16-分子生物学作业1-第十六章 反转录病毒及反转座子

16-分子生物学作业1-第十六章 反转录病毒及反转座子 生91班 钱猛(992229) 由RNA介导的转座过程只发生在真核生物中。这种能力是由将RNA基因组的DNA拷贝(前病毒)插入到宿主细胞的反转录病毒所提供的。一些真核细胞的转座子在基本结构上与 反转录病毒的前病毒有关，而且它们通过RNA中间物的介导转座。这一类元件称作 有时称为反转录转座子。它们包括能自由侵染宿主细胞的反转录病毒和通过RNA介导的转座序列，但这些序列本身并不能转座。它们和其他类型转座子同样具有转座子的重要特 征：在目标DNA的插入位点产生的短的直接重复序列。 即使在没有探测到活跃转座子的基因组中，也发现了原始转座的印迹，其形式是在分散 的重复片段两侧的正向重复序列，这些序列的特征有时暗示RNA序列是DNA序列的祖先。我们认为，RNA一定曾被转化成DNA的拷贝，又通过类似转座的过程插入到基因组中。 与其他繁殖周期类似，反转录病毒或反转录子的周期是连续的;在某点打断周期的连续性而考虑其为“起始点”是不合适的。但是我们通常观察到的这些元件的形式导致我们对其看 法有所偏颇，如16.1所示。反转录病毒最初被认为是能在细胞间转移且有感染性的病毒 颗粒，因此细胞内循环(涉及双链DNA)曾被认为是繁殖RNA病毒的方式。反转录子是作为 基因组的成分被发现的；并且其RNA形式主要具有mRNA的功能。所以我们认为反转录子 是基因组(双链DNA)内可转座的序列；它们并不在细胞间迁移。 19.1 概述：反转录病毒和反转 (其中涉座子的繁殖周期 DNA反转录成及到从 RNA和从RNA转录成 DNA的过程).只有反转 录病毒可以组装成感染 颗粒。反转录子则被限制 在细胞内周期 反转录病毒的基因组是单链的RNA，它们可通过双链DNA作为中间物而复制得到。病毒的生活周期包括一个必须的周期。在这个周期中，双链DNA通过类似转座的过程插入到宿主基因组中，并产生目标DNA的短的正向重复序列。 此过程的重大意义超出了病毒的延续性，其若干重要影响如下： ?整合到细胞中的反转录病毒序列留在细胞基因组中，成为内生病毒。与溶源噬菌体类 似，它现为生物遗传物质的一部分。 ?细胞内序列偶尔会与反转录序列重组，然后与它一起转座；这些序列可能以双链形式 在新的位点插入基因组。 ?被反转录病毒转座的胞内序列可能会改变被病毒感染的细胞的性质。 16.2表明了反转录病毒生活 16.2 周期的细节。关键步骤是：病毒RNA反转录病毒的生活周期中涉及将RNA基因 反转录成DNA，DNA被整合入宿主DNADNARNA，此为了转录成，必组反转录成双链基因组，然后DNA前病毒又转录成 须插入寄主的基因组。RNA。 负责将RNA转录成DNA拷贝的 酶是反转录酶。在受病毒感染的细胞 质中，该酶把RNA反转录成为线性双 链DNA。(DNA也被转化成环状形式， 但环状分子似乎与增殖过程无关)。 线形DNA可以进入核中。一个或 多个DNA拷贝被整合到宿主基因组 中，一种称作整合酶的蛋白负责整合 过程。整合进入寄主基因组的前病毒 DNA由宿主的转录酶系统转录成病 毒的RNA，此RNA有两个用途：作 为模板的mRNA和包装病毒 RNA的基因组。整合过程是其生活周 期中正常的步骤，也是转录所必须的。 两个RNA基因组的拷贝被包装 进每个病毒体，使独每个病毒颗粒成 为有效的二倍体。当一个细胞被两个 不同但相关的病毒感染后，可能产生 杂合的的病毒颗粒。它携带每类病毒 的一个基因组。这种二倍性可能对于 病毒获得细胞内序列是重要的。反转 录酶和整合酶与基因组一起由病毒颗 粒携带。 典型的反转录病毒序列包含三四 个“基因”，实际上指的是通过加工，实际上产生了多个蛋白质的几个编码区域。典型的含 三个基因的一种典型的反转录病毒基因组含gag-pol-env序列，参见16.3。 反转录病毒mRNA具有常规的结构。在5′端有帽结构，3′端被聚腺苷酰化。这表现在两个mRNA上。全长mRNA被翻译以生成Gag和Pol聚合蛋白。从起始密码子到第一个 终止密码子的阅读框翻译成Gag。要表达Pol产物，必须绕过此终止密码子。 反转录病毒的”基因”被表达成多蛋白,随后被切割成单独的产物. 16.3 16.4 HIV 逆转录病毒从被感染的细胞的质膜出芽. 不同的病毒采用不同的机制来越过gag终止密码子，这取决于gag和pol两个阅读框架之间的关系。如果gag和pol连续的位于同一阅读框架中，通过可识别终止密码子的谷氨酰 基tRNA，可产生单一蛋白质。如果gag和pol位于不同的阅读框架中，通过核糖体的移码 以便产生单一蛋白质。通常通读的有效率只有大约5%，所以Gag蛋白比Gag-Pol蛋白多大 约20倍。 Env蛋白通过另一种方式表达：由剪切产生一较短的亚基因组信使，它被翻译成Env产物。 gag基因编码病毒的核蛋白核心的蛋白质。pol基因编码的功能涉及到核酸合成和重组。 env基因编码的是颗粒外壳的组份，它隔离了来自细胞膜的组份。 Gag或Gag-Pol和Env产物都是聚合蛋白，它们能被蛋白酶切成存在于成熟病毒体中的 单个蛋白。蛋白酶的活性由病毒的不同形式编码：它可能是gag或pol的一部分，或是以一个独立的附加读码框架的形式存在。 反转录病毒颗粒的生产涉及到把RNA包装到核心蛋白里，外面包以衣壳蛋白，并从宿 主细胞的质膜上释放。16.4表示释放感染性颗粒的过程。感染过程与此过程相反；病毒 通过与质膜融合从而感染新的宿主细胞，然后释放病毒体的内含物。 反转录病毒被称为正链病毒，因为病毒RNA自身编码蛋白质产物。反转录酶负责把基 因组(正链RNA)转录成互补的DNA链，这条链称为负链DNA。