超声波辅助提取葡萄籽中原花青素（已处理）

超声波辅助提取葡萄籽中原花青素（已处理） 超声波辅助提取葡萄籽中原花青素 东北林业大学 硕士学位论文 超声波辅助提取葡萄籽中原花青素 姓名:汪振洋 申请学位级别:硕士 专业:林产化学加工工程 指导教师:张世润;钱学仁 2002.5.1摘 要 本论文研究了常温下以超声波为辅助手段从脱脂葡萄籽中提取原花青素的方法。提取 和 出的原花青素分别在 处用紫外和可见分光光度法定量。结果表明,超声 波的空化作用有助于增强溶剂对植物组织的渗透及对细胞壁的破坏,促进有效成分的释放, 缩短提取时间,在较低的温度下将原花青素从葡萄籽中提取出来。对产品液相色谱及红外 光谱的初步分析表明,在论文实验条件下超声波对原花青素结构和组成无明显影响。 研究了在室温条件下影响原花青素提取率的因素。对含水率为.%的葡萄籽,以丙 酮一水混合溶剂作提取剂时,丙酮浓度为%提取效果最好;以乙醇一水混合溶剂作提取 , 剂时,乙醇浓度为%提取效果最好。两种溶剂对原花青素提取效果的比较表明,%丙 酮溶液对原花青素的选择性高于%乙醇溶液。产品的纯度依次为丙酮超声法,丙酮震荡 法乙醇超声法乙醇震荡法。对于丙酮提取,超声法产品纯度为.%,震荡法产品纯度 为.%;对于乙醇提取,超声法产品纯度为.%,震荡法产品纯度为.%。超声 法提高了原花青素的提取率和纯度。/ 关键词:超声提取;葡萄籽;原花青素;提取率 ,, ’. . ’ ,’..%. . %/ . %/ ’ : :. ?: ?? .%,.%,.%,,%.. : ;; ;超声波辅助提取葡萄籽中原花青索 文献综述 .天然产物研究现状 在地球的生物资源中,植物是最重要的。所有植物生物量约占地球总生物量的%, 而森林又占植物生物量的%以上。森林资源包括可再生的木质资源和非木质资源。 木质资源包括木浆、木质活性炭和能源产品,主要利用木材的三大组分,即纤维素、半 纤维素和木质素;非木质林业原料包括松香、松节油、植物单宁、芳香油、生物活性提 取物等,主要研究和利用植物的次生代谢物质,如生物碱、萜类、糖苷、黄酮、酚类、 醌类及脂质等类型的天然产物。 天然产物用于人类食品、医药和保健等已有悠久历史。世纪以来,随着化学工业 的发展,一些化学合成药品、色素和食品添加剂逐渐取代了由植物提取的天然产品。但 由于化学合成某些药物极其困难,加上近多年来发现若干合成药物毒副作用较大,以 及心理因素和经济因素的影响,人们的就医模式开始从治疗型向预防型转变【】,人类更 趋向于回归自然,天然药物重新受到重视。近年来天然产物化学有了迅猛的发展,国际 上掀起对天然药物研究的高潮。一些发达国家投入了大量的人员和经费,大力开展对天 然药物的研究。现在世界上有二百多家公司和数百家研究机构从事天然药物的研究与开 发。 目前上市药物中,约有/种类或更多来源于天然药物。西欧和美国植物来源药物 约占%,苏联和东欧国家占%,我国占%一%。据可靠统计,在至 年间生产上市的种新药中,%来源于天然产物或基于天然产物的合成、半合成品。 在国际市场,植物药及其制品的成交额约为亿美元。尤其在抗癌、抗感染药物的 开发研究中,天然药物有着重要的地位。至年间经美国批准的种抗 癌新药中,%来源于天然产物或以其为模型的合成、半合成品;种抗感染新药中, %以天然产物为基源。从天然产物中筛选和开发有效成分已成为当前人们研 究的热 点。 .葡萄籽与原花青素 近年来对流行病的调查发现,在西方发达国家,心脑血管病的发病率和死亡率都是 最高的。这可能与他们食用高脂肪食物和生活方式有关。在我国一些城市和地区,随着 生活水平的提高,心脑血管病的发病率和死亡率也呈明显升高的趋势。尽管法国人的每 日脯食中摄入了人量的饱和脂肪酸和胆同醇,但在一些地区,心脑血管病的发病率和死 亡率明显低丁法国其他地区和其他发达国家,而且发现他们饮食中的脂肪含苗也不低。 这被称为“法国反常”。研究发现法国这些地区居民经常喝葡萄酒。 为什么喝葡萄酒可以预防心脑血管病呢实验表明,葡萄酒中含有人餐多元酚类物质, 东北林业大学硕学位论文 其中主要是原花青素。 ..原花青素的结构 原花青素或,简称,义译原花色素、原花青素 苷、前花色素等是植物中广泛存在的一大类双黄酮衍生物的天然多酚化合物的总称。 起初统归于缩合鞣质或黄烷醇类。随着分离鉴定技术的提高和对此类物质的深入研究与 深刻认识,现己成为独树一帜的一大类物质。年,德国等从英国山楂 新鲜果实的乙醇提取物中首次分离出种多酚化合物:年,美国 等又从葡萄皮和籽提取物中分离出种多酚化合物,他们得到的多酚化合物在酸性介质 中加热均可产生花色素,故将这类多酚化合物命名为原花色素唧】。 原花青素是由多羟基黄烷..醇单元构成的低聚体和多聚体,由不同数量的儿茶素或 表儿茶素结合而成。最简单的原花青素是儿茶素或表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的 二聚体。依照原花青素聚合度组成单元的数目的不同,通常将二~六聚体称为低聚 原花青素或寡聚原花青素,简称,将六聚体以上的称为高 聚原花青素或多聚原花青素 ,简称。已经有许多纯态的低 聚原花青素分离出来,作为具有确定化学结构和物理常数的化合物而存在【】。低聚原花 青素与高聚原花青素之间并没有明显的界限。据报道,拥有强有力的抗氧化能力, 在体内其抗氧化、清除自由基能力是的倍、的倍。