FISH技术检测CLL染色体异常的价值（可编辑）

FISH技术检测CLL染色体异常的价值（可编辑） 山西医科大学 硕士学位论文 FISH技术检测CLL染色体异常的价值 姓名:李明利 申请学位级别:硕士 专业:血液内科学 指导教师:周永安 20100315山两医科人学硕上学位论文 技术检测染色体异常的价值 摘 要目的: .研究荧光原位杂交技术 嘶,在检测慢性淋巴 细胞白血病 ” 锄,染色体异常中的价值;.探讨患者染 色体异常与其他预后指标的相关性; 方法:运用荧光原位杂交技术对例患者进行及的检测,临床分期 按照分期方法,采用确切概率法分析,与患者年龄、性别、 外周血淋巴细胞绝对计数、分期、血清乳酸脱氢酶 ,、血 清微球蛋白.,、表达之间的相关性及治疗组、未治疗组与 、砌的相关性,户.差异有统计学意义。 结果:例患者中,例有缺失,例有缺失,染色体异常的 检出率为.%。 、与年龄、性别、血淋巴细胞绝对计数、、一无明显 期 相关性尸.。缺失的发生率与分期无明显相关性尸., 的缺失的发生率明显高于期,且差异有统计学意义妒.。 在高表达组中,恤基因缺失的发生率均明显高于低表达组,在 低表达组,基因缺失的发生率均明显高且差异有统计学意义妒.。 结论: 技术可以明确常规染色分析中复杂染色体异常,是一种在分析患 者染色 体异常方面较为快速、准确和敏感的方法; 的表达是重要的预后因素,是疾病侵袭性的一个重要标志,的高 表达或提示患者的预后较差,而的低表达和或常提示预后 较好。 关键词慢性淋巴细胞白血病 荧光原位杂交技术染色体异常表达 山两医科大学硕士学位论文 . 嘶 :硎 . 锄 . 如 . : 妣 刎?郴 锄 . .砸 锄 鲫 够嬲 , 【,,舯 , , 一一, 】. : 咄 、糯而册 ; / ; %. 觚 ; . .% / %啪 , ?/ 、 肌 .锄 萨 ” ? , ?,, ” , :.酉,鹏?懈?朗 、?粥 玎 眦 . , 孤 锄 :硫 嬲曲 印 曲 也尸.. :够, 毋 【扎 锄 龃觚/旬 印 ,锄锄伽呲觚砌. 砖陆: 如 沁耐惋 恤 ?山两医科人学硕::学位论文 主要英文缩略词表 英文缩写 英文全称 中文译名 舛 慢性淋巴细胞白血病 晡 荧光原位杂交技术流式细胞术乳酸脱氢酶 嬲淋巴细胞倍增时间 ” 中位生存期 总的生存期 美洲商陆 植物血凝素 ”血清微球蛋白 视网膜母细胞瘤基因杂合性缺失 仆匆 免疫球蛋白重链基因可变区 蚰吼 基因 一 翱孙嬲 . 聪相关的?蛋白 学位论文独创性声明 本人郑重声明,所呈交的学位论文系在导师周永安教授指导下本人独立完成的研究成 果。文中任何引用他人的成果,均已做出明确标注或得到许可。论文未包含法律意义 上已属于他人的任何形式的研究成果,也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本文如违反上述声明,愿意承担以下责任和后果: 、交回学校授予的学位证书; 、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报; 、本文按照学校的方式,对因不当取得学位给学校造成的名誉损害,进行公开 道歉。 、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 论文作者繇垄蜱酗 日期:出年』耻日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权山西医科 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索,可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时,署名单位 仍然为山西医科大学。 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名: 日期:汐吵年期?/日 日 指导教师签名: 日期:夕驴 年月? 本声明的版权归山西医科大学所有, 未经许可,任何单位及任何个人不得擅自使用山两医科大学硕二:学位论文 ??’? 刖蟊 慢性淋巴细胞白血病 ” ,是西方国家最常见的白血病 类型,岁以上人群发病率大约为例/万?,占全部白血病的%,男性发病率高于女 性,男:女《.~:】。该病在中国及其他亚洲国家少见,近年来由于人口老龄化及多种 因素的影响,患者在我国似有增多及年轻化趋势。