反转录酶也催化双链DNA的后续阶段，它具有DNA聚合酶活性，能从RNA的单链反转录来合成双螺旋DNA，双螺旋DNA中的第二条链叫正链DNA。该酶有RNA酶H的活性，可以降解RNA-DNA混合链中的RNA部分。所有反转录病毒的反转录酶都有相当大的氨基酸序列的同源性，有些其他 的反转录子有类似的同源序列。 在中，比较了病毒的DNA形式和RNA的结构。病毒RNA在两端具有正向重复序 列。在不同的病毒株中这些R片段的序列差别很大，长10-80核苷酸不等。在病毒的5′端，继R片段之后是80-100个核苷酸的U5区域，其命名表示它位于5′端。在3′端，在R片段的内侧是170-1350个核苷酸的U3片段，它只存在于3′端。R片段用在从RNA转换成DNA以便在线形DNA中产生了大量的正向重复(见图16.6-16.7)。整合机制的结果使整合的形式 的两端各减少了2个碱基对。 (见图19.8) 16.5 反转录病毒的RNA 末端是正向重复序 ,自由线性DNA列 末端是LTRs,而前 病毒的末端的 LTRs各少了2个碱 . 基 与其他DNA聚合酶类似，反转录酶需要引物。天然的引物是tRNA。不带电荷的宿主tRNA存在于病毒体中。tRNA的3′端的18个碱基的序列与病毒RNA分子的5′端起100-200个 碱基处的位点配对。tRNA也可能与另一个病毒RNA的靠近5′端的部位碱基配对，因而协助 在病毒RNA之间形成二聚体。 这里有一个看似矛盾的地方：转录酶在5′端下游100-200个碱基处才开始合成DNA。那么DNA如何生成完整的RNA基因组?(这是复制任何线形核酸的末端的普遍问题中的一个极 端类型。参见12章)。 负链是在反转录时转换模板产生的. 16.6 DNA 在体外合成到末端，会产生一段短的DNA序列，叫做负强停止DNA。在体内合成是连续的，所以没有发现此分子，其反应已在16.6中说明。反转录酶改变模板，携带着新生 的DNA到新的模板上。这是在模板间两次跳跃的第一次。 在此反应中，RNA模板的5′端的R区域被反转录酶的RNA酶H活性所降解。它的去除使3′端的R区可与新合成的DNA碱基配对，然后反转录过程通过U3区域进入RNA 的编码区。 与强停止负链DNA配对的R区域的来源可能是同一RNA分子的3′端(分子内配对)或是另一个RNA分子的3′端(分子间配对)。。因为有证据表明tRNA引物序列在反转录子生活周期中并不遗传。(如果出现分子内配对，我们将预料该序列是可以遗传的，因为它将 在下一周期中提供引物结合序列的唯一来源。分子间配对允许另一个反转录病毒RNA来提供此序列。) 模板转换和延伸的结果是将U3序列加到5′端。U3-R-U5序列被称为长的末端重复序 列(LTR)。因为一系列相似的事件把U5片段加到3′端上，形成了相同的U5-R-U3结构。 我们需要生成一条DNA正链，并在一端生成LTR。此反应如图16.7所示。反转录酶以降解后余下的DNA为引物合成正链。当该酶到达模板末端时，生成一个强停止正链DNA。这个DNA然后被转移到负链 DNA的另一端。当DNA合成又一次从较远的上游的引物片 段(图中左侧)开始时，DNA很可能通过置换反应被释放。它利用R区域来与负链DNA的3′端配对，此双链DNA需要完成两条链以便在每一末端产生双链的LTR。 由于每个反转录病毒颗粒都有两个RNA基因组，可能在病毒生活周期中发生重组。可 能涉及到两个步骤，一个在负链合成期间，另一个在正链合成期间： ?图16.6所示的分子间配对允许在两个连续的RNA模板序列之间发生重组。 ?正链DNA的合成可能是不连续的，该反应涉及几个内部初始阶段。此反应中也可能 出现链转移。 两个步骤的共同特征是在DNA合成时，重组是由模板的转化产生的。这是被称为拷贝 选择的重组机制的一个普遍例子，许多年来它被认为是普通重组的可能机制。它不大可能由 细胞内系统所利用，但它在RNA病毒感染时，却是重组的共同基础，包括专门通过RNA形式复制的病毒，例如脊髓灰质炎病毒。 整合前病毒的结构很像线性DNA的结构，前病毒的两端的LTR都是相同的。U5的3′端与U3的5′端都包括一段短的反向重复序列，所以LTR的两个末端都有反向重复序列。 整合的前病毒DNA结构类似转座子：前病毒序列在反向重复处终止，侧面是靶DNA的重复序列。 前病毒是通过将线形DNA直接插入到靶位点中产生的。(除了线性DNA外，病毒序列还有环状的形式。一种环状DNA有两段相邻的长末端重复序列〔LTR〕，这两个序列是通过连接线性末端而产生的。另一种环状DNA只有一段LTR序列〔可能通过一次重组形成而本 身由大量环状物组成〕。虽然长期以来，中间体被认为是一个环〔通过λDNA的整合的模型推测的〕，但现在我们知道线状形式是用于整合的。) 线状DNA的整合被一种单一的病毒产物催化，这种病毒产物叫做整合酶，整合酶对反 转录线性DNA和目标DNA都起催化作用；此反应如16.8所示。 病毒DNA的末端很重要；在有转座子的情况下，末端的突变可以阻止整合。其最保守 的特征是在每个反向重复序列的末端有二核苷酸序列CA，整合酶使线性DNA的末端连在一起，产生核糖核蛋白复合体。同时还通过切除保守序列CA附近的碱基，将平末端变成有 缺口的末端；这个过程通常会导致两个碱基的丢失。 在相关序列上，靶位点的选择是随机的。整合酶在位点上交错切割，如16.8所示，切点相隔4个bp。目标复制子的长度取决于病毒，它可以是4、5，或6bp；估计这是由整合酶与目标DNA的的反应决定的。 靶DNA经剪切后产生的5′末端与病毒空缺的3′端共价连接。在这个位点上，病毒 DNA的两个末端由一条单链与DNA相连，单链区域通过宿主细胞的酶来修复；修复过程 中，在每个病毒DNA的5′末端处，两个突出碱基被切除。