去甲斑蝥素聚乳酸-聚乙二醇纳米粒的制备及细胞毒性实验

去甲斑蝥素聚乳酸-聚乙二醇纳米粒的制备及细胞毒性实验 去甲斑蝥素聚乳酸-聚乙二醇纳米粒的制备 及细胞毒性实验 ? 294? 药学服务与研究PharmCare&Res2007Aug}7(4) 任杰,等.去甲斑蝥素聚乳酸,聚乙二醇纳米粒的制备及细胞毒性实验 去甲斑蝥素聚乳酸一聚乙二醇纳米粒的制备及细胞毒性实验 任杰,仲谦,李航,袁华,郁晓,成浩 (同济大学材料科学与工程学院纳米与生物高分子材料研究所,上海200092) ? 论着? [摘要]目的:制备去甲斑蝥素纳米粒(norcantharidinnanoparticles,NCTD-NP),并考察其缓释特性和细胞毒性.方法: 以聚乳酸一聚乙二醇为载体,采用相分离法制备NCTD-NP.用激光粒度仪测定纳米粒的粒径,以透射电镜观察其形态,以 HPLC法测定其包封率,以紫外分光光度法考察其体外释放特性.应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)比较 NCTD-NP和NCTD对胆囊癌GBC,SD细胞的细胞毒性.结果:纳米粒的粒径为(97.4?14.5)nm,表面光滑,包封率为 (51.7?1.32),具有良好缓释性能.相同浓度的NCTD-NP和NCTD的细胞毒性在24h之前基本相同,但NCTD-NP对 GBC-SD细胞的生长有更持久的抑制效果,在Ic.浓度48h时仍抑制(56.42?9.45),而NCTD组仅抑制(23.14?3.77), 两组有显着差异(P<o.01).结论:NCTD-NP具有良好的缓释性能,并且可较长时间抑制胆囊癌GBC-SD细胞的生长. [关键词]去甲斑蝥素;纳米颗粒;制备;细胞毒性;聚乳酸;聚乙烯二醇类 [中图分类号]R979.1,R944.9[文献标识码]A[文章编号]167l一2838(2007)040294— 04 PreparationandcytotoxicityofpolylacticacidpolyethyleneglycolnanoparticlesloadedwithnOrcantharidin RENJie,ZHONGQJan,LIHang,YUANHua,YUXiao,CHENGHao(InstituteofNanoandBio—PolymericMaterials,School ofMaterialScienceandEngineering,TongJiUniversity,Shanghai200092,China) [ABSTRACT]Objective:Topreparenorcantharidinnanoparticles(NCTD-NP)andinvestigatetheirsustained—releaseproperty andcytotoxicity.Methods:NCTD-NPwerepreparedbyphaseseparationmethod,usingpolylacticacid—polyethyleneglycol (PLA— PEG)ascarrier.Iaserlightscatteringtechniquewasusedtodeterminesizeofthenanoparticles.Themorphologyof NCTD-NPwasassayedbytransmissionelectronmicroscopy(TEM).Theentrapmentratioandreleasecharacteristicsinvitro ofNCTD-NPweremeasuredbyHPICmethodandultraviolet,spectrophotomelry.respectively.TheeffectofNCTD-NPand NCTDontheinvasionofGBC— SDcelllinesofhumangallbladdercarcinomawasstudiedbymethylthiazolyltetrazolium(MTT) method.Results:ThegrainsizeofNCTD-NPwas(97.4? 