IMP;ATP;brewer’syeast;conversion 三磷酸腺苷(ATP)又称腺嘌呤核苷三磷酸,为一种辅 酶.参与体内脂肪,蛋白质,糖,核酸及核苷酸的代谢,同时 又是体内能量的主要来源[1].次黄嘌呤核苷酸(IMP)近年 来国内产量增加,市场售价大幅降低,造成企业亏损.为此 课组利用酵母菌体内丰富的酶系统,由葡萄糖分解时 获得的能量,将IMP转化为一磷酸腺苷(AMP)通过底 物磷酸化获得ATP.就发酵而言,以高浓度磷酸抑制磷 酸酯酶的作用,利用IMP解除高盐浓度对发酵的障碍[2-3]. 本实验采用啤酒厂废酵母泥经冷冻,发酵培养分离出酵 母体内的酶对IMP进行转化,成功获得ATP.为IMP生 物转化ATP探索了一条新途径,同时提高了啤酒厂废酵 母泥的综合利用价值. 1和方法 1.1试剂 废啤酒酵母泥:新乡啤酒厂提供;IMP(质量分数? 98%):新乡制药股份有限公司;ATP(纯):北京双鹭 药业股份有限公司;201X7型阴离子交换树脂:上海华镇 科技贸易公司. 基础培养基:200mmol/L葡萄糖,250mmol/L磷酸二氢钾, 15mmol/L氯化镁,15mmol/L硫酸铵,pH7.0. 1.2仪器 50L发酵罐:江苏达森发酵设备工程有限公司;板框 压滤机:上海建华板框压滤机公司;树脂柱:自制;高效液 相色谱仪:日本岛津LC.10AS双泵系列;751.GW型紫外 可见分光光度计:安捷伦科技上海分析仪器有限公司;超 滤膜:英泰恒源膜工业公司;真空抽滤机,真空干燥箱. l-3方法步骤 1-3.1发酵酵母及酶液提取 以基础培养基为依据,分别设定KH2FO浓度50mmol/L, 15(knmol/L,250mmol/L,350mmol/L,450mmol/L,550mmol/L 6个梯度,葡萄糖浓度为50mmol/L,lOOmmol/L,150mmol/L, 20(~nrnol/L,250rnmol/L,300mmol/L,350mmol/L,400mmol/L 8个梯度,MgC12浓度为0mmol/L,5mmol/L,lOmmol/L, 5mmol/L20mmol/L25mmol/L,30mmol/L35mmol/L, 40mmol/L9个梯度,用HC1和NaOH分别调pH值为 2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.08个梯度,配制培养基.50L 发酵罐121oC空消30min,按80%投料量,32%接种量接入 冷冻啤酒酵母泥,36?发酵培养至酵母菌自溶释放出酶 系,时间约2h.培养液用板框压滤机压滤分离酵母菌 残体,收集酶液. l-3.2酶促转化 分别取浓度为lOmmol/L,20mmol/L,30mmol/L, 收稿日期:2008.05.14 基金项目:河南省教育厅自然科学研究计划项目(2007180019) 作者简介:常景玲(1963.),女,河南新乡人,副教授,研究方向为发酵与生物药物. 研究中国酿造2008年第17期 总第194期?25? 40mmoFL,50mmol/L,60mmol/L,70mmol/L的IMP加入酶 液中,36%转化,用DEAE.纤维素薄板层析跟踪检查ATP 转化率,当转化率超过90%时,用工业盐酸调pH值为3.0, 3.5,灭酶终止反应,时间约5h.按1.7%~JH入硅藻土,板框 压滤收集转化液. 1-3-3提取纯化 上柱吸附ATP:转化液用NaOH调pH值为6.7,加纯 水稀释至0值为300左右,电导率9ms/cm,以流速70 mL/min上201X7型阴离子交换树脂柱,当流出液0 值为40左右,即上样饱和. 洗涤杂质:吸附饱和的树脂用流速80mL/min,pH2.0 的纯水冲洗,除去其中的葡糖糖,无机离子,杂蛋白等杂 质.当流出液pH值为2.0后换用流速0.31mL/min,pH2.0, 0.025mol/LNaC1缓冲液继续冲洗2h左右,除去IMP,中问 产物ADP,至流出液含60%的ATP时换用流速15mL/min~ 20mL/min,pH2.0,0.05mol/LNaC1缓冲液冲洗,进一步除 去IMP,ADP.流出液0值>70,ATP纯度>99%,此时 有大量ATP被洗脱下来,收集洗脱液,回收上柱. 洗脱ATP:采用流速3mL/min~5mL/min,pH2.0, lmol/LNaC1缓冲液洗脱去热原,收集0D28o/26o值>2.0,纯 度>99%的洗脱液.纯度<99%的洗脱液分段回收,以便 二次上柱,提高收率. 1.3.4活性炭脱色与超滤 按2gmATP洗脱液加药用粉末活性炭,搅拌30min, 真空抽滤脱色.脱色后的ATP原液用截断分子量为10000 超滤膜超滤除热原和大分子杂质等. 