结果使整合病毒DNA两段的LTR各丢失了2bp；即在5′端的U3区左末端丢失2个bp和在3′终端的U5区右末端丢 失2个bp。在整合反转录病毒基因组的每个末端，都产生了靶DNA的短重复序列。 在随机选择的位点上，病毒DNA被整合到宿主基因组中；一个连续受感染的细胞可获 得了1～10个拷贝的前病毒(当然，一个传染病毒会进入胞质，但是它的DNA形式在细胞核才能被整合到基因组中。反转录病毒只能在增殖的细胞中复制；这是因为它进入核中需要细 胞经过有丝分裂，这时病毒基因组才有机会获得核物质)。 合成DNA正链需要第二次跳跃. 16.7 每个LTR的U3区都有一个启动子；位于LTR左侧的启动子负责起始前病毒的转录。 回想U3序列位于LTR左侧对于前病毒DNA的形成很必要，我们便知道启动子实际上是通 过RNA转变为双螺旋DNA而产生的。 有时(可能极少时候)在LTR右侧的启动子发起整合位点附近的宿主序列进行转录。LTR也携带着一个增强子(激活邻近启动子的一段序列)，它不仅作用于胞内序列，而且作用于病 毒序列。当某些基因以这种方式被激活时(见第28章)，反转录病毒的整合会引起某些宿主 的细胞发生癌变。 16.8 整合酶是整合反应中仅需的病毒蛋白,在此反应中,每个LTR序列都失去2bp, 并被插入4bp靶DNA的重复序列中. 整合的前病毒可以从基因组中切除吗?同源重组可以发生在前病毒的LTR之间。单独的LTR可能作为切离的遗留，存在于某些细胞的基因组中。 到目前为止，我们已根据感染周期处理了反转录病毒；在此周期中，整合对于进一步 产生RNA拷贝是很必要的。然而当一个病毒DNA整合到一个生殖细胞内时，它就变成一 个生物可遗传的内源前病毒。内源前病毒通常不表达，但有时能被外部因素所激活，如另一 些病毒的传染。 传导病毒的出现使病毒生命周期的研究更加有趣，在16.9中阐明了病毒获得细胞内序列 的各种方式。部分病毒序列被V-Onc 基因所取代。蛋白合成时产生Gag-V-one蛋白而不是通常的Gag,Pol和Env蛋白。由此产生的病毒是一个复制缺陷型，它本身不能维持感染周期， 但在为其提供它缺失的功能的辅助病毒的帮助下，它仍可不断增殖。 onc是oncogensis的缩写，其作用 是转变培养细胞，使通常的生长调节被转化的复制缺陷型病毒的部分序列不起作用，从而实现无限制的分裂。.具有复制缺陷的病毒可在有被细胞序列所替换病毒及细胞onc基因都可以产生致癌19.9 . 野生型功能的帮助病毒的协助下完成复制细胞(见第28章)。 V-onc基因为病毒提供转变某种宿主细胞的能力，在宿主基因组中发现的带有同源序列 的位点被称作C-onc基因。反转录病毒怎样获得onc基因呢?C-onc和V-onc基因的结构存在显著区别。C-onc基因通常被内含子阻断，，但是V-onc基因不被阻断。这些结构特征表明 V-onc基因来源于剪切的C-onc基因RNA拷贝。16.10 阐明了一种转化病毒形成的模型。一个反转录病毒整合到 C-onc基因附近的位点，由于发生缺失，使前病毒和C-onc 基因融合在一起；转录后产生连接RNA，在一端有病毒 序列而另一端含有C-onc序列。经剪接除去病毒及细胞内 的部分RNA的内含子。此RNA具有包装病毒颗粒的合适 信号，如果细胞还包含另一完整的原病毒拷贝就会产生病 毒。因而一些二倍体病毒颗粒就可能含有一条融合RNA 和一条病毒RNA。 在这些序列间进行重组可以产生转化基因组，在该基 因组中，病毒的重复序列位于两端(在反转录的感染周期 中，重组以高频率发生。我们还不清楚重组是否需要类似 的底物，但我们推测在病毒基因组和细胞内部分融合的 RNA之间的非同源反应通过与病毒重组相同的机制进 行。) 整个反转录类的共同特征表明：所有反转录可能来源于相同的祖先。由于核酸聚合酶 的存在，原始IS因子可能会包围宿主基因，形成LTR-Pol-LTR的单位。通过获得包括包装RNA在内的复杂功能来控制DNA和RNA基质，它可以进化成传染性病毒。而其它的功能， 例如转变基因，可能是以后添加的。（没有理由认为获得细胞功能的机制是onc基因所特有的，携带这些基因的病毒可能具有一种选择的优势，因为它们可以刺激细胞生长。） 19.10 具有复制缺陷的病毒的产生机制如下: 通过整合和切除病毒的基因组来产 -宿主转录产物,并和一个正常的RNA基因组一起组装.非同源重组对于产生一个融合的病毒 . 生具有复制缺陷的病毒是必须的 Ty因子由一个分散的重复DNA序Ty因子终止于短的正向重复，列家族组成，它们是在不同酵母链的转录为两段重叠的RNA。它们有两个开不同位点被发现的。Ty是发阅读框架，其序列与反转录的gag和“transposon yeast”的缩写。发生pol基因有关。 一次转座能产生一种独特的印迹：有 5bp长的目标DNA在插入Ty因子的两基础上都有多种变化：包括碱基对的 端重复了。Ty转座比细菌转座的频率替换、插入及删除。在一个典型的酵 母基因组中，有大约30个Ty1类及大-7-8要低，后者大约在10到10之间。 约6个Ty917类的拷贝。另外还有游 离的100个δ型因子的拷贝，此因子 各个Ty因子间存在着一定的差叫做soloδ。 异；大多数因子可以被归为Ty1和 Ty917两类因子的其中之一，它们大体尽管一个独立Ty因子的两个复制结构上是相同的（见。每个子看起来是相同的或者至少是非常接 因子均长6.3kb，每一末端的最后近的，δ序列也还是表现出相当大的 330bp构成直接复制子，叫做δTy因不同。连接在Ty因子上的δ序列比游子。每种Ty因子在它们那一类原型的离的δ因子在序列上具有更大的保守 性，这表明复制子的识别与转座有关。 