14.5)nmwiththeentrapmentrateof(51.7?1.32).NCTD-NP possessedgoodsustained— releasepropertyincontrasttothenakeddrug.Inthecellexperiment,theinvitroinhibitionrateof GB(>SDeellgrowthwassimilarbetweenNCTD-NPandNCTDatsameconcentrationbefore24h.However.thegrowthof GBC—SDcelllineswasinhibitedforlongertimeinNCTD— NPgroupthanthatinNCTDgroup.TheinhibitionrateofGBC—SD celllinesat48hwas(56.42?9.45)0AinNCTD-NPgroupand(23.14? 3.77)inNCTDgroupwhenthedrugconcentration wasIC5o.Therewassignificantdifferencebetweenthetwogroups(P<0.01).Conclusion: NCTD-NPshowadvantageinSUS— tained—releaseandcaneffectivelyinhibitthegrowthofGBC,SDcellfor48h. [KEYWORDS]norcantharidin;nanoparticle;preparation;cytotoxicity;polylacticacid;po lyethyleneglycols [PharmCare&Res,2007,7(4):294—2973 去甲斑蝥素(norcanthar.din,NCTD)是根据鞘 翅目芫菁科昆虫斑蝥的抗癌有效成分斑蝥素的化学 结构,去除1,2位甲基人工合成而得,是我国创制的 新型抗肿瘤药物口].NCTD能抑制恶性肿瘤细胞 的生长,其抗肿瘤作用的重要机制是诱导肿瘤细胞 的凋亡_3],而且药物疗效呈剂量依赖性j.但是, NCTD毒性很大,对表皮有强烈的刺激性,人体服 用少量即能中毒,在人体内,尤其在肝癌病变部位很 难达到有效血药浓度,因此NCTD普通制剂治疗效 果不明显[5].将其制备成大小适中的纳米粒,有以 下两个优点:(1)NCTD纳米粒(norcantharidinnan— oparticles,NCTNP)栓堵于肝癌病变区的小动脉 内,能定向作用于肝癌组织,很少损害其他正常的组 织器官,避免了药物强烈刺激性引起的不良反应; (2)NCTNP延缓了药物的释放,可长时间维持有 效血药浓度,有利于彻底杀死癌细胞. 本实验以两性共聚物聚乳酸一聚乙二醇(PLA, PEG)为载体材料,采用相分离法制备了具有缓释效 应的NCTD-NP,考察了其形态,粒径,包封率及缓 释性能,比较了NCTD-NP与未包载的NCTD的细 [基金项目] O452nm059) [作者简介] 导师.E-mail 上海市科委纳米专项课题资助项目(No. 任杰(1965一),男(汉族),博士,教授,博士生 renjie6598@163.com 药学服务与研究PharmCare&Res2007Aug;7(4) 任杰,等.去甲斑蝥素聚乳酸一聚乙二醇纳米粒的制备及细胞毒性实验?295? 胞毒性,为进一步的动物实验打下基础. 1材料和仪器 1.1材料细胞株:人胆囊癌GBC—SD细胞株(中 国科学院上海细胞生物研究所).PLA—PEG共聚 物摩尔质量(Mw)一3×10g/tool,PLA:PEG为 5:l(同济大学材料科学与工程学院纳米与生物高 分子材料研究所自制);NCTD及NCTD-NP(本所 自制);吐温,8O,丙酮,二氯甲烷,乙腈和磷钨酸均为 分析纯(国药集团化学试剂有限公司);小牛血清(杭 州四季青生物公司);DMEM培养基和胰蛋白酶 (Gbico公司);二甲亚砜(Sigma公司);四甲基偶氮 唑盐(Sigma公司),以pH7.4的磷酸盐缓冲溶液配 制成5mg/mI的溶液,抽滤除菌,4vC保存. 1.2仪器H01-3型恒温磁力搅拌器(上海梅颖浦 仪器仪表制造有限公司);FA—l104型电子天平(上 海民桥精密科学仪器有限公司);FD-1型冷冻干燥 