黑柄炭角菌产生的DPPH自由基捕捉成分

黑柄炭角菌产生的DPPH自由基捕捉成分 41 卷 3 期 Vol . 41 No . 3 微生物学报 2001 年 6 月 Acta Microbiologica Si nica J une 2001 3黑柄炭角菌产生的 DPPH 自由基捕捉成分 吴根福 ( )浙江大学生命科学学院 杭州 310012 摘 要 : 对黑柄炭角菌深层发酵制品中的 DPPH 自由基捕捉成分进行研究 。经硅胶柱层析 、 中压液相色谱顺相和反相分离 、制备型高压液相色谱分离等一系列步骤 ,共获得相对纯度在1 85 %以上 ,收量在 2mg 以上的自由基捕捉物质 20 个 ,对其中的 B4216 进行了质谱 、H2NMR 、13 1 13 C2NMR 、H2C HMBC、红外光谱等的测定 ,测得分子式为 C H O ,推断它为 5 ,8 二羟基 32甲 10 10 4 μ基23 ,4 二氢异香豆素 。在 20molΠL 时 ,它的 DPPH 自由基捕捉活性为维生素 C 的 1167 倍 ,维 生素 E 的 211 倍 。 关键词 : 黑柄炭角菌 , 自由基捕捉成分 , 结构鉴定 () 中图分类号 :Q949132 文献标识码 :A 文章编号 :000126209 20010320363204 ( ) 黑柄炭角菌 Xylaria nigripes是一种药用真菌 ,其菌核系传统中药乌灵参 。据中国药 1 2 用真菌学记载,具有益气健脑 、养血安神等多种保健功效 。陈宛如等曾对黑柄炭角菌 γ的化学组成进行了分析 ,对腺苷 、多糖 、2氨基丁酸 、维生素 B6 、甘露醇等一批活性物质进 3 行了定性或定量的测定 ,马志章等就黑柄炭角菌及其多糖对贫血大鼠造血功能和小鼠 巨噬细胞功能的影响进行了免疫活性测定 ,从而对它的保健机理有了初步的了解 。本文 ) (利用 DPPH 1 ,12二苯222苦肼基对黑柄炭角菌中自由基的捕捉成分进行了分离筛选 。 1 材料和方法 1. 1 材料 11111 黑柄炭角菌菌粉 :由浙江佐力医药保健品有限公司提供 。批号 970902 。 () 11112 其它所用仪器及材料 : 薄层层析用 Kieselgel 60 FMerck;MPLC 用 BPLC26002FC254 ( ) () Yamazen; HPLC 用 Chromatocorder 21 ; NMR 用 ALPHA400 J EOL 核磁共振仪 ;MS 用 J EOL JMS2DX2302 质谱仪 ; IR 用日立 270250 红外光谱仪 ,溴化钾锭剂法测定 。所用有机溶剂为 日本产分析纯试剂 ,所用 NMR 试剂为光谱纯试剂 。 1. 2 方法 11211 自由基捕捉物质的浸提 :参照文献 4 , 取黑柄炭角菌菌粉 500g ,装入 2000mL 三角 () ) (瓶中 ,加入提取液 丙酮 :水 = 80?201000mL ,25 ?浸提 7d 每天摇动 3 次,滤过 ,沉淀用同 样提取液洗涤 2 次 ,每次 250 mL ,合并滤液 ,减压蒸去丙酮 ,用 1 molΠL HCl 调节水层 p H 至 310 ,再用乙酸乙酯抽提酯溶性成分 ,在抽提液中加入无水硫酸钠脱水 ,滤过后减压蒸去乙 酸乙酯 ,获得黑柄炭角菌菌粉的酯溶性提取物 。 3 本研究受 Rotary International 资助 () 作者简介 :吴根福 1965 - ,男 ,浙江余姚人 ,浙江大学生命科学院副教授 ,硕士 ,主要从事微生物学方面的研究 。 收稿日期 :2000204221 ,修回日期 :2000211213 11212 黑柄炭角菌菌粉中酯溶性提取物的分部分离 :将分离所得的酯溶性提取物用硅胶 () Silica gel 60柱层析 ,流动相依次为 80 %己烷Π20 %乙酸乙酯 ,60 %己烷Π40 %乙酸乙酯 ,40 %己烷Π60 %乙酸乙酯 ,20 %己烷Π80 %乙酸乙酯 ,乙酸乙酯 ,甲醇 。将各层析液减压蒸发 后分别得到样品 A 、B 、C 、D 、E、F 。 () 11213 组分 B 、C 中 DPPH 自由基捕捉物的分离 : 将组分 B 、C 先用中压液相色谱 MPLC 正相 分 离 , 再 进 行 MPLC 的 反 相 分 离 ; 如 果 样 品 纯 度 不 够 , 则 在 制 备 型 高 压 液 相 色 谱( ) HPLC中分离 。 ( ) 11214 单离物纯度的检验 :单离物的纯度用硅胶薄层层析 TLC及 HPLC 分析 260nm 的 吸收来检验 。 11215 自由基捕捉成分的鉴定 : 将分离物进行 TLC ,风干后 ,喷上 DPPH 溶液 ,褪色者为 () DPPH 阳性 自由基捕捉物。其抗氧化能力用褪色时间来判定 : 在 1min 内褪色用 + + + 示 ,在 1h 内褪色用 + + 表示 ,在 1d 内褪色用 + 表示 。 