的；当其中一个被检测到，就有更大 的可能性发现更多的现象。基因在Ty Ty因子被转录成两种聚腺苷酸化因子的不同位置间转化，导致了一个 RNA，这种RNA构成了单倍体酵母细胞因子被其它序 一个独特的Ty因子，被为中全部mRNA的5%以上。两种转录都开列所“取代”。 含有一个内含子。转座导致出现缺乏内始于左侧末端δ因子内的启动子，其 含子的多拷贝体。这些拷贝体有一样的中一个在5kb后终止转录，另一个转在正向重末端重复，这都是由原来的Ty因子的一录在5.7kb终止，这已经在右侧末端复的δ序列间个边界生成的。 δ序列范围内了。 进行同源重组 可以切除Ty因 Ty因子序列有两个开放的阅读框子，大量的游离δ因子可能成为这种 架。这两个框架在同一方向上表达，重组的印迹。自然切除可能与由于插 入Ty而引起突变的转置有关，转置的 水平决定于留在后面的确切的δ序 列。 这里有一个自相矛盾之处，就是 两个δ因子有相同的序列，但是当一 个末端δ内的启动子被激活的时候， 另一端δ内的却是终止子被激活(在 其它转座因子中发现了一个很相似的 特征，包括反转录病毒)。 Ty因子是经典的转座子，它通过 一个RNA中间体而转座。说 明了被使用来检测这种转座的一个可 但阅读的是不同的区段，而且有13个取；将内含子插入Ty因子中便产氨基酸的重叠。TyA的序列表明它编码生了一个独特的Ty序列，在质粒中的DNA结合蛋白，TyB序列含有与反转录GAL启动子的控制下，Ty序列被固定，病毒的反转录酶，蛋白酶及整合酶同同时被引入酵母细胞中。转座导致了 源的区域。 在酵母基因组中转座子的多拷贝体的 出现，但它们都缺乏内含子。 TyA和TyB在结构和功能上与反转 录病毒的gag和pol很相似。这两个我们只知道通过一种方式能切除 阅读框架以两种形式表达出来；TyA蛋内含子，那就是RNA剪接，这表明当白表现TyA阅读框架，且在其末端终有反转录酶存在时，转座以同一机理 止；而TyB阅读框架只表达为连接蛋进行。Ty因子被转录为RNA，然后由白的一部分。此连接蛋白允许终止密剪接装置识别。剪接的RNA由反转录码子从旁边过。通过这样一个特殊框酶识别而再重新生成双方的DNA拷贝。 架移动，TyA区域就融合到TyB区域了 (类似于反转录病毒中gag-pol的翻带有反转录病毒的同类物伸展得 译)。 更远。原始Ty因子两个δ因子的序列 之间有差异，但转座因子具有相同的 Ty因子间的重组好像是瞬间发生δ序列，都是源于原始因子的5′δ 端。如果我们认为δ序列就象U3-R-U5实上作用于它们的RNA)。 域组成的LTR一样，那么TyRNA便是 从R区延伸到R区。正好像在 中所演示的反转录病毒那样，通 过增加一个U5区域到3′末端和增加 一个U3区域到5′末端，整个LTR就 又生成了。 尽管Ty因子并没有提高颗粒的感染 Ty因子产生类病毒颗粒。感谢率，但在转座被诱导的细胞内类病毒 Alan Kingsman提供照片。 (VLPS)颗粒具有积累作用。如16.13 所示。他们包括全长RNA，双链DNA， 反转录酶活性和有整合酶活性的TyB 产物。TyA的产物被像gag基因前体 那样切去以产生成熟的VLP(类病毒颗 粒)核蛋白，这在Ty转座子和反转录病 毒间都是类似。Ty因子的短期行为像 反转录病毒，只是由于失去env基因而 不能正常打包基因组。 在任何酵母基因组中只有一部分 Ty因子是有活性的，而大多数均不能 转座 (类似于惰性内源原病毒) 。由于 这些“死亡”的因子保留δ复制子，所以 在对一个活泼因子合成的蛋白作反应转座被Ty因子里的基因控制，而 时，他们仍为转座提供目标。 GAL操纵子被诱导用于控制已被标记 的Ty因子转录：加入半乳糖 (galactose)可使其打开。操纵子的诱 导有两个影响。激活标记因子的转座 是必要的。其活性也增加了Ty因子在 酵母染色体转座的频率。这暗示着Ty 因子产物对别的因子起反式作用(事 D. melanogaster 第一次推断出D.melanogaster中 三种可转座的D.melanogaster的转座因子的存在，是在鉴定E.coli 中的因子有不同的结构 中第一插入序列的类似观察中。有人组中copia因子的数量得到了充分的增 观察到不稳突变通过缺失恢复为野生加，达到了2到3倍。从附加的因子型，或者在突变启始位点产生侧面材可以看出copia因子在新位点的插入。 料的缺失，同时产生一个终止点。以一些未知方式作适应性培养，使得 316.14示，造成这些现象的原因是一些每一代的转座率瞬间增加到10到 4类型的转座序列，其中包括copia反转10。 录子，未知类型的FB家族和15章《转 座子》中讨论过的P因子。 copia因子约5000bp长，有276bp 的同一性直接终止的重复片段。每一 研究得最多的反转录子的家族叫正向重复本身的终点都是与之相关的 copia。它的名字反映了大量密切相关反向重复。在目标DNA的插入位点会的，用于用于编码丰富的mRNA的序产生一个长5bp的正向重复。copia家列。还有一些其他的序列完全无关，族成员中个体的差异是很小的，一般 结构和行为却比较类似。Copia家族可小于5%；而变化通常包括小的缺失。 以算是这些的典范了。 所有这些特点在别的类似于copia的家 族都是相同的，虽然他们的个体之间 copia因子的拷贝数依赖于fly菌差异更大一些。 株，通常是20～60。这个家族成员广 每一个copia因子的两个正向重泛分散。copia因子的位置显示了在 D.melanogaster的每一菌株中的不同复的是相同的。这意味着两种可能。 的（尽管有重叠）范围。 要么它们互相作用造成修复，要么它 们是一个父因子的一个正向重复在转 座中生成的。