二聚体中,因两个单 体的构象或键合位置的不同,可有多种异构体,已分离鉴定的种结构形式分别命名为 ,其中,是由一键合,~由一键合。在各类原花青素 中,二聚体分布最广,研究最多,是最重要的一类原花青素。三聚体中,也因组 成的单 体及其相连接碳原子位置的不同形成各种各样的结构并命名为、等等,见图。 ;;; ;. ;;; ;一 ;;; ; ;;; 超声波辅助提取葡萄籽中原花青索 ;;; 型三聚体 ;;; ;;; ;;; 图儿茶素、二聚原花青素、三聚原花青素的结构 ..原花青素的性质 原花青素具有极强的抗氧化特性。早在年代法国科学家就发现可以从松树皮 中 提取大量原花青素,其提取物中可含%的原花青素。年代则发现葡萄属植物是 提取 原花青素的更好资源。原花青素在葡萄属植物种子中含量很高,是葡萄种子提取物 中最主要的多酚类物质“。叶强等”悃反相测定种葡萄果肉、果皮和果核中的 低分子酚类化合物,结果表明,葡萄果核中酚类化合物含量最高.~./,果 皮中次之.?./,果肉中含量最低.一/。 国外研究表明,原花青素有强抗氧化能力特别是在水相中,而且发现其抗氧化机 理是对亲水性的自由基有捕捉作用。自由基是体内新陈代谢的产物,在正常情况卜,它 的产生和清除是趋于平衡的,但在空气、水污染、食物添加剂、农药、重金属、辐射等 影响卜.,这种平衡易被破坏】,造成自由基的大量积累甚至生命人分子的氧化损伤等众 多不良反应,从而引发多种疾病。因此,当自由基代谢失调时,应补充外源性抗氧化荆 辅助调整或治疗。原花青素可以抑制低密度脂蛋白和红细胞膜的氧化”,促进肉皮细胞 松弛冈子的形成,防止血小板凝聚及动脉粥样化和血栓的形成,对心血管疾病疗效 显若。原花青素还具有预防高血压、抗动脉硬化、抗血栓、抗胃溃疡【”、 抗菌、抗炎【”、 抗肿瘤、抗突变的生物活性?】及皮肤保健及美容等功能,对糖尿病及视网膜病也有一定 疗效即。此外,它还具有较好的生物利用度,易丁与胶原蛋白结合,稳定细胞膜及抗酶 活性,这些能力与抗氧化能力协同使其成为一种颇具开发前景的保健品。 东北林业人学硕士学位论文 中国传统医学将葡萄作为补气药。《神农本草经》曾记载其果实有“益气倍力,强志, 令人肥健”的功效。葡萄的果、根、藤均可入药,果可解表透疹、利尿解毒,根、藤可 祛风湿、止血、消食、解毒、安胎,外用可治疗伤筋骨折。 在国外,葡萄籽提取物原花青素已得到广泛的应用和开发。美国、欧洲、阿根廷、 澳人利亚和新西兰等国均相继将葡萄籽原花色素开发成保健品或药品。例如,日本丁 年月日在厚生省第号公告《天然食品添加剂名单》中批准使用原花青素 并指定其名称为:葡萄籽提取物又称原花青素苷,编号第,而且已有商晶 和投放市场。国外已经有,,,, ,等葡萄籽提取药品专利’”。年我国将从葡萄籽中提取的 寡聚原花青素葡乐安作为保健食品进口,但价格昂贵。国内多酚类物质的研 究始于八十年代中后期,主要集中在茶儿茶素和银杏黄酮两方面,对葡萄中 活性成分的 研究报道较少”“。 ..葡萄籽资源利用的可行性 据联合国粮农组织提供的数据,全世界葡萄年产量约为万吨。原 花青素的原料是葡萄籽,来源丰富,是生产葡萄汁饮料和葡萄酒的废弃物,因此又是综 合利用的资源。葡萄属植物全世界有多种,我国约有种”。葡萄已成为我国第六 大水果品种,年栽培面积达.万亩,其中结果面积万亩,产量.万吨, 生产葡萄酒万吨/年;葡萄籽以干品计,为葡萄的%~%,即相当于每年可提取利 用?万吨的葡萄籽【“。 黑龙江省森林覆盖率较高,有万的山林面积,植被丰饶,野生浆果蕴藏量 很大。山葡萄在我省主要分布于东部的小兴安岭、完达山、张广才岭等山地,山葡萄 仅东南部山区的蕴藏量就有 之多【“,因此葡萄籽的开发利用具有稳固的资源保 障。 .声化学与超声提取 ..声化学简介 年代中期,由丁材料科学的发展及功率超声设各的普及,超声波在化学化工中的 应用研究迅速发展,形成了一门新兴的学科??声化学【 卢化学,主要是指利用超声波频率人于/的声波来加速和控制化学反廊, 提高化学反应产率或引发新的化学反应的一门交义边缘学科。从根本上讲,化学是能最 与物质的相互作用。与传统的光化学、热化学和电化学相比,卢化学反应中的声波与物 质分不直接发生相互作,冈为在液体中常的声波波长为一.对麻的声 超声作丁化学反廊,理论上一般 波频率为一 ,远人丁分子的尺寸?”。 可以接受的解释是超声波能在反应媒质中产生“空化”现象。”“。“。 声空化是液体中气泡在卢场作川卜发生的一系列动力学过程。将足够能苗的超卢波 超声波辅助提取葡萄籽中原花青素 通过介质通常为液体,当声波负压半周期的声乐幅值超过液体内部静压强时,存在于 液体中的微气核又称空化核或空穴就会迅速振动并膨胀,在相继而来的声波正相压中, 气核又被瞬时绝热压缩,直至破裂。崩溃瞬间在气核及其周围微小空间内出 现热点 ,形成高温高压区。等人用实验的方法测定了气相反应区的温度 达到了?,液相反应区的有效温度在左右,局部压力在×以上, 气泡液相层厚度在一之间“。同时这种局部高温高压存在的时间非常短。 仅有几微秒,所以温度变化率高达 /,并伴有强大的冲击波以及瞬间发光放电 过程。在液体中有悬浮固体颗粒的非均匀相中导入超声波,空 化气泡崩溃时向固体表面喷出速度高达/的微射流口”,导致分子间强烈的相互碰 撞和聚集,在液一固体系中起到了很好的冲击作用”,这就为促进或启动化学反应提供了 一个新的非常特殊的物理化学环境。 ..声化学与光化学的比较 、声化学换能器的电声效率可达~%,而一般电光源的电.光效率不超过 %。 、光催化体系的固相催化剂要求极高的分散性,其黑度的增加使吸光性增强,将大 量的光能生成废热,实际利用的光能很少,并且光线透入反应器溶液的深度很浅,影响 反应效率:而声波则不同,在小尺度的混响声场中,空化效应几乎可以发生于反应溶液 中的任何位置,不存在穿透深度问题。并且空化效应的化学产额亦较高,据理论与实验 测算,的溶液施以、/的超声波时,空化泡数量不少于×/。 、光化学反应体系的输入能量在~之间,而声化学反应体系的则在.~ 之间,能量利用高出十倍。 ..声化学的发展与现状 超声的化学和生物效应早在世纪年代就有报道。然而声化学作为一门边缘学 科迅速兴起则始于世纪年代。 由于声空化可在液体中造成局部高温高压的极端物理化学环境,加上声能具有独特 的优点,即无二次污染、设备简单、应用面广,超声化学已受到越来越多的关注和重视。 如今,声化学已成为一个蓬勃发展的研究领域。从年在英国的大学召开 第一界国际声化学学术会议以来,国际上有关卢化学的研究及学术交流异常活跃,研究 论文骤然增多“。为了适应与推动这一形势发展,年成立了欧洲卢化学学会 ,并丁年月创办发行国际性声化学杂志 。除了在学术方面非常活跃外,【业界也投以很人的热情,主 动提供资金支持研究。目前英、美、曰、俄、法等国都投以较人的人力财力,试图尽快 把实验室内取得的声化学研究成果:业化,这已成为当前】.作的热点。 国内的卢化学研究始丁.年代。和世界其他国家一样,我国的超卢化学研究在 年代以后才得到较快的发展。在超声化学的基础研究领域,目前的研究重点是超声场的 符种参数如超声场类型、声密度、频率和波形等等怎样影响空化的形成“。在国内外超 东北林业大学硕士学位论文 卢化学的应.【』领域,已涉及医学【】、有机合成,”?、催化与聚合反应【、 结晶与沉 淀【、乳化与破乳【】、干燥与雾化、有机物降解【诸多方面。超声场介入化学 反应的主要好处在于,它能降低反应条件如降低反应温度,减小反应压力等,加快 反应速度,提高反应效率并可避免某些副反应产生【。在超声提取研究领域也取得了 较快的发展。 ..超声提取与传统提取的比较 、浸渍法 将植物粗粉装入有盖的容器中,加入合适的溶剂一般为水或乙醇,在室温或加热 情况下浸泡一定时间一日至数日,使其中所含成分溶出,过滤,残渣再另加新溶剂, 重复提取两次。合并提取液,浓缩后得提取物。此法筒单易行,对含有多量淀粉、树胶、 黏液质、果胶等成分的植物材料很适宜。缺点是提取率不高,用水作溶剂时若浸渍时间 长,物料易发霉变质,必须加入防腐剂。 、渗漉法 渗漉法是将植物粉末装在渗漉器中,自上添加新溶剂,自下收集提取液。植物材料 粉碎要求适度,不宣太细或太粗。太粗会影响提取效率,太细则易结块而阻塞溶剂流通: 另外还要考虑植物粉末的润胀和填料压力等。与浸渍法相比,渗漉法可使植物材料与新 溶剂或有效成分含量低的溶液接触,具有一定的浓度差,提高了提取率,提取效果优于 浸渍法。该法的缺点是溶剂用量较大,操作过程较长。 、煎煮法 将植物材料放在砂罐或塘瓷器皿中,加入适量的水,加热煮沸,将有效成分提取出 来。这是我国最早使用且现在仍在使用的传统浸出方法。此法既简便,又能溶出植物材 料中的大部分成分。缺点是对含挥发性成分及有效成分遇热易破坏的植物材料不宜用此 法。 、回流提取法 用有机溶剂进行加热提取时,需要采用回流加热装置,以免溶剂挥发损失。此法较 冷浸法提取率高,但对受热易破坏的成分,不宜采用此法。 、连续同流法 为了弥补同流提取法中要进行反复过滤、需要溶剂量人的不足,可采用连续回流提 取法。连续同流的装置,实验室常用索氏提取器。由下溶剂可反复被气化、冷凝,使被 提取物与溶剂之间一直保持着相当大的浓度著,提取效率高,溶剂用鼙少。不足之处是 提取液受热时间较长,对受热易分解的成分不宜采埘此法。 、超声波提取法 超声波振荡是能的一种形式,它可以在气态、液态或削态介质中传播。将植物材料 和提取溶剂放入超卢波发生器中,在超卢波的作 ,原料细胞部分被破坏,有效成分 可很容易地扩散到提取液中,加之超卢波振荡也可使原料颗粒不停运动,井使浸提温度 升高,有利丁扩散,提高浸提效率。 利?超卢场强化浸取和萃取过程是超卢化学领域中极具潜力的发展方向。传统的提 超声波辅助提取葡萄籽中原花青索 取方法是针对某种目标成分选取正确的溶剂,同时采用加热或搅拌。较高的温度有利于 目标成分的浸出,但温度过高又会使有效成分受热分解或改变结构和性质。如果在提取 过程中引入超声波,就可以在较低的温度大大促进溶剂提浸、萃取天然成分的过 程。研究表明,超卢波作用可以改变反应物的质量传输机制,破坏细胞的细胞壁,使细 胞内含物更易释放。超声波形成的微流效应也是其提高提取过程效率的一个重要原因 】。 ..超声提取应用 目前,超声波已用于从陆地植物和海洋藻类植物中提取药用有效成分的研究。一些 研究成果如下: 等用超声方法提取人参皂甙比用传统方法快约倍【?。 孙波等阳】用超声波提取杜仲叶固溶物,超声作用的产品得率.%比常规煎 煮法提取的得率.%提高了近/,并有效地防止了提取物在长时间高温下的氧化 褐变。 赵茜等一对甘草酸提取的研究表明,在甘草酸提取过程中施加超声场得到的甘草酸 粗品含量和提取率均大大高于未施加超声场的提取过程,达到%的提取率,施加超声 场的新工艺所需浸渍时间.