慢性淋巴细胞白血病是造血组织原 发恶性肿瘤,系单株免疫无能的长寿小淋巴细胞恶性增殖与积蓄性疾病,单克隆性增殖的 小淋巴细胞形态上类似成熟淋巴细胞,但是一种免疫学不成熟的、功能不全的细胞,其在 体内积聚使血液和骨髓中淋巴细胞增多,淋巴结、肝、脾肿大,最后累及淋巴系统以外的 其他组织器官。 的临床过程呈高度异质性,部分患者在整个的疾病过程中,没有症状和体征,不 需任何特殊的治疗,一些患者发病即成侵袭性,很快需要治疗【。因此,其预后参数的选 择对合适的治疗策略极为重要,也是研究者关注的重点。早期认为年龄、性别、疾病分期、 、.、、外周血淋巴细胞绝对计数、免疫球蛋白重链基因可变区基因啪伊 ,的突变状态【卅,或替代标志物?【和 .睁】等,是判断预后的主要参数。随着免疫学、细胞/分子遗传学及分子生物学 研究的进展,预后因素的研究进展迅速,不仅认为分子遗传学异常在.的发生和 发展中属高发事件,而且对.预后、治疗的反应、总的生存率诵,判 断起重要作用。 常规染色体显带技术,仅%的可检测到克隆性染色 体异常,加用有丝分裂原刺激剂后,有近%可检测到异常。荧光原位杂交,术由于不受细胞分裂的影响,应用时既可检测分裂相,也可检 ,约%患者可检测到染色体异常 测间期细胞,大大促进了遗传学研究的开展【 【。最常见的为:、、.、、.及【,并且这些异常与预后 有着密切的关系。我们运用技术分别对例患者进行、:检测, 揭示的分子遗传学特性,并探讨染色体异常与其他预后指标性别、年龄、外周血淋巴 细胞绝对计数、疾病分期、的关系。山西医科人学硕士学位论文 第一章和方法 .实验材料 .研究对象 年月至年月我院住院和门诊收治的例患者初诊患者例,复 诊患者例,其中复诊患者中不需治疗组例,需要治疗组例,其中男例,女 例,男:女比为.:,年龄~岁,中位年龄.岁,岁以上包括岁例占%, 全部患者的临床表现、血象和骨髓象均符合的诊断标准【,临床分期根据国际 会议推荐的分期方法【】期例、期例、期例。例患者全部应用 技术检测号及缺失情况。对照组分别选用同期例缺铁性贫血患者染色 体标本。 .实验主要仪器设备 仪器产地 仪器名称 ? ,? ,? ,? 微量法国 加样器 天津塘沽澳科精细化工有限公司 精密试纸 上海天平精细化工有限公司 电子天平 一一台式高速离心机 上海安亭公司 开 迷你离心机 杂交仪 ? 高级恒温水浴锅 上海新苗医疗器械制造有限公司 电热恒温水浴箱 北京金菩嘉医疗科技有限公司 ?以荧光显微镜 北京金菩嘉医疗科技有限公司 染色体图像及荧光原位杂交分析软 美国 公司的 流式细胞仪 型 山两医科大学硕士学位论文 .实验试剂 试剂 来源 低渗液 自配 固定液 甲醇:冰醋酸: 淋巴细胞分离液 上海恒信化学试剂有限公司 北京金菩嘉医疗科技有限公司 ×,. 北京金菩嘉医疗科技有限公司 ×,. 甲酰胺洗涤液%甲酰胺/× 北京中山生物技术有限公司 .%./×洗涤液. 上海生工生物有限公司 无水乙醇溶液 天津市化学试剂三厂 胃蛋白酶 广州中山达安生物技术有限公司 探针来源 北京金菩嘉医疗科技有限公司 , 美国公司生产 一 、、 . 公司 美国 .主要试剂配制 .. .?低渗液:氯化钠.加入去离子水搅匀,用去离子水定容 至硼,?保存备用。 ..固定液:量取甲醇和冰醋酸,充分混合。使用前新鲜配制。 .. ×,.:氯化钠和柠檬酸钠溶于去离子水,充分溶解,室温下 调节值至.,用去离子水定容至。使用期间?储存。 .. ×,.:由×.加入去离子水,充分混匀,室温下 调节至.,用去离子水定容至。使用期间?储存。 .. 甲酰胺洗涤液%甲酰胺/×:甲酰胺,×.,充分混匀, 室温下调节溶液值至.肚.,用去离子水定容至。使用期间?储存。 等量分装至 三个考普林瓶。 .. , . ,去离子水 .%忡/×洗涤液.:×. ,充分混匀,室温下 调节至.,用去离子水定容至。使用期间? 储存。 ..乙醇溶液%乙醇、%乙醇:将“、无水乙醇用去离子水稀释至, 山西医科大学硕士学位论文 使用期间?储存。 .. 咖的胃蛋白酶储存溶液:溶解胃蛋白酶,于无菌水中, 煮沸分钟,冷却至室温,.?分装储存。 . 实验方法 .检测 ..标本前期处理 无菌条件下采集骨髓标本~,注入生理盐水混匀,加入淋巴细胞分 离液, 以 ,离心,仔细分离白细胞层。以/,离心,弃上清。加入 . 低渗液,充分吹打,于?水浴箱静置。然后加固定液:甲醇/冰 醋酸“,混匀,以/:,离心,弃上清。加入固定液,静置,离 心/,;弃上清,加入固定液,混匀,离心同前:弃上清,加入 固定液,混匀,离心同前;加入适量固定液配成细胞悬液,置一? 