因为Ty因子也是类似的 情况，这也暗示着Ty因子同反转录病 毒的关系。 基因组中的copia因子总是完整 的，单独的终止重复的拷贝还没有发 现(尽管我们期望它们在重组删除干涉 材料的情况下产生)。copia因子有时被 发现以自由环状DNA的形式存在；像 反转录DNA环一样较长的有两个终止 重复，较短的则只有一个，包含copia RNA的粒子已经被注意到了。 copia序列有一单链的较长的读码 框架，长4227bp。copia开放读码框架 的一部分和反转录病毒的gag和pol 这些不同的发展都是经历了漫长序列间是具有同源性的。一个重要的 的进化时期的。比较最近（大约过去同源性缺失和病毒的被膜所需的env的40年时间）在实验室繁殖而分离的序列有一定的关系，这意味着copia不菌株，发现变化非常小。我们无法估可能产生类病毒颗粒。 算这个变化率，但通过细胞培养说明 了根本问题的本性。随后，每个基因人们发现copia的转录产物含有 丰富的聚腺苷mRNA，包括全长和部 分长的转录。mRNA有一通用的5'终尽管长度可变，FB家族的所有成止端，来自一个终止重复中央部位的员的反向重复是同源的，这种特征可 起始。一些蛋白的产生或许包含如通过它们的结构解释，它们的结构为 RNA接合和多蛋白分裂的步骤。 一单序列DNA的串联拷贝，被有较多 样性序列的较长延伸所分隔。如果从 尽管我们还缺乏copia转座子模末端进入FB因子，单序列单元长度会 式的直接证据，它与反转录系统有如增加：最初是10bp，然后延伸到20bp，此多的相似性以致于结论似乎不可避最后达到32bp。单序列FB因子的两免地就是“copia一定有一个同反转录个反向重复拷贝不具有同一性。 病毒相关的起源”。很难说它具有多少 反转录的功能。我们知道copia因子显关于FB因子的末端结构我们还然是发生转座的。但是(就象Ty因子的不清楚，是什么给予FB因子转座的能情况)没有任何说明其感染能力。 力呢?有时两个不同一的FB因子看起 来好像合作去转座一个大的相互缠绕 的DNA片断，可能是合成的细菌转座 D.melanogaster中转座因子的另子的记忆行为(尽管FB因子间的DNA一个家庭成员FB(foldback的简称)有长度可能更长，达200kb)。或许FB因可变长度的反向终止重复。一些FB因子的每一末端的侧面的任何DNA序列子仅构成并列反向重复，另一些反向都可以有像这样一个单位一样的行 重复通过非重复DNA区隔离。 为。 病毒超家族 非病毒超家族 常见类型 Ty（S.cerevisiae） SINES B1/Alu(mammals) copia（D.melanogaster） Processed pseudogenes of LINES L1(mammals) pol III transcripts 边界 长的终止重复 无重复 目标重复 4-6bp 7-21bp 阅读框架 反转录酶和/或整合酶 无 结构 可能包含内含子 无内含子 表16.15区分了两种反转座子： , 反转录病毒是有转座能力的, 另一大类反转录子的外在和 反转座子的范例，因为他们能内在特征是一致的，这表明他 编码而恢复转录酶和整合酶们在RNA序列中启始，尽管 的活性。逆转座子与反转录病在这些情况下我们仅能推断 毒的区别在于他们自己本身关于DNA的拷贝是如何产生 并不通过一个独立的感染形的，我们假设他们是被别的地 式，但是在用于转座的机制上方编码的酶系统催化的转座 与反转录病毒近似。这组被称过程的目标。他们启始于细胞 为病毒的超家族。 的转录，他们并不编码有转座 功能的蛋白，这组被称非病毒copia序列一定有一些激活的因子具有 超家族。 编码转座的功能。 非LTR因子的反转录靠在RNA 模板上的目标上刻痕为cDNA生成提供引哺乳动物基因组包含大量的互相 物而发生。 关联的的短序列（由第四章介绍的适 度重复DNA组成）。这些成份的一个 重要部分构成逆转座子。上述两个家 族包含了这些材料中的绝大多数。他 们最初作为的离散的重复序列，每一 个含有许多分散在基因组里的成员。 LINE含有长分散序列，SINES含有短 分散序列。一个更重要的区别或许是 LINES来自RNA聚合酶?的转录，而 SINES则来自RNA聚合酶?。 包含20,000-50,000个LINES的拷 贝的哺乳动物基因组叫做L1，其典型 成员6500bp长，终止于富含腺嘌呤的 束。开放的读码框架可能存在，一种 已被测序的因子有1137bp和3900bp 的读码框架，其中有14bp重叠。其中 可以发现转录。正如LINES家族在重 复DNA区所暗示的那样，在单独成员 中IINES家族表现出了变化。然而， 同种的家族成员间与种间的相比较， 表现出了相对的同源性。 病毒家族的反转录子有终端重 复和开放阅读框架。 LINES因子，以及一些别的因子， 并未在LTRS终止，LTRS是一种典型 的反转录病毒因子。这提出了问题： 反转录是如何启始的?这并不包括典 型的tRNA引物和LTR配对的反应（见 图16.6）。这些因子中的开放读码框架 缺乏许多反转录病毒的功能，如蛋白图16.16比较了病毒超级家族成 酶或整合酶功能区，但确实有一些典员同反转录病毒范例。我们知道一个 型的类转录酶序列，同时其产物可能激活的Ty因子有编码转座的功能。我 也有内切酶活性。 们可能可以推断在苍蝇基因组中的 图16.17表明这些活动是如何支RNA的反转录）的信息。这种过程能 持转座的。逆转座子编码的核酸内切被反转录病毒调节吗?它是通过一个酶活性造成了DNA靶位点的缺刻。该异常的细胞系统完成的吗?或许被转因子的RNA产物与固定在缺刻处的座序列的末端碰巧与转座子末端序列 DNA相联结。