产AmpC酶阴沟肠杆菌的检测

产AmpC酶阴沟肠杆菌的检测 中国实验诊断学2008年7月第12卷第7期 文章编号:1007—4287(2oo8)o7—0933—02 产AmpC酶阴沟肠杆菌的检测 杨月琳 (北京航天总医院检验科,北京100076) 近年来,阴沟肠杆菌引起的感染,特别是医院 ICU感染的报道越来越多,尤其是产AmpC酶的阴 沟肠杆菌已成为引起医院感染流行的典型菌….阴 沟肠杆菌产AmpC酶是导致其对新型广谱B一内酰胺 酶抗生素产生耐药的重要原因.AmpC酶多数由染 色体介导,但近年来陆续发现了数十种质粒介导的 AmpC酶,由于质粒介导AmpC耐药基因可在同种或 不同种属细菌间广泛播散,给临床治疗带来困难. 为了解阴沟肠杆菌中AmpC酶的分布及耐药性,我 们对从临床感染标本中分离的161株阴沟肠杆菌的 产酶状况进行了研究. 1材料与 1.1实验菌株收集2004年1月至2005年12月我 院临床分离的161株无重复的阴沟肠杆菌.用 ATB—Expression微生物鉴定仪鉴定到种. 1.2标准菌株产AmpC酶标准菌株E.cloacae 029M,E.coliDH5a2919,E.cloacae029由北京医院细 菌室惠赠.产ESBLs标准菌株K.pneumoniaeCF104 为本院药敏实验室保存株. 1.3培养基,抗生素纸片与试验药品MH琼脂为 法国生物梅里埃产品,胰酶大豆肉汤为英国Oxiod 公司产品.头孢西丁,头孢曲松,亚胺培南,头孢吡 肟,头孢他啶,头孢噻肟,头孢他啶/克拉维酸,头孢 噻肟/克拉维酸抗生素纸片均为英国Oxiod公司产 品.氯唑西林(cloxacillin,CLO,)为山西威奇达药业 有限公司生产,批号为2~5W02.三唑巴坦 (tazobactam,rIZB)为海南三洋德林药业)生产,批号 为20050403. 1.4产AmpC酶菌株初筛试验采用K.B(Kirby. Bauer)纸片扩散法检测试验菌株对头孢西丁的敏感 性,抑菌圈直径?17nl/n,提示对头孢西丁耐药或中 介疑为产AmpC酶菌株. 1.5产AmpC酶菌株确认试验 1.5.1酶粗提物制备参照Coudom等[]报道的反 复冻融法制备酶粗提物. 1.5.2头孢西丁三维试验将0.5麦氏单位标准菌 .-.—— 933.-.—— 匀涂布于MH琼脂 株大肠埃希菌ATCC25922菌液均 平皿,将头孢西丁纸片置于平皿中心.用消毒200 肚l枪头粗端在距离头孢西丁纸片5nl/n处对称打 孔,用微量加样器在一孔加酶粗提物6o,另一孔 加酶粗提物50l及10l20mmol/L的氯唑西林,避 免加入液体溢出孔.35%温箱培养过夜.以E. cloacae029M为阳性对照,以E.cloacae029为阴性对 照. 1.6Ampc酶和ESBLs的同时检测参照吴伟元 的改良三维试验方法并作了部分改进,对产AmpC 酶菌株的酶粗提物进行头孢曲松三维试验,操作方 法基本同上,用头孢曲松纸片代替头孢西丁纸片,并 切出三个孔,分别加入酶粗提物6o,酶粗提物50 l+20mmol/LCLO10tzl,酶粗提物50l+20mmol/L C工010l+20mmol/LTZB10l. 1.7AmpC酶型筛选参照周志慧等[3]的AmpC 酶表型筛选法,应用纸片扩散法进行亚胺培南,头孢 吡肟,头孢他啶,头孢噻肟,头孢他啶/克拉维酸,头 孢噻肟/克拉维酸的抗生素敏感性试验,持续高水平 产AmpC酶的判定标准为头孢吡肟,亚胺培南敏感, 而头孢他啶/棒酸,头孢噻肟/棒酸,头孢噻肟耐药; 或头孢吡肟,亚胺培南敏感,而在头孢他啶/棒酸,头 孢噻肟/棒酸,头孢噻肟的抑菌圈内存在有散在菌 落. 2结果 在所检测的161株阴沟肠杆菌中,通过产AmpC 酶阴沟肠杆菌初筛试验有103株阴沟肠杆菌疑为产 AmpC酶的菌株,检出率为64.0%(103/161).在所 检测的103株阴沟肠杆菌中,三维试验阳性菌株共46 株,总检出率为42.6%,结果见图1,其中单产AmpC 酶菌株38株,检出率为23.6%,同时产AmpC酶和 ESBLs菌株8株,检出率为49%.结果见图2. 表型筛选结果与三维实验结果比较:103株阴 沟阴沟肠杆菌从药敏表型筛选结果分析,表现为高 产Ampe酶的菌株共52株,48株IPM,FEP表现敏 感,CD02,CDO3,CTX表现耐药;4株IPM敏感,FEP, __-—— 934---—— A:酶粗提取物;孔B:酶粗提取物+氯唑西林 图1临床菌株阴沟肠杆菌三维试验阳性结果子L A:酶粗提取物;孔B:酶粗提取物+氯唑西林,孔C:酶粗提取 物+氯唑西林+舒巴坦 图2临床菌株阴沟产杆菌酶粗提取物FOX三维试验 结果孑L CD02,CD03,CTX均为耐药.