保存备用。对照组处 理方法与之相同。 ..操作过程 取储存于.?的浆细胞或染色体标本对照组,换用新鲜:甲醇/冰醋酸固定液, 气干法滴片,晾干,过夜老化。室温下在× .溶液中浸泡玻片两次,每次, 然后将玻片依次置入.?预冷的体积分数分别为%、%、%梯度乙醇室温脱水, 每梯度,自然晾干玻片。在避光条件下,充分混匀含探针的杂交混合液,吸取肛其 中去离子水肛、杂交缓冲液斗、探针“然后加于玻片杂交区域,盖好盖玻片,用封片 胶美国,公司将四周封牢,置于杂交仪砷湿盒中变性杂交。变性:?, ;杂交:?,。次日,将杂交后标本在?的%甲酰胺溶液中洗涤次,每 次血, 然后在×溶液中洗涤 ,.%溶液洗涤,最后用%乙 醇室温脱水。避光晾干后加二咪基苯基吲哚/抗淬灭剂美国,公司 复染。暗处静置.。 ..荧光显微镜观察 用玎荧光显微镜,在/滤色镜的激发下观察间期细胞的荧光杂 交信号,不计重叠细胞,细胞核要有光滑圆融的边界,且结构完好,只计数有明确信号的 细胞核,每例至少分析个细胞,采用金菩嘉公司图像分析软件系 统讯. 采样分析。 .抗原检测.分析 抽取肝素抗凝的新鲜骨髓或外周血小时内,调整细胞密度至..×/,采用三 色流式细胞术常规检测胞膜抗原标记,至少检测 个细胞,诊断依据计分系 山两医科人学硕:学位论文 统,同时记录/比值,/比值为比例倒置。当确诊后,加做/ /和/组合检测。分析取管,分别为全血出加抗体组合. /./.及同型对照管,避光分钟,溶血后上机检测。直接分析细胞 双阳性细胞中的表达率。表达率在细胞中以之%为高表 达组,%为低表达组。 .其他临床指标检测 患者清晨空腹抽取的静脉血,分别用于检测外周血淋巴细胞绝对计数、和., 血清活性采用生物化学方法测定, /为异常;陀.水平采用放射免疫学方法 检测,./为异常。 .统计学处理 计量资料以均数士标准差士表示;计数资料以率表示;阳性率及觚 与性别、年龄、、外周血淋把细胞绝对计数、血清微球蛋白、分期及 治疗组,未治疗组的相关性用确切概率法,,.为差异有显著意义。山西医科大学硕上学位论文 第二章实验结果 . 检测 . 对照组结果及阳性结果标准的确定 .. 探针 探针分析个 对例缺铁性贫血患者的骨髓标本中每个样本用位点 问期细胞,如出现个红色信号,则为正常间期细胞,出现个红色信号或无信号,则是 缺失假阳性,以阳性细胞大于士作为阳性标准,基因缺失阳性标准为.%。 ..序列特异性探针 对例缺铁性贫血患者的骨髓标本中每个样本用位于.位点的序列特异探 针,分析个间期细胞,可见个绿色杂交信号,可见个或无杂交信号;出现个或 无杂交信号的间期细胞是假阳性细胞;以阳性细胞数士 作为标 准,删 的阳性标准为.% .病例组缺失及检出情况 例患者骨髓涂片标本分析个间期细胞结果显示,例%显示 存在缺失,例%的患者检测出存在缺失,总缺失率为.%。 .分子遗传学异常与其他预后相关因素的关系 例男性患者中例有,例有;例女性患者中例有 ,例有;例岁以上患者中例%有,例有舡; 例岁以下患者中例%有缺失,例有;例期的患者中例 有,例有;例 期患者例有缺失,例有;例 期的患者中例有,例有;例/患者例有 缺失,例有:;例/患者例有缺失,例有砸; 例外周血淋巴细胞计数×/患者例有缺失,例有;例外周血淋 巴细胞计数×几患者例有缺失,例有缸;例血清一?. ‖患 者中例有,例有::例血清.. /患者中例有缺失, 例有廿;例高表达患者中例有,例有;例 低表达患者中例有,例有:。具体见表,表。 对检测结果与患者多项临床预后指标的统计分析发现:钟确切概 率法 分析发现,与患者性别、年龄、外周血淋巴细胞绝对计数、血清 和.水平之间及与似分期无明显相关性胗.,而在高表达 组中,基因缺失的发生率均明显高于低表达组,且差异有统计学意义.; 在低表达组中,基因缺失的发生率均明显高于高表达组,且差异有 期的发生率明显高于 期,且差异有统计 统计学意义尸.。在恤 山西医科大学硕:七学位论文 学意义卢.;在治疗组中,基因缺失的发生率均明显高于未治疗组,且差异有 统计学意义.。 山西医科大学硕.:学位论文 第三章讨论 是一种低度恶性的小淋巴细胞克隆性疾病,以外周血及骨髓中成熟的淋巴细胞计 数升高为主要临床特征,免疫表型特征为,多见于老年男性,其中. 多见,约占%】,具有显著的临床预后异质性,中位生存期.年不等。.患者中, /不需治疗,存活期长;另有/早期表现呈惰性,随后进入进展期;还有/开始即表现 。因此,其预后参数的选择对合适的治疗策略极为重要,也是研 为急性,需要立即治疗【 究者关注的重点。