11216 化学量论的脂质自由基捕捉实验 :参照文献 5 , 按表 3 加入试剂 ,加盖 ,室温下放 臵 30min 后 ,于 517nm 处测吸光度 。 2 结果和分析 2. 1 酯溶性提取物的分部分离 黑柄炭角菌菌粉浸出液经乙酸乙酯抽提后 ,得到酯溶性提取物 1197015mg 。装硅胶柱用 不同比例的己烷Π乙酸乙酯层析 ,得到 A 、B 、C 、D 、E、F 六个组分 ,其得率与部分性质见表 1 。 表 1 抽提物的得率及部分性质 Table 1 The yield and physical characteristics of extracted substances WeightΠmg YieldΠ% Fraction Physical characteristics Anti2oxidizing 659910 11 55A + + Oily liquid 43312 316 B + + + Oily liquid 68717 517 C + + + Oily liquid with crystal 22918 119 D + + Crystal 35111 219 + Oily iiquid with crystai E F 343617 2817 + + Oily liquid 2. 2 B 、C 组分中自由基清除剂的分离 将分部分离收集到的 B 、C 组分减压浓缩后 ,再用 MPLC , HPLC 等方法分离 ,共获得纯 (() ) 度较高 260nm 下 HPLC 中面积百分比大于 85 %,收量较大 大于 2mg的自由基捕捉物样 1 品 20 个 。其中 C1225 和 C621423 的 HPLC 保留时间及H NMR 图谱与曾经分离到的 7 ,4’2 二羟基异黄酮和 5 ,7 ,4’2三羟基异黄酮一致 ,推测为该二化合物 ; Cl2 也有与下述 B4216 相似的氢谱 ,可能是 B4216 的类似物 。 2. 3 B4216 结构的鉴定 B4216 为白色结晶 , 熔点 198 ?, 易溶于甲醇 、丙酮 , 较难溶于氯仿 , 我们对它进行了1 13 1 13 H2NMR 、C2NMR 、H2C HMBC 、FAB2MS 、IR 的测定 ,结果见图 1 ,表 2 。根据这些数据并 6 ,7 参照文献,推断它的分子式为 C H O ,是一种 5 ,8 二羟基232甲基23 ,42二氢异香豆素 。 10 10 4 3 期吴根福等 :黑柄炭角菌产生的 DPPH 自由基捕捉成分365 图 2 B4216 的自由基捕捉百分率 Fig. 2 The DPPH free2radical scavenging percentage of B4216 1 13 11Vc ; 2 . V; 3 . B4 - 16 . E 图 1 B4216 的H2C HMBC 图谱 1 13 H2C HMBC of B4216 Fig. 1 表 2 B4216 的几种光谱数据 Table 2 The several spectrum characteristics of B4216 Spectrum Data ()194 ,176 ,165 ,152 ,128 ,111 ,97 ,88 ,68 ,60 FAB2MSΠmΠz () ( ) ( ) ( ) 10 . 612 1H , s; 7 . 171 1H , d ,J = 8 . 8Hz; 6 . 754 1H , d ,J = 8 . 8Hz; 4 . 796 1H , m; 3 . 248 1 δ) (H2NMR () () ()1H ,dd ,J = 16 . 8 ,3 . 2Hz;2 . 701 1H ,dd ,J = 16 . 8 ,12 . 0Hz;1 . 549 3H ,d ,J = 6 . 4 13 δ)(C2NMR 170 . 779 ,156 . 284 ,146 . 328 ,125 . 628 ,124 . 773 ,116 . 164 ,109 . 207 ,76 . 924 ,29 . 124 ,21 . 060 ( ) IR KBrΠnm 3250 ,2950 ,2450 ,1660 ,1600 ,1490 ,1300 ,1220 ,1140 ,1060 ,830 ,520 2. 4 B4216 的化学量论的脂质自由基捕捉实验 μ) ) (α( 将 B4216 560gΠmL ,用 EtOH 配制连同对照2Toc V,860gΠmL ,用 EtOH 配制溶液 、ASAE (μ) Vc ,350gΠmL ,用 p H5. 5 的 011molΠL 醋酸缓冲液配制溶液按下表加量后 ,30 ?室温反应 (30min ,于 517nm 处测吸光度 。结果见表 3 。若它们的自由基捕捉活性按捕捉百分率 1 - 样 ) (μ) 品 ODΠ对照 OD×100 %计算 ,则其结果如图 2 所示 。