该缺刻提供了3-OH末相似。 端用以在RNA模板的基础上引发 CDNA的合成。还需要第二次切割打在这些基因组中转座是不是真的 开DNA的另一条链，并且RNA/DNA发生了或者我们只是看到了前辈们的 杂交式在这个阶段或在它已被转化成足迹?对转座已存活的系统，他们一定 加倍DNA后被联到缺口的另一末端。已在种种系中发生；假定相似的事件 一个相似的机理被用于一些流动内含已发生在体细胞中，但其存活不超过 子（见图23.11）。 一代。 由于LINES起始于RNA聚合酶最显著的SINES是由一个个单一?的转录，基因组序列是必然失活的：家庭成员构成的。除了家族的个别成 因为他们缺失启动子，也就是最初转员在基因组因周围分散而不是被限制 录启始点的上游序列。由于它们通常在串联的束状结构上。以外，其家族 具有成熟转录的特征，它们被称为过的较短长度和高度重复使其能与简单 程假基因。 序列DNA相比较。与不同种问相比， 在同一种内的成员间还有一个重要的 图16.18中比较了过程假基因的相似性。 典型特征和源基因及mRNA。该图表 明了所有相关的诊断特征，但在任何在人类基因组中，中等重复DNA一个个体样品中只能找到其中的一的大部分以约300bp序列存在，他们些。RNA聚合酶?的任何转录能够有分散于非重复DNA中。至少一半的复规则的提高这种假基因活性。在这方性双链(DNA/RNA)在单一位点被限制面有许多例子，包括第一次被发现的酶AluI切割，在沿序列170bp处。被过程球状假基因。(参看4章) 切的序列都是一个单一家族的成员， 在通过它的同一性确定后以Alu家族 假基因可能开始于相对等于RNA 命名，在单倍体基因组中约有300,0005'端点的那个点，这只有当DNA来源个成员。(相当于每6kb的DNA有一于RNA时才出现。一些假基因构成精成员)。单独的Alu序列相当分散，鼠确连接的外显子序列；我们还不知道中有一个相关序列家族(B1家族有50，在DNA中识别内含子的机理，因而这000成员)，在中国大鼠(被叫做Alu等种特征被用于解释RNA调节阶段。假价家族)和基它哺乳动物中也有。 基因可能终止于A?T碱基对的短延 伸，假定其来源于RNA的聚腺苷酸的Alu家族的各个成员仅仅是相关， 尾巴。在假基因的每一边是短正向重而不是相同。人类基因家族似乎起源 复，可以认为它们是通过类转座产生。于130bp串联碱基的复制并有一个无 过程假基因停留在与他们的假定启始关的31bp碱基被扦入二聚体的右半部 位点无关的位置。 分。Alu序列的两个重复有时被叫做左 半重复和右半重复。Alu家族的个别成 过程假基因并不运输任何可能用员和同感序列有的一致性平均有 于帮助转座（或者执行前面叙述过的87%。鼠B1家族的重复单位有130bp 长，与人类重复单位的一个单体相对源性。 应，它和人类的序列有70～80%的同 假基因可能 在RNA的反 转录中产生。 此过程生成 的整合入基 因组的杂 合DNA。 Alu序列同7SL RNA有关，7SL RNA已经发现了Alu家族中具有一定 是一种信号识别颗的多样性，这一性质的无处不在已推 粒中的成份。(见第八章“蛋白质的定动了关于它的功能的很多看法的出 位”)。7SL RNA以一条中间插入序列现，但目前还不可能看清他的真正功 和Alu序列的左半部相对应。因而7SL 能。 RNA 5'末端有90个碱基与Alu序列右 端同源，40个3'末端的碱基Alu右端至少家族的一些成员能被转成自 同源。7SLRNA中间的160个碱基与主RNA。在中国大鼠中，Alu等价基Alu无同源性，7SL RNA被RNA聚合因家族成员中的一些(尽管不是全部)酶?转录的基因编码。这些基因(或其在体内表现出被转录。这种转录单位 相关基因)降低Alu序列的活性是可能被发现在别的转录单位的邻近。 的。 Alu家族成员可能包括结构基因 Alu家族成员类似于短重复序列转录单位，正如它们在长核RNA中所侧翼的转座子。然而Alu家族各个成表达的那样。在单核分子中Alu序列员的重复长度不同，这一特征令人奇的多拷贝存在能产生二级结构。事实 怪。由于它们来自RNA聚合酶?的转上，反向重复形式中Alu家族成员的录，因而各个成员携带内部活性启动存在是哺乳动物RNA中二级结构的主子是可能的。 要原因。 反转录是使反转录病毒的再生和前病毒具有这种结构。别的具有这种 逆转座子永存的一个统一的机制。尽结构的因子已被在不同的基因组中发 管反转录病毒通常被认为是来自自由现，其中大多数在S.cere和D.mel中。病毒的形式，但因子的每种类型的循酵母中的Ty因子和蝇中的copia因子环是有相似规则的，然而逆转座子被有与反转录酶同源性的编码通过RNA认为来自基因组形的位置。 的形式流动。他们将产生类似病毒的 颗粒，但无感染能力。哺乳动物基因 反转录病毒有单链RNA基因组，组的LINES序列被进一步从反转录病 它以一个双链的DNA为媒介被复制。毒中移走，但保留是够的表达一般启 一个单独的反转录病毒包含它的基因始的相似性。 组的两个拷贝。基因组包括gag，pol 和env基因，这些基因被翻译成多蛋另一类反转录子有经过RNA转座白，随后他们每一个又被切成小的功的高度标记物，但没有编码顺列(或至能蛋白。gag和env基因与RNA的包少无近似的反转录功能)。他们或许花装和病毒子的产生有关，pol基因与核类反转录病毒转座中已作为乘客被启 酸合成有关。 始，其中一个RNA作为反转录酶的靶 子。过程假基因被这种过程提高明显 反转录酶是pol基因的主要成份，以这种过程中启始的一个特别杰出的 负责合成病毒RNA的一个DNA拷贝。家族是哺乳动物SINES基因，包括人DNA产物比RNA模板长，通过开关类Alu家族。