随着细胞遗传学的发展,染色体异常作为重要的独立的预后指标逐 渐得到人们的重视。 由于的白血病细胞有丝分裂活性低下和植物血凝素, 主要系细胞激活剂,的染色体研究长时期内进展十分缓慢,早年采用不加有丝分裂 原的骨髓细胞培养或加刺激的外周血培养,大多数细胞显示下常核型,仅%的 可检测到克隆性染色体异常。以后由于加用多克隆细胞激活剂,如美州商陆 ,、脂多糖:,等有丝分裂原刺激剂后,的染色体研 究才取得了突破,有近%可检测到克隆性染色体异常,常见的异常是,其次为 号和号染色体长臂的结构异常【。由于细胞有丝分裂活性较低,且受有丝分裂原的种类、 浓度和处理时间等影响,因而方法不一定能真实地反映核型状况。 技术是细胞遗传学、分子遗传学和免疫学相结合的基础上发展起来的一种新技 术,是基于碱基互补配对的原理,利用非放射性物质如生物素或地高辛配基,或者直接以 荧光杂交标记的核酸探针与染色体上相应特定核酸序列结合,通 过观察荧光信号可直接分 析结果,它除了可分析中期细胞,还能对问期细胞和终末细胞进行检测,因而有相当高的 染色体异常检出率及能对已知序列片段的变化进行高度敏感、特异的检测。的应用 不但极大地扩展了染色体分析的范围,而且显著地提高了其识别异常的能力,应用约 %患者可检测到染色体异常【?,其中最常见,其次为.、、 和。 等使用一组探针和研究例患者,发现有例%具有染色体 异常,其中最常见的染色体异常为%,其后依次%、%、 %和%。【】等采用检测例患者的染色体异常, 发现%的患者至少种异常,其中以最常见%,其次为%、 %和 %。国内关于的研究报道显示,.%的患者存在种及 种以上染色体异常,最常见的为%,其他依次为.%、 %、重排.%‘。我们运用~组探针,利用技术检测了例患者的染色 体。结果发现,例.%存在遗传学异常,其中.%显示存在,基因缺 失.呦,与国内外的报道基本相符。 单纯常于认期时出现,预后较好,或与正常核型患者相似;若伴有、 山两医科人学硕上学位论文 .或.等其它染色体异常,则预后通常较差。等?】研究结果显示是 最 常见的遗传学改变,占的%,个月,无治疗生存期仃.骶 嘶, 最长达个月。随着研究的深入,发现若伴有其他染色体异常,则预后通常不好。 等【发现伴有其它易位的患者中位明显短于单纯患者个月个 月。国内研究结果显示,伴组的生存期长于无.组,两组相比有显著性差 异.。在中,%.%的病人存在?异常,临床表现为侵袭性病程,淋巴细胞倍 增时间缩短,对治疗不敏感,存活期较短。 锄 基因是位于 .基因富集区的一种可能与发生发展有着密切相关性的肿瘤抑制基因。据报道, 在?患者,基因功能异常比率高达%,缺失的发生率为%.%,一些患 者即便在初诊时没有缺失,但随着疾病进展,可出现锄的缺失,提示的缺失与 进展密切相关【。。基因位于常见的缺失区,可能在细胞周期调控和损伤修复 中发挥作用,且可能与激活肿瘤抑制基因有关,伴有基因缺失的患者,这类患 者发病年龄多较年轻,~般岁,且病程常表现为侵袭性,有广泛外周、腹部、纵隔淋 巴结肿大,疾病进行性进展,易发展至 期,生存期短,对治疗不敏感,预后差【】, 提示基因缺失可作为疾病进展的一个早期指标,.患者与无 .相比,有显著差 异个月个月。 目前大部分研究认为表达与预后呈负相关,【等【】研究了例患 者,发现伴缺失组的表达水平总体亦高于不伴缺失组,的表达作为患者 独立的预后因素逐渐引起人们的重视。年临床指南界定:阳性患者预后差, 阴性患者预后好。等?探讨了例.患者表达的临床意义,发现 患者无进展生存期较。者明显缩短年分别为%%,对化疗药物 反应差,病情进展迅速,完全缓解率低。等对例患者进行研究发现 与.相比,男性多于女性,血小板计数显著减少,而淋巴细胞计数明显增加;而在年 龄、水平、形态学及免疫学特征方面无明显差异。还是疾病侵袭性的一个重要标 志,无论患者的临床分期如何,即使处于沥分期的期,患者亦常具有明显的侵袭 性。以上这些资料显示的表达是的重要的独立的预后因素。国内研究资料显示: 高表达组中,基因缺失的发生率均明显高于低表达组,且差异有 统计学意义, 且的表达与疾病的进展具有相关性。 虽然关于预后因素的研究进展迅速,但到目前为止国际上还没有一个统一的预后 标准,不能根据预后风险来选择相应的治疗手段,关于的相关预后因素仍待进一步的 研究。由于本研究病例较少及时间紧迫等原因,未做染色体异常与患者总生存期随访, 各项预后指标单因素、多因素分析,仅就、与常见提示预后的实验室指 标做较初步的率的比较,结果提示了其有重要的临床价值,有待今后多中心合作研究以得 到更多、更具代表性病例样本,进行更深入、透彻的研究,以建立适合我国临床应用预后 山西医科人学硕.