机(北京博医康实验仪器有限公司);WZS一50F2型 微量泵(浙江大学医学仪器有限公司);ZRS_8C型 智能药物溶出试验仪(天津大学无线电厂);U一1800 型紫外分光光度计和H一600透射电镜(日本日立电 器公司);透析袋截留Mw为8000,1.4× 10g/mol(国药集团化学试剂有限公司);FCS00型 流式细胞仪和I$230型激光粒度分析仪(美国 BeckmanCoulter公司);AnnexinV—FITC凋亡检 测试剂盒(美国BDPharmingen公司);倒置显微镜 (重庆光学仪器厂);l100型高效液相色谱仪(美国 Agilent公司);Watersnova—pakCm色谱柱(美国wa— ters公司);802号电动离心机(上海手术器械厂). 2方法 2.1相分离法制备纳米粒分别以丙酮和水作为 油相溶剂和水相溶剂,采用相分离法制备载药纳米 粒.将0.04gPLA—PEG溶于丙酮中配置成2OmL 的油相溶液,将0.06gNCTD溶于去离子水中配置 成2OmL的水相溶液,将油相以40mI/h的速度逐 滴加入到高速搅拌的水相中.滴加完毕后,继续搅 拌,使丙酮自然挥发.去离子水透析3d,以除去溶 液中残留的药物和吸附在纳米粒表面的药物,冷冻 干燥得到PLA—PEG包裹的NCTD—NP. 2.2粒径的测定将所得的NCTD-NP悬浮液置 于超声振荡器中使其分散均匀,用激光粒度分析仪 测定粒径及粒径分布.然后,用铜网蘸取纳米粒悬 浮液,用l磷钨酸溶液染色,以透射电镜在加速电 压为75kV时观察纳米粒并拍照. 2.3包封率的测定(1)标准曲线的制备精密称 取NCTD对照品适量,置于50mL容量瓶中,用乙 腈溶解.超声振荡5min,加乙腈至刻度,摇匀,得 到浓度为100#g/mI的溶液.精密吸取2.0,4.0, 6.0,8.0,l0.0,l2.0mL,分别置于25mL容量瓶 中,加乙腈至刻度,摇匀,得到浓度为8.0,l6.0, 24.0,32.0,40.0,48.0#g/mI的标准曲线工作液. 色谱条件:Agilent高效液相色谱仪,色谱柱为 Watersnova—pakCm柱(3.9mm×150mm,4"m); 流动相为乙腈:水(9:1),取2O"I进样.测定峰 面积,以峰面积(A)对样品浓度(f)进行线性回归, 得到方程为:A一3.570×10.c一0.5506,r一 0.9990.标准曲线的线性范围为8,48#g/mI. (2)包封率的测定称取适量NCTD-NP粉末,加入 乙腈溶液,6O?水浴温热2h,在室温下自然冷却. 根据标准曲线方程计算出浓度(c),按下式计算包封 率和载药量:包封率一(c×乙腈溶液总体积/投药 量)×100;载药量一(r×乙腈溶液总体积/载药粉 末总重量)×lO0. 2.4体外释药特性的测定 2.4.1标准曲线的制备精密称取干燥至恒重的 NCTD粉末适量,用pH7.4的磷酸盐缓冲液溶解, 分别吸取0.5,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,5.0mI稀释 至lOmI,得到系列浓度为5,50#g/mI的标准曲 线工作液.此溶液在204nm处有最大吸收,空白 纳米粒溶液在此波长处无吸收干扰.用紫外分光光 度计于(204?1)nm测定吸光度,将吸光度(D)对 浓度(c)进行回归,得标准曲线方程:D一 3.2617c+4.8l28×l0一,r一0.9995.标准曲线 的线性范围为lO,50#g/mL. 2.4.2释放度的测定精密称取NCTD-NP约 50mg,装入透析袋中,以500mIpH7.4的磷酸盐 缓冲液为释放介质,放人37-C恒温水浴槽中,在第 l,2,7,8h……分别取样3mL,同时加入等体积的 新鲜释放介质,于(204?1)nm处测定样品吸光度, 根据标准曲线方程计算释药量. 2.5细胞培养用含l5小牛血清的DMEM培 养液在37?,5CO:培养箱内培养细胞.当细胞 长满瓶底8O并贴壁后,用0.25胰蛋白酶消化, 倒置显微镜下观察见细胞间隙增大,胞质回缩时终 止消化,然后分瓶再培养.待进入对数生长期时(表 现为细胞贴壁,胞浆延展,约为传代后24h)弃去原 培养液,用D-Hanks液冲洗后用于实验. 