一些SnRNAs，包括7SL 模板链，反转录酶拷贝RNA的3'序列SnRNA基因，(SRP基因的一个组分)到DNA的5'末端，同时拷贝RNA的与这个家族有关。 5'序列到DNA的3'末端。这产生了 DNA的典型长端重复。线性二重DNA 通过整合酶被插入到寄主基因组中。 来自长端重复左端启动子的整合DNA 的转录产生了RNA序列的进一步拷 贝。 在一个感染循环中，一个反转录 病毒可能和一个细胞序列交换部分通 常序列，结果通常导致病毒的复制缺 头，但在和一个帮助病毒的连接感染 过程中，能保持永久。很多缺失病毒 已获得了一个细胞基因的RNA版本 (版本I)。很多基因以版本工的形式表 达中的一个序列或许会引起细胞转变 成致癌基因表型。 整合产生了直接靶序列的重复(正 如经过DNA启动的转座子)因此，一 个扦入的前病毒有长端重复的正向重 复区，通过靶DNA的短重复的侧翼。 哺乳动物和鸟类基因组的内源(不活泼) 第16章习题 生91班 钱猛(992229) 陈涤非(992242) 概念题 指以RNA为介导通过反转录来移动，以cDNA形式整合到基因组中的遗传因 子。这些因子是真核生物所特有的，并是可转移DNA的主要形式。 反转录因子可分为两类主要的家族。病毒家族包括反转录病毒和在结构和转座机制上类 似于反转录病毒的的非病毒转座子（它们被称为反转录转座子）。非病毒家族包括与反转录 病毒的结构和转座机制不同的自由转座子（它们被称为反转座子）和因得到外来的反转录酶 的反式作用而发生偶然移动的DNA序列，这些序列称为反转录序列，细胞mRNA中与之对应的是反转录基因。 一种必须整合到寄主基因组才能复制，且复制以RNA为中间体的病毒，其特征是两侧具有LTRs和三个开放阅读框gag，pol，env。其中pol编码反转录酶，它只在真核生物中发现。 一种有反转录病毒特征但缺少形成感染粒子能力的移动因子， 与反转录病毒的结构和转座机制不同，但可编码反转录酶的自由转座子。 结构与反转录子相似，但失去了反转录酶整合酶功能的移动因子，其需反 式提供。 简答题 1． 列出转染病毒正链RNA掺入到宿主双链DNA的详细过程。 答： （1）病毒颗粒将正链RNA基因组携带到宿主细胞中。 （2）宿主tRNA与病毒RNA下游的US区域进行退火。 （3）反转录酶以tRNA作为引物开始合成负链DNA。 （4）反转录酶终止在模板的末端，形成强终止负链DNA。 （5）反转录酶的RNA酶H活性消化对应于R区的模板RNA的5`末端（RNA酶H能降解DNA与RNA杂合双链中的RNA链）。 （6）强终止负链DNA与病毒3`末端的R区退火。 （7）反转录酶催化强终止负链DNA延伸成一长负链DNA，而且其5`末端仍保留tRNA引物。 （8）切除tRNA引物。 (9）大部分病毒RNA被降解。 （ 10）由剩下的病毒RNA引发强终止正链DNA的合成，注意这一过程同样是由反 转录酶以DNA作为模板催化完成。 （ 11）强终止正链DNA与长负链DNA 3`末端的US区退火配对。 （ 12）正链不断延伸直至全部合成。 （ 13）负链合成以5`端 U3元件的3`末端合成。 2． 描述酵母Ty元件的结构。它与反转录病毒有何相似之处？为什么它不形成感染粒子？ 答： Ty元件的每一端均是一个同向重复序列，称为δ元件（delta element）。Ty元件有两 个可读框，与反转录病毒的gag和pol基因具有同源性。第二个可读框的翻译需要核糖体的 移码，正如反转录病毒的pol基因。Ty元件缺少env基因，因此不产生感染性颗粒 3． 列出病毒和非病毒超家族反转录转座子之间的4种差异。 答： 病毒超家族成员含有长末端重复序列LTR、编码反转录酶或整合酶的可读框以及内 含子，但非病毒反转录转座子并不含有这些序列。同样，病毒反转录转座子的整合会在靶位 点产生一段4～6个核着酸的短重复序列，而非病毒反转录转座子则产生7～21个核着酸重复序列。 4 IS元件整合到靶位点时会发生什么？ 答：由于在转座子插入之前已产生一个交错切口，而且这一交错切口在转座子插入后被 填补，因此导致靶位点序列重复。 5当（ l）DNA在两个同向重复之间（2）DNA在两个反向重复之间发生重组的效应各是什么？ 答： 同向重复序列之间的重组会导致重复序列之间DNA序列发生缺失。反向重复序列之间的 重组则会使重复序列之间的DNA序列发生倒位。 6 gag和pol基因的蛋白产物是怎样生成的？ mRNA编码的Env蛋白是怎样生成的？ 答： 反转录病毒的所有结构蛋白均由单个初级转录物翻译合成，其中第一个合成的蛋白为 Gag蛋白。为了合成Pol蛋白，Gag基因的终止密码子必须被抑制或者核糖体移动读码框。 这样，Pol只是以Gap－Pol融合蛋白的状态存在，最后由病毒蛋白酶剪切。Env蛋白是通过mRNA可变剪接合成的。 7蛋白酶为什么对反转录病毒生活史很重要？ 答： 翻译Gag蛋白、Pol蛋白和Env蛋白之后，病毒蛋白酶分别将其切割成两到三个有活性的病 毒蛋白片段。 8 列出一个转座子插入到一个新位点所要求的步骤。 答： 首先，在靶位点处产生一个交错切口，切出转座子。接着，转座子与靶位点连接。 最后，填补插入位点两侧的单链区。 9噬菌体整合到宿主基因组后，4～6个宿主DNA的核着酸被复制，这是为什么？这与转座子 插入新位点有何相似之处？另外，两个核着酸从5` U3的5`和3`被切除，这意味着遗传信 息从反转录病毒中被丢失吗？ 答： 由于反转录病毒整合酶（retrovirai integrase）在整台位点切开一个交错切口，造成 靶位点重复。插入之后，填补切口产生重复序列。转座酶在靶位点产生同向重复序列。