仅为传统工艺的/。 郭孝武等【 】用超声法从黄芩中提取黄芩甙,超声法提取的提出率.%比煎 煮法提取的提出率.%还高;从葵花籽中提取油脂,加入超声波可使产量提高 %.%,并且超声波能把水化油中的磷脂含量降到.%】。 张文超等?用超声波处理金针菇子实体原料,超声方法下的总糖和多糖提取率比对 照方法高.倍。 从茶叶中提取固形物,常规工艺为用喷雾干燥除去茶浸提液中的水分而得到粉状物。 和 ”立用超声波在下可将该过程的提取率提高近%,而且大 部分有效成分在超声波处理的前内提取出来。 岳泰球等研究了用超声波在花粉细胞破壁技术上的应用,此法与其他现有方法比较, 具有时间短,手续简单,破壁率基本可以满足生产:艺上要求的优点。 郭孝武等?惋用超声从大黄中提取葸醌类成分的研究表明:超声处理 ,总提 取率可达.%,而煎煮总提取率仅为.%;超卢提取,提取率可达 .%;用纸层析及对两种方法提取产物进行分析,表明超声处理对产物结构无 影响。州不同频率的超声波从槐米中提取芸香苷与热碱提取??酸沉淀比较,超声法无 需加热,只需用频率的超卢波处理,提取率就可提高.%。在超声波 用丁从黄连中提取小檗碱的常规浸泡艺中,超卢提取所得到的小檗碱提取率比 碱性浸泡高%以上。从刺五加中提取紫’香甙试样,用问流提取所得的含 培与超声波处理所得的含量一致【?。 此外,淑娟等对灵芝多糖的提取研究】、路德明等对胆藻体的超声提取研究 等都表明,与传统‘艺相比,超声波法提取操作简化,提取率高,在适当条仆可提高 对被提取物细胞肇的有效破碎并不造成被提取物结构性质变化或火玄活性,有人甚至建 东北林业大学硕士学位论文 议采用超声波法代替中国药典法测定中药材浸出物含量【”。 。超声波作用机理 超声波~般由振子产生,压电或磁致伸缩震荡器起着振子的作用。采用石英、钛酸 钡和锆酸铅或钛酸铅作为压电振子材料,镍和铁一钴合金用于磁致伸缩振子。根据频率 和材料,可将施加电能的%转变为超声能,超声强度高达/,频率范围 一,相应波长为.~.。由于在液体中横向波强烈衰减的缘故,只有纵向波 对诱导化学反应起作用。 超声波对介质产生振动和冲击,即机械作用。在液体中,特别是液固边界往往存在 一些小泡,它们可能是真空,也可能是含有少量气体或蒸汽的泡,大小不一。用一定频 率的声波作用于液体时,只有尺寸适宜的小泡能发生共振,这个尺寸称为共振尺寸。大 于共振尺寸的小泡在超声作用下被逐出液体。小于共振尺寸的小泡在超声作 用小逐渐长 大;接近共振尺寸时,声波的稀疏段使小泡迅速长大,然后在声波压缩段小泡又突然被 绝热压缩直至湮灭。在湮灭过程中,小泡内部可以达到上千度高温和上百个兆帕的压力。 同时,小泡涨大时引起充电,在湮灭时又放电发光。在小泡突然被压缩时,液体以极高 速度填充于空腔,使小泡附近的液体或固体经受到上百个兆帕的压力的高压和强烈的冲 击波。正是这种局部高温高压、高梯度流动场、放电发光等作用,使超声波在诱导化学 反应、改进化工单元操作、强化化工过程等方面发挥独特的作用。 有关超声波作用原理的理论自年以来一直在发展。 当小泡自然共振频率,等于所施加的声频,时才会引起共振,它遵循下述关系式: / :堕 。堡“ “ 。’ ?., 式中,为气体绝热指数:为静压力;为介质密度:为小泡共振半径。当 ,,时,会导致空腔湮灭。 年 最早对液体空化进行了理论研究。在超声波作用下,在不可 压缩液体中突然形成空泡。空泡的内径为功;静压力为:密度为。当半径减小 到 ,则。 时,距离为“处的压力为?哺“/,。若,/ 空腔完全崩溃闭合时间./内。在标准温度和常压下,.直径的空腔完全 。 消臾的时间约 等人推导以下方程: 一口争,? 、 超声波辅助提取葡萄籽中原花青素 式中,为空腔湮灭时最高温度;瓦为实验温度环境温度;为衰减因子, 等泡腔的共振尺寸与静态尺寸之比;泡腔峰压。若泡内为单原子气体” .,/.相应了二超声强度./,并设.,可得。 .声化学反应器 ..实验室用声化学反应器 趣愀 换能器 圈清洗槽式非直接提取装置 圈探头式直接提取装置 嚣 冷 提取物料 \换能器 / 换能嚣 图清洗槽式直接提取装置 圈大型工业超声反应器 幽,幽为常见的超声反鹿器。为了使锥形瓶反应液出现空化,幽.中锥形 瓶底部距不锈钢槽底部的距离以及反应液在锥形瓶中的高度都需要仔细调整”。由丁.反 应液反麻器之间声阻抗相筹很人,声波反射极为严重。如以玻璃做反廊瓶,反应液是 东北林业大学硕上学位论文 水,其反射率高达%?。 本实验采用探头式反应器。探头是一种变幅杆,即一类使振幅放大的器件,因而使 能量集中。变幅杆与换能器紧密相连,然后插入反应体系中。在探头端面能达到的声能 密度是很高的,通常可以大于/,根据需要还可以做得更大。功率一般连续可调。 探头式反应器的优点是: 、直接插入反应液,声能利用率人; 、通过变幅杆的集中,声能密度大大提高,可以实现许多在超声清洗器上难以实现 的反应。 ..工业用声化学反应器 一般工业用反应器见图。罗马尼亚的研究小组制造了第一个工业超声反应器并 申请了专利‘“。该反应器容量为,主要为本国市场提供草药的醇提产品。 图.为可能出现的大型工业超声反应器【。 .课题的提出及研究的主要内容 目前国内对原花青素的研究主要集中在抗氧化性等方面,用超声波在常温下提取原 花青素还未见报道。