2.6药物半数抑制浓度(IC.)的测定和浓度效应关 系应用MTT法进行体外细胞杀伤实验.实验分 ? 296? ISSN1671—2838PharmCare&Res药学服务与研究2007Aug;7(4) www.pcarjourna1.net.crlE—mailPharmCR@yahoo.com.crlPhn/Fax86—21-65519829 为NCTD组和NCTD-NP组.NCTD和NCTI).NP均 用生理盐水稀释成5,10,20,40,80,160,320,640, 1280,2560t~g/mL共10个浓度. MTT法的具体操作步骤同文献[6].以 NCTD或NCTD-NP浓度为横坐标,细胞抑制率为 纵坐标,绘制药物浓度效应曲线,并计算半数抑制浓 度IC..IC.一lg-1[x一I×(?P一0.5)].其中 x为最大剂量对数值;I为相邻两组剂量比值的对 数(以高剂量做分子),P为细胞抑制率.抑制 率(oA)一[(对照一本底)一(给药一本底)]/(对照一 本底)×100,?P为同组细胞抑制率总和,并以 IC.计算软件校正.同样实验重复3次. 2.7药物IC.时间效应关系测定实验分为 NCTD组和NCTD-NP组,每组设定3复孔,每孔 分别加入空白DMEM培养液,含Ic.浓度的 NCTD或NCTD-NP的DMEM培养液200L.在 37?,5C0培养箱内分别培养2,6,12,24,48h, 余下操作步骤同2.6项.以时问为横轴,细胞抑制 率为纵轴,绘制药物效应一时问曲线. 2.8统计学处理所有数据用SPSSl1.0统计软 件包进行处理.计量资料用?S表示,各组及组问 比较用Y分析. 3结果和讨论 3.1纳米粒的形态,粒径大小及分布利用激光粒 度仪和透射电镜考察载药纳米粒的粒径及粒径分 布,见图1和图2. 激光粒度仪的分析结果表明,NCTD-NP的粒 径为(97.4土14.5)nm.从TEM图中可以看出,纳 米粒外观圆整,颗粒大小均匀.本实验中,聚合物用 量为0.04g,NCTD投药量为0.06g,产物包封率 为(51.7?1.32),载药量为(36.5?0.94). ^ V 丑 求 妞 粒径分布(j/nm) 图1去甲斑蝥素纳米粒的粒径分布曲线 Fig1Thegrainsizedistributioncurve ofnorcantharidinnanopartlcles 图2去甲斑蝥素纳米粒的透射电镜照片 Fig2TEMphotoofnorcantharidlnnanoparticles 3.2体外释药特性一般认为纳米粒的释药过程 存在材料降解控释和药物扩散控释两种机制,这两 种机制在药物释放的不同阶段分别起作用__7].采用 相分离法制备的纳米粒,亲水性的药物在纳米粒形 成的过程中较易集中在纳米粒表层或者接近表层的 部分,因此在前2h释放较快,累积释放率接近 20.之后随着聚合物的降解和药物扩散,药物均 匀地从纳米粒中释放出来,速度较为均匀,直至 24h时,累积释放率达到60,41h药物释放完全, 其释放曲线见图3. ^ V 槲 辎 ?弗 时间(t/h) 图3去甲斑蝥素纳米粒的体外释放曲线 Fig3ReleaseprofileinvitroofPLA_PEG nanoparticlesloadedwithnorcantharidin 3.3对胆囊癌GBC—SD细胞的抑制作用 3.3.1药物对GBC-SD细胞抑制作用的浓度效 应采用MTT法测定未包载的NCTD和NCTI).NP 对肿瘤细胞GBC-SD的抑制作用,结果见表1. 从表1中可以看出,NCTD和NCTI).NP对细 胞生长的抑制作用均随着药物浓度的增加逐渐增 强,当药物浓度较低(0.83g/mL)时,两者对 GBC—SD细胞的抑制不明显;随浓度增加抑制作用 开始显现并增强,浓度426.67t~g/mL时抑制率达 82.23和88.67,呈明显的剂量效应关系. 药学服务与研究PharmCare&.Res2007Aug;7(4) 任杰,等.去甲斑蝥素聚乳酸一聚乙二醇纳米粒的制备及细胞毒性实验?297? NCTD组和NCTD-NP组的细胞抑制率无显着性 差异(P>0.05).通过计算,得出NCTD和NCT【)I NP的ICjo分别为6.21ffg/mL和5.61ffg/mL. 3.3.2IC;.