对于相同摩尔浓度 20molΠL的571571 样品 ,B4216 的 DPPH 自由基捕捉活性约为维生素 E 的 1167 倍 ,维生素 C 的 211 倍 。 表 3 B4216 的自由基捕捉活性 The DPPH free2radical scavenging activity of B4216 Table 3 VΠmL 0 . 1molΠL Acetate bufferΠmL EtOHΠmL 0 . 5mmolΠL DPPHΠmL VcΠmL Sample ΠmL EOD 571 2 . 0 2 . 00 1 . 0 0 . 946 1 . 9 2 . 00 1 . 0 0 . 1 0 . 131 0. 1 2 . 0 1 . 00 1 . 0 0 . 325 2 . 0 1 . 98 1 . 0 0 . 417 0 . 025 2 . 0 1 . 95 1 . 0 0 . 050 0 . 167 2 . 0 1 . 90 1 . 0 0 . 100 0 . 133 2 . 0 1 . 80 1 . 0 0 . 200 0 . 129 th( ) ( 致谢 感谢国际 Rotary 组织 Rotary International 及其所属的日本静冈俱乐部 the 2620 ) section提供费用 ;感谢静冈县立大学及其所属的微生物生产学研究室提供研究条件 ; 感 谢广田阳教授和阿部尚澍先生给予的悉心指导 。 参 考 文 献 1 ] 徐锦堂主编 1 中国药用真菌学 1 北京 :北京医科大学 、中国协和医科大学联合出版社 ,19971664,6741 2 ] 陈宛如 ,方鸿峰 ,马志章 ,等 1 中国药学杂志 ,1990 ,11 :647,6491 3 ] 马志章 ,查士隽 ,虞研原 ,等 1 科技通报 ,1992 ,4 :252,2551 4 ] Sanbongi C ,Osakabe N ,atsune M , et al . J Agric Fcod Chem ,1998 ,46 :454,459 . () 5 ] 吴根福 ,吴雪昌 1 微生物学报 ,2000 ,40 4:394,3991 6 ] Marden A A ,Raimundo B F ,Otto R G. Phytochemistry ,1978 ,17 :511,516 . 7 ] Michel D ,Jean F B ,Albert K , et al . Phytochemistry ,1980 ,19 :2221,2222 . A STUDY O N DPP H FREE2RAD ICAL SCAVENGERS FROM XYLARIA NI GRI P ES Wu Genfu ( )College of Life Sciences , Zhejiang University , Hangzhou 310012 , China ( Abstract : The DPPH free2radical scavengers from the fungal Chinese medicine‘Wulingshen’Xy2 ) laria nigripes were studied. After separation using silica gel colunm chromatography , MPLC and HPLC ,20 DPPH free2radical scavengers with purity higher than 85 % and yield more than 2 mg were screened ,in which compound B4216 had relatively higher yield and stronger free radical scavenging () activity. The formula of compound B4216 was determined to be CHOMW : 194based on its 10 10 4 1 13 1 13 FAB2MS ,H2NMR , C2NMR , H2C HMBC , IR spectra , and its structure was elucidated. It was μidentical with 5 ,82dihydroxy232methyl23 ,42dihydroisocoumarin. At the concentration of 20molΠL , its DPPH free \ | radical scavenging activity was as 1 . 67 times as that of vitamin C or 2 . 10 times as that of Vitamin E. Key words : Xylaria nigripes , Free2radical scavenger , Chemical structure