原花青素原料来源丰富,研究利用超声波技术辅助提取葡萄籽中原 花青素,可对传统的提取技术形成有益的补充,探索提高加工效率的办法,对于林特产 品的深加工和利用具有重要的经济和理论意义。 本文在常温下利用超声波细胞破碎机辅助提取葡萄籽中的原花青素,用可见和紫外 分光光度法对产品进行定量。对原花青素提取作了以下研究:原料粒度对超声提取效率 的影响;超声提取时间与原花青素提取率的关系;超声功率与原花青素提取率的关系; 超声提取料液比与原花青素提取率的关系,并对乙醇和丙酮两种溶剂对原花 青素的提取 效果作了初步比较。用红外光谱和高效液相色谱对粗提产品进行结构 测定,探讨超声波对产物结构有无影响。超声波辅助提取葡萄籽中原花青素 实验部分 .原料及预处理 试验原料为野生山葡萄籽,购于黑龙江省依兰县黑龙清泉实业公司。将年 月间采集的成熟山葡萄产地:依兰县境内去肉及皮质,使葡萄籽部分保持完 好无损, 洗挣,自然晾干后在避光条件下密闭存放。 水分按常压加热法测定,为.%。 寰? 粉碎后葡萄抒各粒度比倒 粒度 质量百分比% . 目以上 .目 . .目 . . 目以下 将葡萄籽粉碎过筛,各粒度组成见表。有.%的粉碎原料在加一目之间。 将除整籽以外的各粒度原料用石油醚浸泡以去除脂溶性成分,用砂芯漏斗过 滤 将滤后原料置低温避光处,待石油醚挥发干净后盛于试样瓶中,放冷暗处备用。 .试剂 、混合液 将浓盐酸与正‘醇按体积比:混合备。 偏重弧硫酸钠溶液 将.偏重亚硫酸钠溶水中,每滴溶液相当. 偏重亚硫酸钠。为避免被空气氧化,该溶液现埘现配。 东北林业人学硕.:学位论文 .试验装置图 图为超声波细胞破碎机示意图,工作频率范围?,频率自动跟踪。 换能器 图探头式超声波细胞破碎机示意图 .原花青素的测定原理与方法 原花青素禽螭的测定方法有许多种,结合中外文献”“”’““。,本文在研究超卢提取效 率时采用紫外和可见分光光度法来测定原花青素的含鼙。其中紫外法利原花青素在 波处有最人吸收峰的特性,可见法利原花青素的花色素反应图?。本实 验在用丙酮做溶剂提取原花青素时,利?原花青索的花色素反应,正醇一盐酸法”““ 测定原花青素的含鼙。朋乙醇做溶剂时,利用紫外法测定原花青素含嚣。 原花青定的?连接键很不稳定,易在酸的作心开。反应过程是:在质子 超声波辅助提取葡萄籽中原花青素 进攻下单元.生成正碳离子,?键裂开,下部单元形成..表儿茶素 ?,上部单元成为正碳离子。失去一个质子成为黄..烯..醇。在有 氧条件下?失去.上的氢负离子,被氧化成花青定。反应还生成相应的醚/ 甲基、已基、正丙基,视溶剂而异。若采用正丁酵溶剂可防止醚的形成。 / 尸~“ “?掣 ? ?,, 圈原花青素的酸解反应花色素反应 .原花青素定量方法 ..原花青素的提取 ..对照方法 将各种粒度的原料分别置丁棕色玻璃瓶中,添加丙酮或乙醇试剂,按不同的 料 液比在室温条件水平密封震荡每振次一定的时间,抽滤瓶过滤,丙酮或乙 醇试剂洗涤残渣,将滤液于容蜒瓶中定容,充分摇匀,取适量离心转/ 后待测。 ...超声方法 将各种粒度的原料置丁提取容器中,按不同的料液比添加丙酮或乙醇试剂, 将 超卢探头浸入料液液面以,室温超声一定的时间后抽滤瓶过滤,丙酮或乙醇 试剂 洗涤残渣,将滤液丁窬颦瓶中定容,充分摇匀,取适苗离心转/厉待 东北林业大学硕士学位论文 测。 ..原花青素标准工作曲线的绘制 ...原花青素丙酮标准曲线 , 称取经干燥的原花青素化学对照品. ,用%丙酮溶解,并准确定容至 制得浓度为“/的原花青素丙酮标准贮备溶液。 用丙酮稀释标准贮备溶液,配制成浓度为.、.、.、.、 、 ./的系列标准液。 分别移取上述不同系列标准液. 于 刻度试管中,加. 混合液 正丁醇:浓盐酸:,加滴偏重亚硫酸钠溶液,置于??水浴中。待试管内 外温度一致后立即塞紧塞子,加热后取出,立即用自来水快速冷却至室温,充 分摇匀, 用正丁醇定容至. ,在 处以空白调零扣除背景,测定吸光值,以最小二乘 法绘制原花青素吸光值一浓度标准曲线。 表原花青素丙酮标准工作曲线各浓度吸光度 以吸光度对浓度作图并进行回归分析,结果如图?。可以看到,在? / 范围内满足线性关系,,.。 趟 誉 隧 .. . 吸光度 图原花青素丙酮溶液标准曲线 ...原花青素乙醇标准曲线 准确称取经干燥的原花青素化学对照品. ,用%/.酵溶解,并准确定容至 ,制得浓度为?/的标准贮备溶液。 容鼙瓶 分别精确移取、、、、、、、、、标准贮备溶液至 处测定吸光度,同时做空白 中,堋%醇定容至刻度线,塞紧后充分摇匀,在 样品,结果见表?。。超声波辅助提取葡萄籽中擐花青素 表原花青素乙醇标准溶液浓度与吸光度关系顺序浓度/】. . . . . . .吸光度 . 以吸光度对浓度做图并进行回归分析,结果如图。从图中可以看出,浓度与吸 光度在?./范围内满足线性关系,,.。 : 、 划 避 髅 虹 耀 醋 . . . . 吸光度 圈原花青素乙醇溶液标准曲线 ..原花青素提取率的计算 ...丙酮为溶剂提取率的计算 取..中原花青素的丙酮提取液含原花青素?‖/. 于 刻度试管中,加. 混合液正丁醇:浓盐酸:,加两滴新雪己制的 溶液相当于.,即晟终显色体系中含./的,置丁.?水 浴中,待试管内外温度一致后立即塞紧塞子,加热后取出,立即用自来水快速 冷却至 处测定吸光值,同时做空白对照。 室温,充分摇匀,用正丁醇定容至. ,在 对照原花青素丙酮溶液标准曲线,计算原花青素的浓度及提取率。 . .乙醇为溶剂提取率的计算 取..