浓度的药物对GBC—SD细胞抑制作用 的时间效应表2中比较了0,48hIC.浓度的 NCTD和NCTD-NP对GBC—SD细胞生长的抑制 作用.从表2可知,NCTD组在24h细胞抑制率达 53.40,随后明显下降,48h降低到23.14. NCTD-NP组随时间延长,细胞抑制率明显增加, 24h后仍缓慢上升,48h时达56.42.NCTD组 和NCTD-NP组在不同时间点的细胞抑制率,前 24h两者无显着性差异(P>0.05),但是第48小时 有非常显着性差异(P<0.01).NCTD和 NCTD—NP对胆囊癌GBC—SD细胞均显示了较强的 抗癌效应,但NCT~NP的抗癌作用更为持久. 纳米材料的生物安全性是近年来备受关注的研 表1不同浓度去甲斑蝥素和去甲斑蝥素纳米粒对胆囊癌GBC-SD细胞生长的抑制作用 Table1Inhibitoryeffectsofdifferentconcentrationsofnorcantharidinand norcantharidinnanoparticlesongrowthofGBC-SDcells ("一3,oZ"?S,) 表2IC.浓度的去甲斑蝥素和去甲斑蝥素纳米粒对GBC—SD细胞抑制作用的时间效应 Table2Inhibitoryeffectsofnorcantharidinandnorcantharidinnanoparticles atIC50ongrowthofGBC-SDcellsatdifferenttime ("一3,oZ"?S,) 一P%0,01,与去甲斑蝥素组比较 究热点,良好的生物相容性是纳米医用材料的首要 必备条件.本实验使用的聚乳酸是美国FDA批准 可用于临床试验的生物可降解的合成高分子材料, 它在体内代谢的终产物是CO.和H(),对人体无 毒,生物相容性极佳,并且降解时问可以根据PLA 和PEG的比例来调节,从而调节药物的释放速度, 可以对包载的药物起缓释作用.由于聚乳酸纳米粒 还存在粒子表面疏水,亲水性差,细胞亲和性低等缺 陷,因此,作者最终选用两亲性载体PLA—PEG作为 制备NCTD的载药纳米粒.PIA—PEG共聚物在水 性环境中,自组装形成核一壳结构的球形纳米粒,其 疏水性内核可作为缓释药物的优良微药库,PEG则 形成亲水的外壳,使纳米粒的稳定性增强.以 PLA—PEG为载体的载药纳米粒进入体循环后,能 顺利地通过任何血管,达到靶部位,并可被细胞吸 收,因此是一种理想的靶向载体.纳米制剂可有效 提高药物生物利用度,增大局部血药浓度,显着减小 药物用量,减轻全身毒副作用.通过缓释或控释制 剂可以延长药物有效作用时限并可减少给药次数, 减轻病人痛苦,可实现介入或肿瘤内直接注射给药. [参考文献] L1JWangGS.MedicalusesofmylabrisinancientChinaandre— centstudiesEJ~.JEthnopharmacol,1989,26(2):147—162. [2]张莉,向东,洪诤,等.肝靶向去甲斑蝥素微乳的研究 EJ].药学,2004,39(8):650655. E3]张泰松,程树仓,臧恒昌,等.去甲斑蝥素诱导细胞凋亡的研究 进展[J].海峡药学,2005,17(3):125127. [4]温祥云,孙骏奇,甘哲,等.去甲斑蝥素对实验性肝炎的药理 研究?.去甲斑蝥素对正常肝脏毒性作用的病理形态学观察 [J].北京第二医学院,1985,6(4):259-261. E53Liux,HengWS,Paul,eta1.Novelpolymericmicrospheres containingnorcantharidinforchemoembolizationEJ].JControl Release,2006,116(1):35—41. E6]赵婷秀,陈振发,邱幸凡,等.MTT法分析含药血清对体外培 养肺癌细胞增殖的影响[J].数理医药学杂志,2006,19(3): 239—241. E7]任杰,宋金星.聚乳酸及其共聚物在缓释药物中的研究及应 用EJ].同济大学,2003,31(9):10541058. [收稿日期]2006—12-05[修回日期]2007—05—28 [本文编辑]兰芬姚春芳