学位论文 评定体系,为临床治疗提供有用的信息。本研究表明,技术是一种在分析患者分 子遗传学异常方面较为快速、准确及敏感的方法,但由于随访时间短等因素,关于染色体 异常对患者的预后预测价值有待进一步的深入研究。 山西医科大学硕::学位论文 结论 第四章 遗传学异常在中属高发事件,是一种在分析染色体数目和结构异 常方 面较为快速、准确和敏感的方法,可为研究提供较为准确的分子 遗传学信息。 的表达是重要的预后因素,是疾病侵袭性的一个重要标志,的高 表达 或提示患者的预后较差,而的低表达和或 常提示预后 较好。山两医科大学硕:学位论文 参考文献 .砒肌 【】 ,鼢,, ? 眦“.阴. 沁.::~. . 硒 【】 , , ,觚 ” .【】. ;:~. . 【】 勾 , ,‰, 印蛐” .【】. ; :~.【】弧 , ?.巧.【】. ~. ,,: . 【】,,自谢 谢 .【】.如,:~. 锄 【】 ,缸 , 龇 . 【豁一 ?.【】.,,:~. . ,【】 , , 锄 一 蛳 .【】.,,:~. 而 .【】 ,舳 &?, 印,”印: .【】.,,:~. . 【】 , , , 邪朗珊舛 【.【】. ,:一~. .一【】砌八 , , 觚 印 嗵 ~ . 蛳 .【】.,,: .?【】】【 , , , 州 .【】.,,:~. 【】 ,?. 印疵 【. 蛳 叨.锄 鸭 ;:~. . 【】八& 如 【.川.时,,:~. . 【】胂印 山两医科人学硕二学位论文 .【】.,;:~. 【】张之南《血液病诊断及疗效标准》.第版.【】.北京:科学出 版社:~. ,. 【 】.【】. .;:~ ., ,‰ , 】训肌一萄 ,: 砒 .【】.. :~. ;. 锄 谢 】 【” .】. ,,:. ? , 【】 ,仳, .蛐 咖. 【】.,,:~. .【】 ,印 . ” “.【】.,,:~ .? 】 , 【 ,衄,?” 咖 硒 ” ,,:~. ,如 .阴. 】徐卫,李建勇,潘金兰.间期荧光原位杂交技术检测慢性淋巴细 胞白血病遗传学异常.【】. . 中华内科杂志;: .吮 弱谢 & 【】 , , 舛 .【】.;:~. 趾 . 纨 , , , 【】 瑚,曲觚 池妒 删衄喀 .【】. ,;: ~. , 【】鹏 , 砒 .印 .?. 【觚 瑙 妒 . .【】.’;:~ 【】李丽,徐卫,李建勇.慢性淋巴细胞白血病预后因素研究进 展.】.中华内科杂志,; :~. .. 【】 , , . , ” 懿证 舯廿 坞 / .【】.【 ~. 肿如;: . . , , 【】 ,山西医科人学硕上学位论文 .阴..,:~. .【】 ,硼 ,辩, 印 : 印.【】.,,:~. 西医科大学龋十学位论文 附录 、 、 。。、 、一 、 圈 荧光下细胞棱 露应用珈咖洲标记的位于的序列特异性探针进行检测结果出 现个信号表示发生了咖基因缺失,两个信号正常。 圈应用,进行检测结果出现个桔红色信号表示发生了日缺失山西 医科人学硕:卜学位论文 表 例患者确诊时主要实验室指标 山两医科大学硕十学位论文 表 号染色体缺失与实验室指标关系 表续表 表 缺失与实验室指标关系 表续表 山西医科大学硕上学位论文 表 治疗组与为治疗组与,的关系 山西医科大学硕::学位论文 综述 慢性淋巴细胞白血病的遗传学特征 慢性淋巴细胞白血病 ,是以外周血和骨髓中成熟小 淋巴细胞增多为特点的一组低度恶性淋巴增殖性疾病,是西方国家最常见的自血病类型, 多见于老年人,占岁以上白血病患者的%,男性发病率高于女性,男:女《.。:【。 在我国发病率相对较低,近年来随着我国人口老龄化及多种因素的影响,患者似有增 多及年轻化趋势。有两种类型,?占%,.仅占%【】。的显著特征 是:临床预后异质性,即:部分患者初始进展缓慢甚至终身无需治疗,部分患者发病即呈 侵袭性,需要即刻治疗【】。因此,其预后参数的选择对合适的治疗策略极为重要,也是研 究者关注的重点。传统用于判断预后的参数主要有年龄、性别、临床表现、疾病分期、 外周血淋巴细胞计数、血清.、等。随着细胞免疫学、分子遗传学及细胞生物 学的发展,预后因素的研究进展较为迅速。肿瘤细胞的遗传学标志物,如基因组变异、基 因异常和、免疫球蛋白重链基因可变区基因】突变状态或替代标志物 和. 是判断一预后的重要因素。近来的研究转向于分子遗传学方面,不仅认 为分子遗传学异常在.