其中46株三维试验阳 性,符合率为88.5%. 3讨论 阴沟肠杆菌是一种重要的条件致病菌,可在短 时间内成为医院感染的主要致病菌,并可很快获得 对抗菌药,尤其是对J3内酰胺类抗菌药的耐药性_5]. AmpC酶是由染色体或质粒介导的革兰阴性杆 菌产生的一类J3内酰胺酶,属Ambler分类中C类 酶,Bush分类中I类酶,能水解三代头孢菌素,不被 J3内酰胺酶抑制剂所抑制.目前,产AmpC酶的革兰 阴性杆菌逐年增多.而阴沟肠杆菌产生AmpC酶是 其导致对新型广谱B内酰胺酶抗生素产生耐药的 重要原因.对AmpC酶的检测较为困难,该酶的检 测可用头孢西丁耐药作为筛选指标,我科曾利用该 标准检测肺炎克雷伯菌,大肠埃细菌和奇异变形杆 菌AmpC酶时发现,28株头孢西丁抑菌环小于18ram 的肺炎克雷伯菌中,只有4株产AmpC酶,有2株抑 菌环分别为17nlln和18nlln,而产ACC一1,CMY— ChinJLabDiaria,Ju1v,20o8,V0112,No.7 4AmpC对头孢西丁敏感_5],说明利用头孢西丁耐药 作为筛选指标的方法特异性较差. 目前较为公认的方法是Coudron等[1]推荐的酶 粗提物头孢西丁三维试验.虽然三维试验操作繁 琐,费时,但由于此方法通过酶粗提物来检测,没有 活菌,排除了头孢西丁诱导细菌产AmpC酶的干扰, 结果准确可靠. 本研究在161株阴沟肠杆菌中,产Ampc酶菌株 总检出率为42.6%,因此我们认为产Ampc酶是阴 沟肠杆菌耐药的重要机制.这可能与阴沟肠杆菌染 色体上ampD基因有较高的突变率致ampC基因去 阻遏持续高水平表达有关_7].在本实验中有4.9% 的阴沟肠杆菌同时分离到AmpC酶和ESBLs.ESBLs 以肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌最为常见,但产ES— BLs质粒通常具有广泛的宿主适应性,使其能够打 破种属屏障介导耐药性广泛传播_8_8. 本实验中应用的AmpC酶表型筛选法与三维试 验法符合率为88.5%.虽然表型筛选法的结果易 受其它相关因素的影响,同时细菌耐药机制也日益 复杂化,细胞膜通透性的改变以及其它J3内酰胺酶 的存在都会对药敏结果产生影响,但是表型筛选试 验操作简单,快速,可以作为临床实验室常规AmpC 酶的筛选方法. 通过对我院阴沟肠杆菌AmpC酶检测的研究, 对于预防产AmpC酶的阴沟肠杆菌在临床上广泛传 播,指导临床正确合理使用抗生素具有重要意义. 参考文献: ,陈民钧,王辉.阴沟肠杆菌去阻遏持续高产AmpC酶和 [1]吴伟元 ESBLs的检测[J].中国临床药理学杂志,2001,17(2):104. [2]CoudronPE,MolandES,ThomsonKS.OccurrenceanddetectionofAm. pC~lactamaseamongEscherichiacoli,andProteusmirabillisisolatesata Veteran’sMedicalCenter[J].JClinMicrobiol,2O0O,38:1791. [3]FortlneauN,PorielL,NordmannP.Plssmid—mediatedandinducible cepbelospofinaseDHA一2fromKlebsielapneumoniae[J].JAntimicrob Chemother,2001,47:207. [4]周志慧,李兰娟,俞云松,等.两种检测阴沟肠杆菌AmpC酶方法 的比较[J].中华检验医学杂志,2002,25(2):88. .质粒介导的AmpC酶研究进展[J].中华检验医学杂志, [5]方友 2003,26(11):706. [6]吴伟元,陈民钧.AmpC酶的研究进展[J].中国抗感染化疗杂志, 2001,15(3):107. [7]吴伟元,陈民钧.阴沟肠杆菌ampD基因突变与去阻遏持续高产 Ampc酶[J].中国抗感染化疗杂志,2001,1(2):65. [8]BradfordPA.Extended—spectrumbeta—lactanmsesinthe21stcerl~’y: characterization,epidemiology,anddetectionofthisimportantresistance threat[J].ClinMicrobiolRev,2001,14:933. (收稿Et期:2007—10—26)