中原花青索的乙醇提取液稀释一定的倍数,使其浓度在~‖/, 在 处测定其吸光度,对照标准曲线求出相应的原花青素浓度,计算原花青素 的浓度及 提取率。 . .计算公式 ×× 原花青素%一一??一一一× ××一 ?样品溶液稀释倍数 东北林业大学硕’二学位论文 ?查.作曲线样品溶液对应的原花青素浓度,// 一样品溶液的体积, 一样品质量, 一样品水分,% 。几点说明 超声采用短时间多次破碎方式,每次超声时间.,间隔时间.。若反应料液温 度超过设定的报警温度?,则超声停止。待温度降下来以后继续超声提取。 本论文选用乙醇溶液和丙酮溶液作为提取剂来考察影响提取效果的因素: .试剂的浓度; .样品粒度: .超声作用时间; .超声功率; .料液比。 盛装提取试液选用的圆柱型玻璃瓶高,底面直径,圆柱型塑料 瓶高,底面直径,锥形玻璃瓶。 超声波辅助挺取葡萄籽中原花青素 结果与分析 。原花青素的稳定性 ..光稳定性 配制种浓度的原花青素水溶液,编号为、、、。放置在室内自然光照条件下 盛于密封无色玻璃试管中,分别于天、天和天后在 处测其吸光度以 蒸馏水作参比,发现原花青素水溶液的的吸光值随着光照时间的增长而逐渐 升高。见表 及圈。 表原花青素标准溶液自然放置吸光度的变化??号溶液 ?仁卜一号溶液 《 ??号溶液 一×一号溶液 篓九 昏 时间天 圈原花青素水标准溶液自然放置吸光度的变化 幽一表明原花青索水溶液吸光度随放置时间的增加而升高。原花青素在光照 条什 可能生成了醌类化合物,冈此在提取操作过程中采取了避光措施。 ..热稳定性 波长洲吸光 配制一定量的原花青素对照品水溶液,以蒸馏水作参比,在 度,为.。然后分别取该溶液置丁试管外肇包有铝箔以避光中,塞 紧塞子,分别在雨 。水浴中加热、、和,取出后迅速冷 却至室温,在测其吸光度,结果见表及幽。 东北林业大学倾一学位论文 表加热时间对原花青素水溶液吸光度的影响 ?夺一度? 卜度 世鬟督 】 时间 圈原花青素的热稳定性实验 可以看出两条曲线有相同的变化趋势,前吸光度有一个短暂的升高,后 有所下降,接着持续基本保持不变。随着加热时间的延长,水浴的样品吸光 度由.以下升高到.以上,这是否与溶液和空气中存在的微量氧有关还需进一步验 证。由于原花青素溶液在较高的温度下会被空气氧化变性,因此原花青素的提取应在低 温条件下进行。这与等【”的观点一致。为了避免提取过程中原花青素因温度过高 而被氧化,本实验实际操作过程在室温下进行。将超声波细胞破碎机温度控制探头浸入 提取物料下,设定报警温度为?。 .提取剂的选择 等【柏】等通过实验得出,从植物组织中提取原花青素,用丙酮溶液作提取剂效 率较高。因此,本实验采用丙酮溶液作提取剂之一。 原花青素为多羟基酚类化合物,由于水和多酚类物质都具有较强的极性,因此用水 作溶剂提出物的产率较高,而且水提的最人优点是廉价无毒。但是水的粗提物中含有较 多的其他的水溶性杂质,须进一步进行纯化处理。由丁纯化步骤繁多耗时,待得到最终 纯度较高的原花青素产品时,已造成了原花青素总繁的损失。本文选用极性较强、容易 同收的乙醇溶液作提取剂之二。 .关于检测方法 测定原花青素的方法有许多,每种都有其适州对象和优缺点。最常的光度法是香 草醛法和正醇/法”,它们被广泛虑到葡萄籽原花青素含最的检测中。本文在用 /的原花青索对照晶 丙酮做提取剂时采正‘醇/法进行检测。图是浓度为 超声波辅助提取葡萄籽中原花青素 丙酮溶液在可%.波段的吸收曲线,图是经超声提取的原花青素的丙酮溶液在 可见波 处均有?较强吸收,说明发生了花色素反应。 段的吸收曲线。两条曲线在 九 ? 川 呻 叫 扎】矿口南可一一一.一。一加 图原花青素对照品的可见暇收曲线 一 , ? 刊“ 图样品中提取出的原花膏素舸咂艘收曲线 原花青素类在 处有一特征吸收峰。利用这一性质,可以朋用紫外分光光鹰计 在原花青素这一特征吸收波长测定其含母。 东北林业大学硕一学位论文 图,图,图?和图分别为儿茶素、表儿茶素、原花青素对照品及 葡萄籽样品粗提液的紫外吸收光谱%醇溶液。 圈表儿茶素的紫外吸收光谱 圈?原花青素对照品的紫外吸收光谱 图葡萄籽样品提取液的的紫外吸收光谱 对测定方法的改进 傅武胜【 等用铁盐催化比色法测定葡萄籽提取物中的原花青素,原花青素浓度在 .?./范围内与吸光值呈线性相关.。 和认为,花色素反应中,向正‘醇/试剂中增加少量的“确实 有助丁显色,但较高浓度的“反而抑制显色。在原花青素的提取过程中,常用醚类和 乙酸乙酯分别去除色素类物质和非原花青素酚类物质,但这样虾常耗时,并且造成 的损火,原花青素的定最结果较低。为了避免这些原花青素的损火,应该在原花青素的 丙酮提取液中直接测定其含鬣。具体办法是不添加“,而在%丙酮溶液中添加 ./偏重弧硫酸钠作抗氧化剂,依此做山的原花青素标准曲线的线性范嗣在 ?‖/,平均同收率为%”】。 本实验参考了以上测定方法并作了一些改进,按..所述操作得到了较好的线性关 系。 超声波辅助提取葡萄籽中原花青素 .丙酮提取 ..丙酮浓度的确定 准确称取整粒葡萄籽份,每份,分别以不同浓度的丙酮溶液为提取剂 室温浸提,结果见图。可知,丙酮的浓度为%时提取效果最好。 . 艺 . 甜 备 掣 . 浓度% 圈丙酮浓度对提取效果的影响 ..室温震荡法 表丙酮震荡粒度、料液比与提取率的关系 .目 ?