的发生和发展中属高发事件,而且对.预后、治疗的反 应、总的生存率,判断起重要作用。染色体异常作为重要的独立的预后指标逐渐 得到人们的重视,现将其研究进展做一综述: 染色体异常的检测方法 .常规细胞遗传学 常规细胞遗传学是通过获得有丝分裂中期分裂相来进行显带分析带、带。显带 分析可以同时对所有染色体的数目和结构改变进行初步识别,现在仍为临床工作中对遗传 学异常的筛查的常用方法。由于小淋巴细胞为终末分化细胞,增殖率较低,很难获得足够 的分裂相进行分析,并且中复杂核型常伴染色体形态差,凭借显带技术不能对所有异 常做出判断。? 年代末, 等人首次报道.有特异的染色体畸变。细胞遗传学研究亦证 实.染色体常发生畸变,如缺失,缺失,缺失,缺失和三体以及将 近位等【。染色体国际研究部以此做了总结,在收录的例 .病案中,有%为染色体三体,%为畸变,%为畸变,%为“畸变, %为本畸变【。但是,尽管在细胞培养中使用细胞分裂素,癌变的细胞在体外仍然 难以发生有丝分裂,所以,用传统的细胞遗传学方法,不能得到有代表性的癌变细胞的 遗传学图谱。 .分子细胞遗传学研究技术 荧光原位杂交技术:?间期该方法不受分裂相质量和数量的影响,不需 山两医科人学硕士学位论文 要制备中期细胞即可直接检测间期细胞的异常,可提高异常克隆检出率。可以节省制备染 色体的时间,操作步骤简单。间期还具有可量化和假阳性率、假阴性率低的优点, 且其敏感性高,完全符合临床诊断的需要。应用不同颜色的荧光探针还可同时检测多个基 因异常。它的缺点是,只能用特异性的探针检测已知的染色体异常,对涉及多种染色体的 复杂异常则不能澄清。?多重.:是应用种荧光素同时标记人类条染色体,相当 于在一次杂交中给每一条染色体都涂上不同的颜色,制备出整套染色体涂染探针,与待测 标本中期分裂相进行杂交。因此,难度.在确定染色体的结构或数量异常、揭示隐匿 易位及识别标记染色体的来源等方面具有优势,是精确染色体核型分析、检测复杂核型异 常所必不可少的先进技术。但此技术价格较昂贵且必须使用荧光显微镜和相应的图像分析 软件,限制了它在临床检测中的广泛应用。刘淑艳等发现.对染色体内的改变,如 小片段缺失和重复,检测效果较差,对这些异常需结合其他技术 进行检测。 荧光原位杂交一种通过用荧光标记的探针与特定基因组靶区域杂交,从而得到 所需图谱的分子细胞遗传学方法,适用于染色体任何结构变异和数量变异。此外,方 法优越于染色体显带技术的理由还在于所观察到的变异范围最小和最集中,即与探针等大 一般约为~×。最重要的是,它可以分析非分裂细胞的染色体异常,这种分析方 法被称为间期细胞遗传学【。.的癌细胞大多处于间期,恰好需要技术。通过 分析发现,.染色体畸变频率最高的是缺失%,其后依次为缺失 %,染色体三体%,缺失~%和缺失%。 比较基因组杂交越 确“,:抽提肿瘤组织和正常 组织的基因组,分别标记后作为探针与正常人染色体杂交,因而最适合于检测 实体瘤、淋巴瘤等不易得到高质量染色体标本的疾病,可在一次杂交中检测整个基因遗传 物质的增加或减少。但是它的精度有限,对微小的扩增或缺失检测不出,仅适用于对整个 基因组进行筛查;也无法发现平衡染色体易位。 常规染色体显带技术仅%的可检测到克隆性染色体异常,加用有 丝分裂原 刺激剂后,有近%可检测到异常。随着荧光原位杂交及比较基因组杂交技术 的发展,新的染色体异常不断被发现,约%患者可检测到染色体异常【?。最 常见的为、、.、、.及【,并且这些异常与预后关系密 切。正常核型的.患者平均生存期年,若有核型异常则为.年,同时伴有多种 染色体异常的患者比仅有单种变异的存活时间短。 .慢性淋巴细胞白白病常见的染色体异常: . : 缺失是目前研究得最多的.染色体结构异常,主要涉及号染色体部分或 全部缺失,是最常见的染色体异常,缺失区域与抗癌基因有关,大约%的. 具有染色体的缺失【】。早期研究提示肿瘤抑制基因.视网膜母细胞瘤基因位于山西医科人学硕::学位论文 此位点,可造成该基因的缺失,是引起的候选抗癌基因,以后发 现.中的纯合性缺失很少见,且沁眦在.区域构建一高分辨图,包 含、、,其中最常见的缺失片段为,并非位于.一. 的视网膜母细胞瘤基因缺失,缺失断裂点不在此部位,推测关键 基因 可能位于基因远端的两个微卫星标志和之间,约和之间,约 的区域内,其突变或缺失,可导致细胞增殖、失去负调控而致肿瘤发生引。 单纯常于魄气期时出现,预后较好,或与正常核型患者相似;若伴有、 .等其它染色体异常,则预后通常较差。