1_3.5酒精沉淀与研磨干燥 超滤后的ATP原液用NaOH调节pH值为4.0~4.5, 加3倍ATP原液体积95%vol冷冻酒精,使混合后酒精 浓度>70%vol,醇沉24h,收集ATP沉淀.ATP沉淀加 0.5倍沉淀物体积的无水乙醇研磨成粉末状小颗粒,用 砂芯漏斗抽滤至无水乙醇流下,用无水乙醚洗滤2,3次. P:O作干燥剂真空干燥10h. 1.3.6分析 IMP转化率测定:DEAE.纤维素薄板层析跟踪检查[6]. ATP含量及纯度测定:高效液相色谱(HPLC)法. 2结果与分析 2.1初始葡萄糖浓度对转化率的影响 发酵培养基不同初始葡萄糖浓度对转化率的影响结 果见图l. 由图l可知,初始葡萄糖浓度为50mmol/I~150mmol/L 时,转化率呈增长趋势,浓度150mmol/L时,转化率随葡 萄糖浓度增加而大幅度降低.葡萄糖浓度过高,产生葡萄 糖效应.在浓度为150mmol/L时转化率最高,随着啤酒酵 母菌的增殖而达到自溶,释放出足够量的能量和酶系供 IMP转化利用. 料 葡萄糖浓度/(retool?L-) 图1葡萄糖浓度与转化率的关系 Figure1.Relationshipbetweenglucoseconcentrationand conversionratio 2.2磷酸盐浓度对转化率的影响 发酵培养基添加不同KH2PO浓度对转化率的影响 见图2. 褂 磷酸盐浓度/(mmol~L) 图2不同磷酸盐浓度与转化率的关系 Figure2.Relationshipbetweenphosphateconcentrationand conversionratio 由图2中可知,KH2PO4浓度为0mmol/~100mmol/L 时,IMP转化率随磷酸盐浓度逐渐增大.在浓度> 100mmol/L,磷酸盐对转化率基本没有影响.即高磷酸盐 浓度对IMP转化生成ATP无抑制作用. 2_3M浓度对转化率的影响 发酵培养基中添加不同浓度MgC1:对转化率的影响 见图3. 糌 水 M浓度/(retool?L) 图3不同Mg浓度与转化率的关系 Figure3.RelationshipbetweenMgconcentrationandconversionratio ??????如加m0?????如加m??????如加 2008No.17 ?26?SerialNo.194ChinaBrewingR esearchReport 由图3可知,M浓度对转化率影响基本不大.通过 添加M可抑制ATP酶的活性,防止ATP的降解,实验 说明啤酒酵母泥中含一定量的Mg抖,培养基中添加少量 的M就能起到很好的效果. 2.4IMP浓度对转化率的影响 不同IMP底物浓度对转化率的影响结果见图4. 褂 辩 IMP浓度/(mmol?L-) 图4IMP浓度与转化率的关系 Figure4.RelationshipbetweenIMPconcentrationandconvemionratio 由图4可知,IMP浓度对酶促反应的影响较大,IMP 浓度为10mmol/I~30mmol/L时,转化率呈逐渐增高,浓度> 30mmol/L时转化率随其浓度增加而降低,浓度为30mmol/L 时转化率最高. 2.5pH值对转化率的影响 不同初始培养基pH值对转化率的影响见图5. 褂 辩 pH值 图5pH值与转化率的关系 Figure5.RelationshipbetweenpHandconvemionratio 由图5可知,pH值为2.0,7.0时,转化率随pH值增大 而增大,pH值>7.0时转化率逐渐降低.pH值影响反应体 系中一些必要营养物质和中间代谢产物的解离,引起酵母 代谢过程变化,使胞内酶系质量与比例发生变化,影响 转化率. 2.6优化转化实验 取上述各因素最优条件:发酵培养基为150mmol/L 葡萄糖,100lnrno1/LI~-I2PO4,10mmol/LMgC12,15mmo儿 (NH)SO,pH7.0,发酵温度36?,加入质量分数32%酵 母发酵培养,转化底物IMP浓度为30mmol/L.此条件 下进行5次平行实验,其平均转化率分别为92.5%,91%, 95%,94I3%,92%,优化实验结果稳定. 3结论 利用啤酒酵母转化IMP生成ATP,只要提供适量的 葡萄糖和磷酸盐,就能使转化ATP完成.很好地解决了 磷酸基团来源问题.转化ATP产物采用离子交换非连续 梯度洗脱法,杂质去除彻底,回收率稳定,可保证ATP 质量达国家注射用药标准.本工艺成本大幅度降低,废 啤酒酵母得到了很好的综合利用,为ATP工业化生产提 供了一条新的途径.通过对转化过程中的主要参数研究 和对洗脱液的选择,使ATP转化率稳定在90%以上,含 量超过85%,纯度超过99%. 参考文献: [1]段学辉,叶勤,张嗣良,增强细胞渗透性对酿酒酵母ATP合成活力 的作用研究[J].南昌大学学报:工科版,200l,23(3):86.91. 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