养阴抗毒胶囊号对阴虚大鼠糖皮质激素受体蛋白表达的影响.doc

养阴抗毒胶囊号对阴虚大鼠糖皮质激素受体蛋白表达的影响.doc 养阴抗毒胶囊2号对阴虚大鼠糖皮质激素 受体蛋白表达的影响 ; 作者:丁鑫，侯颖，雎岩,史恒军 【关键词】; 养阴抗毒胶囊2号;糖皮质激素类;阴虚;糖皮质激 素受体;大鼠 ; 【Abstract】 AIM: To observe the effect of Nourishing Yin Antitoxic Capsule 2 (YC2) on the expression of glucocorticoid receptor proteins (GR) in Yin deficiency rats induced by hydrocortisone, and to investigate holy allocated to 4 groups: normal control group, Yin deficiency model control (YD) group, YC2 group and Guifu Dihuang Balls (GFB) group. Radioimmunological method munohistochemistry pared al group, the contents of CORT munohistochemistry stain (0.316?0.017, P<0.05). Compared munohistochemistry stain (0.342?0.013, P<0.05); the contents of CORT in GFB group ent, the contents of CORT in YD group al group, and the expression of GR in the liver cell nucleus prove the hyperfunction of hypothalamicpituitaryadrenal (HPA) axis. ; 【Keyicpituitaryadrenal, HPA)轴功能亢进状态，对GC所致的各 种阴虚症状有很好的疗效,1-2,. 我们在前期研究的基础上继续观 察该方对应用GC所致阴虚大鼠糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)的影响及调节作用，为临床进一步应用YC2治疗激素 副反应提供了实验依据. ; 1材料和方法 ; 1(1材料 ; 1.1.1动物清洁级SD大鼠32只，雄性，体质量(200?20) g(第四 军医大学实验动物中心)，合格证编号SCXK(军)2002005. 饲养 于第四军医大学实验动物中心清洁级动物实验室. ; 1.1.2试剂YC2(第四军医大学唐都医院药剂科)，批号 20050406. 药物组成:羚羊角、西洋参、石斛、生地黄、茜草、连 翘、仙鹤草、大蓟、小蓟等. 将胶囊内药物再次粉碎，过100目 筛， 使用前1 d加入蒸馏水配制成浓度为200 g/L的混悬液，4?保 存备用;桂附地黄丸(浓缩丸)(兰州佛慈集团)，批号2005464，将 药丸加蒸馏水化解，制成含200 g/L药物的混悬液，4?保存备用; 氢化可的松(山东新华制药有限公司)，批号0504041，使用前加 入蒸馏水配制成浓度为5 g/L的混悬液;速眠新?注射液(军事医学 科学院军事兽医研究所)，批号(2004)005013;皮质醇(CORT) 放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所)，批号051020; 兔抗大鼠多克隆抗体，批号:sc1004(美国Santa Cruz公司);即用型非生物素免疫组化EliVision plus检测试剂盒(福建迈新)，批号:kit5901. ; 1.1.3主要仪器美国16探头全自动测量γ计数仪;恒温离心机(TJL16GA，上海安亭);奥林巴斯显微照相系统. ; 1(2方法 ; 1.2.1实验动物分组SD大鼠32只,随机分为空白对照组,阴虚模型(yin deficiency model control, YD)组,YC2组,桂附地黄丸(guifu dihuang balls, GFB)组(阴性对照组)4组，每组8只. ; 1.2.2动物药物处理YC2组和GFB组在每天早晨按10 mL/kg浓度给予相应的药液灌胃，空白对照组及YD组给予同样体积饮用水灌胃，共3 d.; 第4日起除空白对照组外，其余各组均按阴虚大鼠模型复制方法,3-4,，每日17:00按50 mg/kg剂量给予氢化可的松灌胃，连续4 d，空白对照组给予相应量饮用水. 各组均在造模结束1 d后(第9日)处死取血. ; 1.2.3大鼠血浆皮质醇测定各组大鼠于第9日08:00~12:00间，以1 mL/kg剂量给速眠新?，麻醉后心脏取血4 mL，4? 3000 r/min离心10 min分离血清, 用放射免疫法(RIA)测定血浆CORT(corticosteroid, CORT). ; 1.2.4大鼠肝脏GR免疫组织化学分析大鼠处死后取适量肝脏组织. 置体积分数为40 g/L的甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋切片. 切片经常规脱水后，在体积分数为3 mL/L甲醇于室温下放置10 min. 去除内源性过氧化物酶，加人体积分数为100 mL/L山羊血清封闭非特异性背景15 min. 