等研究结果显示是最常见的 遗传学改变,占的%,中位生存期个月,无治疗生存期最长达 个月。随着研究的深入,发现若伴有其他染色体异常,则预后通常不好。出 等认为,一常于期时出现,预后较好,或与下常核型患者相似;而伴有、 . 或.患者的预后均较差,复杂异常和不良预后显著相关。一】等应用一系列探针对 例.患者进行检测,发现伴有其他易位的.患者中位明显短于单纯.患者 个月。 .: 应用技术发现见于~%的患者,在外周血、骨髓、淋巴结中均能检出, ~对号染色体中的一条染色体复制,另一条保留,存在于同一细胞, 形成三体。但在. 中很少发现部分染色体三体,因此难以找到染色体上与发病机理有关的基因。在不 典型中,的发生率显著高于典型,前者占.%.%,而后者仅占.%..%, 常在疾病的进展期或晚期出现。患者约%以上伴有不典型的淋巴细胞形态,和 强表达,分期提前,疾病进展,对嘌呤类似物的反应较差生存期短,预后差。 因而需要积极的治疗。但仅有改变,无复杂核型异常,细胞形态正常者,预后与核型 正常者基本相似。 .. 在中,%.%的病人存在.异常,常见的缺失位于.,其杂合性缺 失伴有触【基因缺失及.重排,基因的功能可能与激活肿瘤抑制基因有 关。约%的患者有号染色体的缺失,伴有号染色体异常者发病年龄多较年轻,一般 岁,且病程常表现为侵袭性,有广泛外周、腹部、纵隔淋巴结肿大,疾病进展, 短,预后差,淋巴细胞倍增时间缩短,对治疗不敏感,存活期较短。 据报道,在.患者,:基因功能异常比率高达%【踟,虹缺失的发生率为% .%,一些患者即便在初诊时没有:缺失,但随着疾病进展,可出现的缺失,提示衄 的缺失与进展密切相关】。突变的发生率约为%,其突变具有极高的异质性, 大多为复杂性杂合性突变,突变形式有错义突变、无义突变、剪切位点突变、小片断插入 突变等,其中主要为错义突变。中的突变点遍布:?基因的全长,并不在功能区们, %的廿基因突变可导致蛋白截短,严重影响蛋白功能,从而导致疾病发生【。也 山两医科大学硕士学位论文 有研究发现,在部分并未检测出缺失或突变的患者的瘤细胞中也存在着的低表 达,其机制尚未阐明,可能与关键区域其它相关基因的异常有关引。另外? 等研究发现基因某些位点上的多态性改变与的发病风险显著相关,如 和 ,其在患者的发生率明显高于健康对照组。等使用组%的 探针和问期荧光原位杂交 ,研究例, 患者具有染色体异常,其中.即缺失占%。【等运用对例患 者做了缺失的检测,其中例%存在的杂合性缺失,且仅有例伴有的 异常, 并证实了先前一项研究所发现的基因异常可作为蛋白失功能的一个替代途径,即 基因可不通过自身的突变或缺失,而通过其上游调节基因的突变致功能丧失,使细 胞凋亡受抑。 . ‰%患者伴有 .该种染色体异常与.基因缺失有关,缺失 患者,细胞形态多不典型幼淋.,血清增高,多处于疾病晚期、 期,对多种治疗包括核普类似物反应差,生存期短。?等研究发现有一者, 个月,最短至个月。等认为无基因缺失者用漂吟类似物治疗的 有效率较高,而有缺失的则治疗无效,氟达拉滨治疗后复发的患者常有基因异 常。因此基因是否缺失为临床治疗方案的选择提供指导,对于有基因缺失的患者, 应选用不涉及信号传导系统的药物。 . 是最常见的染色体异常之一,约%的存在畸变。是号染色体 长臂和另一条染色体易位所致,常涉及带,伙伴染色体可以是、、、、、肛、 和,但以;;和“;;.多见。前者导致位于的免疫球蛋白 重链与位于的细胞周期蛋白 ,并置,激活.肿瘤基因,淋 巴细胞数增高伴幼淋细胞增高;后者导致与位于的.并置,从而激活. 基因,是一种较少的但常常发生细胞恶性肿瘤的易位,年龄常常岁,淋巴细胞形态不 典型,疾病进展迅速,预后差。 .与预后 目前大部分研究认为表达与预后呈负相关,的表达作为慢性淋巴细胞 白血病患者独立的预后因素逐渐引起人们的重视。【:等【 研究了例患者,发 现伴缺失组的表达水平总体亦高于不伴缺失组,等【】探讨了例. 患者表达的临床意义,发现患者无进展生存期较一者明显缩短,年 分别为%%,对化疗药物反应差,病情进展迅速,完全缓解率低。以 等【】对例患者进行研究发现与一相比,男性多于女性,和血小板计数显著 减少,而淋巴细胞计数明显增加;而在年龄、水平、形态学及免疫学特征方面无明显 差异。还是疾病侵袭性的一个重要标志,无论患者的临床分期如何,即使处于贼分山两医科人学硕十学位论文 期的期,患者亦常具有明显的侵袭性。以上这些资料显示的表达 是的重 要的独立的预后因素。山两医科大学硕士学位论文 参考文献 ., 硼 【】 ,, 觚 肿 .