目 目 粒度 整籽 目 :? ::? :? :? : : :?: 料液比 提取率 勉 鹋 暂 围疆 翌 瞳 触 ? % ?一整籽 ?卜目以 冰 、, ?古一?目 斛 ?一?日 甾 ?《一目以下 裂 : : : 车液比 圈.丙酮震荡不同料液比粒度与提取宰的关系 由图.可看出,随着料液比的减小,提取率有所增加,说明浓度梯度增加有利 丁 扩散的进行。但提取率增加得比较平缓,说明原花青素紧密地结合住葡萄籽 外壳组织中, 东北林业大学硕:学位论文 单纯加人溶剂比例对原花青素的没出作用不明显。随着粒度的减小,提取率 增加,说明 粒度在目以上的原料原花青索提取率较低,在 较细的颗粒有利于原花青素的浸出。 .~.%,其中目和.目原料在提取率上差别甚微,. 原料提取率约是整籽 提取率的倍。各粒度原料在相同时间下提取率的差别与两个因素有关: 葡萄籽外壳部分的粒度。粒度越小,原料的比表面越人,与溶剂的接触面积越 人, 原花青素越易浸出。 各粒度碎籽的组成。富含原花青素的葡萄籽外壳部分在目以的物料中所,占 比 重最人。 表 原花青素提取率随浸提时间的变化 一誉一姗苷音丰 时间 图. .目规格料样震荡时闻与提取率的关系 液料比 主 : 讲 液料比 . : 液料比 : 九七吼??眦 时间小时 图. 以下料样震荡时甸与产率的关系 超声波辅助提取葡萄籽中原花青素 由图和图.知,料液比为:时,.目规格的葡萄籽震荡提取率 为 %,后增长缓慢;目以规格的葡萄籽震荡提取率为.%,后基本 不再变化。 ..震荡法总提取率 表整籽丙酮震荡提取次数与提取率的关系震荡提取次数 . 提取率%. . . . 提出百分比% 注:料液比:,间歇震荡,每更换一次提取剂,三次提取率之和为%; 提取率为原花青素占物料的质量百分比干基计,提出百分比为提取出的原花 青素占 被提物料中原花青素总量的质量百分比干基计。 由表.,整籽丙酮室温震荡法第一次提出百分比是.%,第二次是,%,两次 可以提出.%的原花青素。试样中原花青素含量为.%.%.%.%。 ..丙酮超声提取 ..整籽超声提取 表浸泡与不浸泡提取宰的比较 超声时间????雨蟊丽匿手?』塑塑匦墨?穗爵磊焉匪焉?一 注:料液比为:,超声功率为。 由表可以看出,不经过浸泡的整籽直接【丙酮超声提取,在短时间内效果不显 蒋。浸泡过的整籽用超声处理 ,提取率有增加,其中浸泡后施加超声 提取率可达.%,为整籽震荡提取率.%的.%。超声使籽的外壳 组织部分疏松,提高了溶剂的浸入和溶质的扩散速度。 ...碎籽超卢提取 表. .目规格原料超声时间.提取率关系 时间 熊塾羔迎 料液比: 料液比: 料液比: 沣: 小瓶东北林业人学顿卜学位论立? 料液比: 霪七 料液比: 辎. 料液比】: 时间 圈 目超声时间.提取率关系 由表,图可以看出,超声波对粒度较小的原料颗粒有很好的破碎作用。对 了二?日,料液比为:的原料,用超声 产率可达.%,比相同条 件下机械震荡的提取率.%还高。随着料液比的增加,提取率逐渐增加, 后提取率增加趋缓。料液比为:的原料提取率与料液比为:的产提取率无显著 差别,可能的解释是::料液中原料颗粒的空间密度比:料液颗粒的空间密度小, 单个颗粒单位时间内受到的超声冲击波的能量作用也相对不及:料液。超声波细胞 破碎机变幅杆声辐射端面的前部是最有效的产生空化的空间,只有原料进入这个空间并 保留一定的时间,才可能破坏其细胞组织,使其释放内含物。:物料中超声的破碎 促溶作用超过了原料颗粒与溶剂之间的扩散、传质作用。 表 日以下规格原料超声时阃提取率关系 超声时间 堡塾奎塑 料液比: 料液比: 孔 注 慌。。甜一讲吕蜘。。时问 图. 仔以下超声时问.提取率关系 产 表和幽?表明,目以,料液比为:的原料超卢作 超声波辅助提取葡萄籽中原花青素 率为.%。料液比为:的原料超声作用产率为.%,比相同条件 机械震荡的产率.%高山%。 ..小结 、丙酮为溶剂的整籽超声提取,超声作用不显著。但超声波对目以’卜粒度 物料 的破碎促溶作州比对整籽明显。 、原料浸泡后再超声处理,提取率有所增加,说明提取剂从物料表面开始浸入 物 料内部,润胀后的物料较易溶出溶质成分。 、对于原花青素的丙酮提取法料液比:,样品粒度、目,常温震荡 提取率为.%,超声 提取率为 %,超声法比震荡法提取率高%。 、料液比为:,样品粒度目以下时,常温震荡提取率为.%,用 超声 提取率为.%,超声法比震荡法高%。 .乙醇提取 ..乙醇浓度的选择 准确称取整粒葡萄籽份,每份,分别以不同浓度的乙醇溶液为提取剂 室温浸提,结果见图?。可知,乙醇的浓度为%时提取效果最好。 . . 啪. 吕 掣.乙隙浓度% 图?乙醇浓度对提取效果的影响 ..整籽振荡法 衰乙醇整籽振荡时间与提取率的关系东北林业人学顶一学位论文?卜料液 比: 】 ?卜料液比: 芭 十料液比: 糌. 量叫时间 图.整籽乙醇震荡时间.提取率曲线 由图?可知,料液比对提取率影响较大,但:的料液和:的料液后 提取率无显著差别。震荡后提取率基本不再升高。用%醇提取整籽中的原花 青 素,提取率为.%。 ..整籽超声 表料液比为:时功率与提取率的关系 . . . . 浸 提取翠 .坚 . .墼 .堑 .坠 . . .. 浸 % ?』 .塑 . 注:超声时间,锥形瓶秽? 塾 掣. 功率四 圈.料液比为:时功率对产率的影响 幽.表明,整籽的乙醇浸泡时原花青素的提取率无明显影响。在超过 厉,产率增加很快,说明时发生强烈的空化,其强度使籽的外壳受到较火程度 的 破坏。