加1?100稀释的兔抗大鼠GR一抗，24 h过夜，再使用非生物素免疫组化EliVision plus检测试剂盒，按试剂盒说明添加A液，B液， DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封固. 阴性对照用0.01 mol,L PBS代替一抗，其余步骤不变. ; 统计学处理:大鼠血浆CORT测定的原始数据;免疫组化照片经灰度扫描转化为吸光度比值(imagepro 5). 采用SPSS 13.0(ONEWAY ANOVA)程序进行方差齐性检验后，继而进行方差分析和LSD检验.; 2结果 ; 2.1大鼠的表现YD组和GFB组自氢化可的松灌胃第2日起出现易怒，躁动不安，毛色不光. YC2组大鼠的情况与空白对照组相似，未出现上述表现. ; 2.2大鼠肝组织血浆CORT含量空白对照组血浆CORT含量为(5.27?0.57) μg/L;YD组血浆CORT含量为(9.92?0.69) μg/L，明显高于空白对照组(P<0.05)，约为空白对照组的1.88倍，说明动物 模型造模成功. YC2组血浆CORT含量为(7.28?0.72) μg/L，明显低于YD组(P<0.05)，约为YD组的0.73倍，提示滋阴药对外源性GC应用早期所致阴虚大鼠血浆CORT亢进有明显抑制作用. GFB组大鼠血浆CORT含量为(9.03?0.69) μg/L，与YD组差异无统计学意义(P>0.05)，提示助阳药对外源性GC应用早期所致阴虚大鼠血浆CORT亢进没有抑制作用. ; 2.3大鼠肝组织细胞核GR蛋白表达免疫组化染色结果显示，正常情况下GR在肝脏组织细胞核内广泛表达，免疫组化阳性反应较强，呈综褐色，其吸光度比值为0.425?0.017(图1A). YD组与空白对照组相比肝组织核内GR蛋白表达减少，吸光度比值为0.316?0.017(P<0.01)，提示阴虚模型建立成功(图1B). YC2组较YD组肝组织核内GR蛋白表达增多，吸光度比值为0.342?0.013(P<0.05),但仍然与正常组水平相差较大(P<0.05，图1C). GFB组肝组织核GR蛋白表达较YD组无统计学差异(P>0.05)，其吸光度比值仅为0.328?0.007(图1D). ; 3讨论 ; GC作为临床广泛应用的药物，具有抗炎、抗过敏、抗休克和免疫抑制作用，但同时又有许多副作用. 临床观察已证实大剂量应用GC阶段，副作用主要临床表现为亢奋、焦躁不安、潮热、盗汗等类肾上腺皮质功能亢进症状, 中医辨证为肾阴虚证; 在GC撤停阶段，则表现为乏力、纳差、精神不振、低血压等肾上腺皮质功能减退症状, 中医辨证为肾阳虚证. 既往实验大多观察助阳药对抗激素副作用，已证实其机制与A: 空白对照组大鼠肝组织; B: YD组大鼠肝组织; C: YC2组大鼠肝组织; D: GFB组大鼠肝组织. ; HPA轴功能减退密切相关，补阳药物对于改善HPA轴功能减退有很好疗效,5-6,. 随着激素服用方法的改进，在足量激素应用阶段，患者更多地出现面色潮红、心悸、烦躁、脉细数等阴虚症状. 中医辨证为阴虚内热，认为药毒伤阴，唯有用滋阴润燥、养阴益气之药，才能保证激素的疗效，减少其毒副作用的发生. 我们通过在短时间内给予大鼠大剂量GC，复制出外源性GC应用期肾上腺皮质功能亢进的实验动物模型. 该模型是现阶段应用较多，并较为公认的模型之一，能在较大程度上反映肾阴虚证患者体内的病理变化. 本实验明显可见阴虚模型组大鼠易怒、躁动不安、毛色不光，血浆皮质醇水平明显高于空白对照组，说明动物模型复制成功. ; GC在体内通过受体GR的介导而发挥作用. GR是GC发挥作用的关键因素. GR作为一种核转录因子只有被激素激活而由胞浆进入胞核后才能发挥其效应. GC通过与GR结合后与靶基因相互作用，进而调节基因转录或改变特定mRNA的稳定性而发挥作用. 因而， GC效应的强弱在很大程度上决定于细胞核内GR含量的多少,7-8,. 我们发现YD组与空白对照组比较，肝组织核内GR蛋白表达减少，而YC2组肝组织核内GR蛋白表达较YD组明显升高. 同时实验动物观察发现YC2组动物的易怒、躁动不安、毛色不光的表现较少. 这些提示我们在大量应用激素早期出现“阴虚”证副作用时，结合使用YC2可提高肝组织核内GR蛋白表达. 因此我们可以考虑在临床应用激素同时应用YC2可适当减少激素用量，直接减少大量激素应用产生的副作用. ; YD组血浆CORT含量较空白对照组有显著升高，说明大剂量GC所致的阴虚证与HPA轴功能亢进关系密切，但其功能亢进的发生机制仍不明确. YC2组血浆CORT含量较阴虚组减少，提示YC2对外源性GC应用早期所致阴虚大鼠血浆CORT增多有明显抑制作用，能够明显改善HPA轴亢进状态，减轻激素副作用. ; GFB是临床常用的、经典的滋补肾阳的中药复方，用于治疗以肾阳虚证为主证的各种疾病有肯定的临床疗效，把GFB设为阳性对照组意在比较两类补肾中药对同一证候的作用，本实验结果提示在辨治激素副作用时，仍然需要坚持辨证论治的原则. ; 针对激素使用过程中出现的阴虚证，史恒军组方的YC2滋阴益气，清热解毒，凉血消痈，安神除烦. 可明显改善临床患者盗汗、潮热、精神亢奋等类肾上腺皮质功能亢进症状. 本实验结果说明，YC2能够显著降低GC所致阴虚大鼠模型血浆CORT含量，同时提高阴虚大鼠模型肝细胞核内GR表达表达，抑制HPA轴功能亢进状态，减轻激素副作用，更好的使GC的抗炎、抗自身免疫等作用得以发挥. 亦为临床应用YC2治疗激素副作用提供理论基础. ; 【