【】. .;:~. . , , , 删 【】” 锄 .【】. ;:~. 血 ,. 【】 舯聊 .【】. . ~. ;: . 】 耐’锄勾 , ,.觚, 璐 硫 ” .【】.锄既 ::~. . 【】 唱, , 角 谢 伊 脚 伽?.叨.舱.;:~. 【】 ,硼 , .圮 肿如: .【】.,,:~. .【】 ,蚰,, 锄 珊” .】.协.,:~. , .矗卫 【】 ,肋 , ? 埘.【】. , ,:~. . ? 【】 ,? ,舛 【.【】.,,:~. ,? 【】 ,谢 . 鹳锄 如 【.川. 舯,,:~ .,【】 ,?”【, 蛐 【诵 ” ,,:~. 皿 .四. 【 ,?.谢 】 恤印 锄叩” .【】. ”,,:~. . 锄 【】蛔,,, ~. ,】叩如 .【】.,,:山两医科大学硕十学位论文 ?【 】 , , , .盯时” , ;:~ .明.锄 . .【】 , , :. 锄 ? 舯 .【】. ,;:~. . 岫 【 】, , &幻 , :~ ..【】.,; ” 【】李丽,徐卫,李建勇.慢性淋巴细胞白血病预后因素研究进展. 【.中华内科杂志,; :~. . 觚 【 】 , , , 印锄 也, ..【】. ,;: ~. . 【】 ,& , .?. ?锄.【】.西,;:~ . 】锄 , ,锄 , 觚 【舔 诵一 弱 呦础嘲觚.【】,;:~. . 【】甜 , 锣.【】. ;:~ ,】】 , . 皿】 ,宙.撕锄 : ~.【.【】.,; . 【】’ , , , ? 锄 .【】.斌 ‘ ::~. . 口】 , .【】. ,,:~. ? 【】 , , , .. 舯如 弱研 】 眦 砌?肌 删泌.叽. ~. ,;: ., , , 【】 山两医科人学硕士学位论文 .叨..,:~. 舯如 . ,啪, 【】 , 印: :~. 印?.【】.咖,,山两医科人学硕.学位论文 个人简介 姓 名 李明利 性 别 女 ?. 出生日期 籍 贯 山西柳林 毕业院校 山西医科大学 最后学历 硕士研究生 学习经历: .至.: 就读于山西医科大学临床医学系。 .至今, 就读于山西医科大学,攻读血液内科学硕士。 临床及科研经历: 大学期间在山西医科大学第二临床医学院实习,掌握了各科室基 本操作技能及诊治规范。 年月考入山西医科大学,攻读血液学硕士学位,接受了全方位的 研究生基础教育,熟 悉了从事研究方向的国内外最新进展,提高了阅读本专业外文期刊的能力,顺利地能过了国 家大学英语四、六级考试。受到良好的专业训练和能力培养,通过自己的刻苦努力的教师的 悉心教导,基本掌握血液科常见病多发病的诊断及治疗,能熟练地完成骨髓穿刺、骨髓活检 术;并对常见血液病的形态学一定的了解;但对于疑难病的诊治有待于进一步提高。科研方 面熟悉了荧光原位杂交技术的基本操作及理论基础,顺利完成了课题研究任务。 在校期间发表文章: 《技术在检测慢性淋巴细胞白血病基因缺失中的应用》发表于‘白血病? 淋巴瘤》杂志; 山西医科大学硕士学位论文 致谢 时间过得真快,转眼间三年的学习就要结束了,值此论文完成之际,我要衷心感谢我 的导师周永安老师三年来对我在学业上的精心教导、科研上的言传身教以及生活上的亲切 关怀。本课题从选题、设计、实验进行到论文撰写无不凝聚着导师的智慧和汗水。恩师渊 博的学识、严谨求实的工作作风和认真敬业、无私奉献的工作态度将使我终生受益。他谦 逊、善良的人品永远是我生活中的~面明镜,他永远是我学习和工作中的榜样。 特别感谢山西省肿瘤医院血液内科苏丽萍主任医师对我在思想上和临床实习上严格 要求,生活上关心爱护。她精湛的医术、高尚的医德医风、平易近人的工作作风,使我获 益颇丰。她将成为我终身学习的楷模我所取得的点滴迸步,都是老师辛勤培养的结果, 在此致以最诚挚的敬意和感谢 感谢山西医科大学第二医院血液内科姜波老师和郑转珍老师在临床实习中给予的指 导和教诲 感谢山西省儿童医院分子生物学实验室武坚锐、孙夏瑜、李蓉蓉老师在实验的不同阶 段给予的热情帮助和指导,使我的研究生课题顺利完成。 感谢同窗好友李茜汝、郑美婧、段静静,赵永峰与我一起携手走过三年美好的时光, 正是这种相互信赖与依靠,使我在整个学习过程中充满了信心与力量。感谢师妹安晓庆、 窦娟,师弟陈明在标本收集及病例资料整理等过程中给予的无私 帮助 衷心地感谢我挚爱的父母双亲,他们的养育和无私关爱给予了我无穷的动力,使我迈 过了多年求学旅途中一个个艰难和坎坷,没有他们,我将无法完成学业 再次感谢家人和朋友对我学习生活始终如一的支持和鼓励