由超声功率比较人,反应器中料液温度升高较快,冈此设定超声时间 为。塑垫塑些丝垒塑堑坚丝要查??望 注::锥形瓶;利液比:。 . ; 。 辨 备 掣 时间 图. 超声时间.提取率曲线 由图?,整籽原料用乙醇做溶剂超卢后提取率基本不再变化,说明增长超 声时间对提高接籽原花青素的产率作用不显著。提高功率后结果见表.及. 图.。 表整籽超声提取结果 鲎 竺竺兰 竺竺兰 竺竺 竺翌釜竺 鳖 : . ?: 品 :船 篓; :器 : ..?巧 加加 押曲馋” 加培协? 伸勰加 注: %增至.% 表.和图.表明,功率由增至提取率分别由 :料液比,由.%增至.%:料液比,平均提取率约增高了倍。???一 ? 荽? 量.: : : : 丰淑比 图.料液比与提取率曲线东北林业人学颊学位论文 ..碎籽超声 各粒度的原料提取的结果见表.及图.。 表.不同粒度的原料功率与提取率的关系 沣:小瓶;料液比::超声。 ??目 ?口一 日?击一?目 母一褂甾掣 功率 圈.功率与提取率的关系 由上图可以看出,随着功率的增加提取率稳步上升,目以上原料与,目原料 提取率无明显差别。对丁.目原料,超卢提取率可达.%。 目以下乙醇超声过程所用容器为相同形状体积的玻璃瓶和聚乙烯瓶。结果发 现聚 乙烯材料反应容器的提取率比用玻璃容器高%~%。 表.容器材质对提取率的影响 提取率 超声时间 稀释倍数 吸光度 革取器利质 料液比 功率 % : 玻璃 : 塑料 】: 玻璃 : 掣芈 .: 玻璃 . . 哪: :超声波辅助提取葡萄籽中原花青素 .产品纯度分析 ..样品溶液制备 用紫外法测定葡萄籽粗提物中原花青素的含量。将号丙酮超声法、号丙 酮震荡法、号乙醇超声法和号乙醇震荡法葡萄籽粗提物干粉提取浓缩 ,加入容量瓶中,加水 液?真空干燥研细。精密称取研细后的样品~ 适量,稍加温溶解,然后冷却至。,加水定容,同时做原花青素对照品,结果 见表?,可以看到种产品颜色略有不同。 表一样品溶液的制备 精密称取儿茶素对照品. 加水定容于容量瓶中,精密称取表儿茶素对照 品.加水定容于容量瓶中,连同种粗提物稀释到/,在测其 吸光度,结果如下。 表? 测定产品纯度 稃丽丐 旦:??且鏊壅 耋些查鲞 】. . . . 称样量定容 取出量 定容 . . . . . 浓度“/. . . . . .. 吸光度 . .. . . 以儿茶素计% 箜: : :: :箜 筮:丝 型翌墨壁垄童鲞盐型 :一 ..计算与分析 以儿茶索计: 奄甘一壁墨曼丛苤塞选鏖型型:壁曼哩堂壁坠 “一对照品儿茶素吸光度×样品浓度‖ 以天泮计: 鸯一踺堕曼 鉴壁型里兰壁璺塑堂堕坠 甬一 对照品吸光度×样品浓度‖ %乙醇溶液。产的 从表可以石山,%丙酮溶液对原花青素的选择性高 东北林业人学硕:学位论文 纯度依次为丙酮超卢法丙酮震荡法乙醇超声法乙醇震荡法。对丁丙酮提取, 超卢法 产品纯度为.%,震荡法产品纯度为.%对了二乙醇提取,超声法产品纯度为 .%,震荡法产品纯度为.%以对照原花青素计。 .讨论 、关于提取温度 本试验用的是探头式细胞破碎器,超声换能器的探头直接插入到料液中,能 量的利 【效率大大高于槽式反应器。在超声一段时间后,提取料液的温度升高。功 率越大,溶 液温度上升越快。采用了冷却措施,在反应容器外壁绕冷水橡胶管,但冷却效果不好。 由于设定报警温度为?,在功率较大时超声时间不可能任意延长,因此,在原料粒度 较大时,短时间内没有将物料中的原花青素完全提取出来。用探头式超声提取装置时, 怎样控制提取容器中物料的温度值得研究。 、关于原料粒度 在葡萄籽的粉碎样品中,一目原料占总原料质量百分比为.%,估计也是规模 生产时粉碎后大部分原料的粒度。但是,超声对较大粒度的原料的破碎作用相对较小。: 、关于超声空化 反应液体的性质如密度、黏度等影响发生空化的难易程度。用石油醚浸提时, 控制档在较低的位置就可发生整个容器内液体的湍动搅拌,而用%丙酾和%乙醇提 取时,控制档要调至较高刻度才发生整个容器内液体的湍动搅拌。 、探头的位置 超声探头插入液面的深度和探头与容器底部的距离直接影响溶液湍动效果。经反复 试验,使用容器时变幅杆插入液面下,距容器底部可以使溶液得到晟充分 的搅拌和湍动。 、反应器的形状与人小 反应器的形状被认为是影响超声空化效率的冈素。由于超卢波在液体中的空化极其 复杂,本文使用的反应器为圆柱状瓶和锥形瓶。 、干燥物料的溶剂提取过程 用一般超卢提取装置如清洗槽或探头系统对植物细胞进行超卢破碎所导致的提取 增益并不只能超卢的机械作用来解释.,尤其是提取干燥物料。这是冈为干燥物料 的溶剂提取包括两个阶段: 第一阶段,物料与溶剂间的浸润,润胀和饱和过程: 第二阶段,可溶性成分通过扩故和渗透从物料到溶剂的传质过程。 『周此,原料适当浸泡一段时间后再对其进行超声处理可以提商提取效率。超声可以 促进物料的润胀干?饱和,扩人植物细胞鼙纹孔.有利丁被提成分的扩散从而加强质鬣传 输。一般同体的浸提过程包括如卜个步骤:溶剂浸润进入州体内,溶质溶解; 溶解的溶质从司体内部流体中扩散达到问体表面;溶质继续从胡体表面通过液膜扩 超声波辅助提取葡萄籽中原花青素 。黾。。; 。。。。。。。。。。。。。 。 。。: 。。。。。。鞭%。暑 . 图.一个空化泡的接界层示意图 在通常的浸取条件下,,两步骤不是传质的控制因素,可以忽略不计,浸取 速率主耍决定于