病毒 基因组每侧两个核着酸的缺失并不会导致类似基因组另一端的序列的其他拷贝的丢失。 10什么是杂种不育？是怎样引起的？ 答： 杂种不育（hybrid dysgenesis）是出现在果蝇(Drosophila melanoggaster)特定品系杂交后代中的一系列染色体畸型（chromosome abnormalities）。这些染色体畸型是由一个亲染色体中转座P元件活性引起的。如果母本不含P元件，则会激活P元件活性， 产下的卵细胞缺失P元件编码的转座阻遏蛋白。 11反转录病毒怎样获得像onc基因这样的细胞基因？获得此类基因会对反转录病毒基因产 生影响吗？一个反转录病毒怎样才会丢失如pol和env这样的重要的基因而复制？ 答： 当整合的原病毒和邻近细胞基因之间出现缺失，反转录病毒可获得细胞基因。原病 毒启动子起始的转录产生一个融合 mRNA，剪接之后被包装进病毒颗粒。当病毒获得宿主 DNA时可丢失诸如 pol或 env等反转录病毒基因，但这样的病毒不能自身进行复制，必须 依赖于野生型病毒的辅助。 12你如何证明Ty元件在转座时经历了一个RNA中间体？ 答： 构建一个含有内含子与标记δ元件的人工Ty元件。采用诱导型 GAL启动子合成大 量Ty元件的mRNA。从而使这一元件整合到基因组新位点的转座频率增加。检测新插入的Ty元件。若它们具有标记δ元件但缺少内含子，则它们必然是通过RNA 中间体。 13反转录病毒与反转录转座子有什么不同？ 答：反转录转座子的动是指通过RNA实现转座的遗传元件。反转录病毒是由一系列反转录 转座子构成含RNA基因组的侵染性颗粒。 14 在什么过程中会形成一个共整合体？它的结构是什么？ 答： 在复制转座中会形成共整合体（cointegrant），其中含有两个方向相同的转座子拷 贝，并由原有复制子隔开。 15描述两种转座子引起基因组重排的方式。 答： 转座子转座时能够导致宿主序列的缺失、重复或插入。另外，转座子通过宿主重组 系统导致基因组重排。 问答题 1．即使不携带癌基因，反转录病毒依然会导致癌变转化。列举这种现象发生的三种方式。 ．答： 野生型反转录病毒在插入宿主染色体时能够引起致癌性转化。结果引起了。c-onc基因的不正确表达。如果前病毒插入到c-onc基因的第一个内含子(并且插入方向与该基因的方 向相同)，c-onc基因将被反转录病毒LTR的强启动子所转录。这就提高了c-onc蛋白的水平，使c-onc失去了正常的转录控制。如果前病毒以与基因相反的方向插入，它会激活一个 转录c-onc的偶然启动子。如果病毒的增强子激活了正常c-onc基因的启动，那么即使是插 入到v-onc的下游也会刺激c-onc基因的表达 2 简述大肠杆菌的插入序列，并指出它们对自发突变的重要性。 答：。 插入序列（IS）是可以转座的遗传元件，它们只插入自我复制的DNA中，如细菌和噬菌体的染色体及质粒。大肠杆菌中，有几种不同的IS元件，长度都是0.7～1.5kb。每种都有特定核苷酸序列，有的编码转座酶，负责启动特定IS的转座。一般来说，每个IS的两端都有一对短的反向重复，长约9～41 bp（图A8. l），转座酶似乎就是通过识别这些反向 重复序列起始转座的；也就是说，特异的转座酶和反向重复序列对转座都很重要。转座的另 一个性质是每个IS的两端都与宿主DNA的短正向重复序列（3～13bp）相连；这是宿主DNA上的靶位点，在转座过程中该位点被复制。转座 时，IS向基因组中新的位置随机地移动。 通常，它插入一个结构基因产生突变表型，有时是因为编码序列受到阻断，有时则因为IS元件含有多种转录或翻译的终止信号。另外，IS可插入操纵子的操纵基因一启动子区域， 导致整个操纵子被关闭，但偶尔操纵子的表达也会变为组成型。当IS含有一个正确定向的启动子时，可以转录细菌操纵子。因为这个启动子不受调节细菌操纵子的正常调控蛋白调控， 产生的 效果类似于操纵基因组成型突变。所以，IS元件的转座是自发突变的一个重要来 源。必须意识到这些突变不能被碱基类似物或移码突变诱变剂诱导和回复。大肠杆菌中有几 种不同的IS元件，拷贝数在l～5。 3 分析比较细菌转座子的结构与特点。 答： 1974年，随着发现与抗生素抗性有关的基因可以在质粒与细菌的染色体之间转移， 科学家发现了转座子。转座子比IS元件大很多（一般为2～20kb），它们至少含有一个基因， 给宿主带来可遗传的标记，一般是对一种或多种抗生素的抗性。这是一种非常有用的性质， 因为每种质粒可以用一种转座子“标记”，这样通过对药物的抗性表型可以简单地检测质粒 的存在和转移；同样，可以轻易地观察到转座。 转座子Tn5(图 A8.2)长5.7kb，是一种结构最简单的转座子；它由三个成分组装而 成：一个长中心区（2～7kb）,含有卡那霉素的抗性基因，两端为一对IS元件，每个长1.5skb，方向相反。其他的转座子两端为不同的IS元件，有时两个IS同向。这些转座子的转座类似 IS元件，转座过程中宿主的一个序列或DNA靶位点被复制。发生转座首先是因为任意一个 IS序列或两个IS序列同时起作用，编码一个转座酶（在某些元件中；如Tn5，一个IS只有部分功能，不能编码一个有活性的转座酶）；其次，转座子两端通常有一对与IS特异的反向重复序列：无论IS元件是正向还是反向的，这些末端重复序列都存在。 还有一种可能性：任一对IS元件可以相互作用使它们之间的任意序列转座，这样任一 个基因都可以在两端连上两个同样的IS元件成为转座子；这个性质已被用构建重组 DNA分子。 Tn5因为其组件的组成被称为集成转座子。其他转座子，如复杂的转座子的结构是不同的； 它们两端不是一对IS而是一对反向重复，编码转座所需蛋白的基因位于转座子的中心区。