基因芯片技术在预防兽医学中的应用_cropped

基因芯片技术在预防兽医学中的应用_cropped 1 2 包文奇,崔迎旭 ()1 郑州牧业高等专科学校医药系 ,河南 郑州 450008 ;2 焦作市马村区农林水利局 中图分类号 : S85文献标识码 :A() 文章编号 :1004 - 3268 200410 - 0078 - 03 基因芯片技术是一门物理学 、微电子技术 、生 ,根据探针核酸种 基因芯片的分类方法很多 化技术与生命科学等众多科学领域交叉综合的高 类的不同 ,可分为寡核苷酸芯片和 cDNA 芯片 ,前 新技术 。其关键是将巨大的 DNA 缩小到很 者可用于基因组学及表达谱研究 ,后者仅用于表 小的芯片上 ,利用光电技术对信号进行探测 ,最后 达谱研究 ;根据基因芯片固定的介质不同可分为 用计算机加以分析 ,从而使过去生物学中的复杂 玻璃片 、硅片 、尼龙膜 、陶瓷和微型磁珠等 。固定 实验变得简单 ,同时检测的数据大大地增多 。随 的方法主要分为 2 类 ,一是光刻技术原位合成保 着该项技术的成熟和应用 ,将为疾病的诊断和治 护法 , 特点是合成效率及点阵密度高 , 但设备昂 疗 ,以及新药开发 、分子生物学 、食品卫生和环境 贵 ,技术复杂 ; 二是点膜法 ,用特殊自动化微量点 监测等带来一次新的革命 。样装置将探针以较高密度涂布在支持介质上 ,该 方法所需设备价廉 ,技术简单且点阵密度低 。按 1 基因芯片的原理 、类型 基因芯片的用途又可分为表达谱芯片 、诊断芯片 、 ( 基因芯片是指将大量核酸片 段 寡 核 苷 酸/ 测序芯片 、毒理芯片和指纹图谱芯片等 。按点样 ) DNA 、cDNA 、基因组 DNA有规则地固定在某种 , 有光刻基因芯片 、机械微型点样基因芯 方法分 介质上 ,并以此为探针 ,在一定的条件下 ,与样品 片 、液体喷射技术基因芯片 。 中待检测的靶基因片段杂交 ,通过检测杂交信号 ,2 基因芯片的制备 从而实现对靶基因的存在 、含量及变异信息的快 速检测 。基因芯片的检测是基于基因芯片的探针 基因芯片的制备主要由原位合成和合成后点 和样品中的靶基因片段之间发生特异性的核酸杂 样 2 种方法 。载体多选择玻片或尼龙膜 ,尼龙膜 表面多孔 、具有渗透性 、所需体积大 、背景荧光高 , 交 ,其检测的步骤如下 : 样品的处理 ?核酸杂交 ?扩增 ?标记 可以重复利用 。目前应用较为广泛的是玻璃基 ?片 。基因芯片制作从准备探针开始 ,经过芯片加 芯片制作 ?固化处理 ?基因芯片 ?核酸杂交 ?洗涤 ?检 工 、DNA 阵列点印 、芯片后处理及芯片质量检测 测信息 ?数据处理 ?综合信息处理 等过程 。其应用包括制作工艺过程和基因表达分 基因芯片检测的基本原理和传统的核酸印迹 析过程 。杂交方法基本相似 。与传统印迹杂交相比 ,基因 2 . 1 目的 DNA 的选择芯片技术绝不仅仅是改变了载体和检测步骤 ; 其 作为基因分析 ,DNA 片断是最基本的材料 , 本质改变在于基因芯片是将大量按靶基因的特点 也是基因芯片制作的关键 。对于大规模地研究基 及按检测要求预先设计的探针固化在支持物表 因表达问题 ,需要分析每一个基因的表达 。因而 , 面 ,一次杂交可检测样品中多种靶基因相关信息 , 选择目的 DNA 必须能代表要研究的各个基因 。 使基因芯片技术具有了高通量 、多参数同分析 ,快 对于 整 个 基 因 组 序 列 全 部 已 知 的 生 物 , 最 直 速全自动分析 ,高精密度 、高灵敏度分析等显著的 接 的方法是用 PCR扩增基因组中每个已知的或特点 。 收稿日期 :2004 - 06 - 07 () 作者简介 :包文奇 1963 - ,男 ,河南扶沟人 ,讲师 ,本科 ,主要从事微生物教学与科研工作 。 预测的开放阅读框架 ,亦可以选择自己感兴趣的 DNA 芯 成 。日本 佳 能 公 司 开 发 出 成 本 很 低 的 部分基因 。对于没有序列 ,或只有部分序列的基 片 。1998 年 6 月美国正式宣布启动“生物芯片计 因组 ,或含有大量内含子的基因组 ,上述方法则不 划”,英 、德 、加 、俄 、意 、日等地也相继开始加大投 行 , 在 这 种 情 况 下 , 考 虑 采 用 表 达 序 列 标 记 入 。2000 年法国里昂水务公司和梅里厄研究所 ( ) ES T。可以将单个 ES T 的 cDNA 克隆用作阵 成功地研制出自来水检测用 DNA 芯片 。目前 , Aff ymet rix 公司检测逆转录酶基因的 H IV 芯片 , 列 DNA 的来源 。阵列 DNA 的长度最好小于开 放阅读框架 , 或小于 1 000bp 的 cDNA 。当基 因 P53 基因突变检测基因芯片 ,恶性淋巴瘤基因表 之间的同源性很高的时候 ,最好选择基因之间的 达芯 片 、结 核 杆 菌 基 因 芯 片 已 面 市 。美 国 L u2 差异部分 ,以提高基因之间的分辨度 。 minex 公司发展的 SN P 技术 ,只需要 15 个循环 , 一次实验便能检测出 H IV 、HCV 和 HSV 。 2 . 2 原位合成法 寡核苷酸的原位合成技术是由 Aff ymet rix 公 我国从 1998 年开始 DNA 芯片的研究 ,目前 已 有 数 十 家 大 学 和 科 研 机 构 开 展 这 方 面 研 究 。 司开发的 ,它是利用固相化学 、光敏保护基 、及光 2004 年 4 月我国第 1 块应用型 DNA 芯片在第一 刻技术得到位置确定 、高度多样性的化合物集合 。 光敏保护基用于保护碱基单位的 5 羟基 ; 合成的 军医大学正式诞生 ,同时陕西超群科技股份有限 第 1 步是利用光照射使固体表面上的羟基脱保 公司报道其研制 SP GC - 200 型肝炎基因诊断芯 护 ,然而固体表面与光敏保护基保护 、亚磷酰氨活 片获得生产批号 。陕西科林基因工程高科技有限 化的碱基单体接触 ,合成只在那些脱去保护基的 公司研制成功早期预警白血病芯片 。南开大学和 地方发生 。光照的区域就是要合成的区域 ,该过 南开基因工程有限公司研制出“乙肝病毒诊断芯 程通过一系列的掩盖物来控制 。玻璃片上进行 片”,该技术在世界上处于领先水帄 。总之 ,国内 的基因诊断芯片研制开发的速度较快 、种类也较 32 步化学反应 , 就能得到所有 65 536 个不同的 2 8 nt寡核苷酸 ,可使每 1 cm上的探针数量达 106 多 。 μ个 。探针的间距约为 20 m ,其最大优点是在一 3 . 2 基因芯片的发展趋势 虽然基因芯片技术已个较小的区域可以制造大量不同的探针 。 取得了很大进展 ,但是 2 . 3 合成后点样法 寡核苷酸芯片的制作主要利真正用于实际临床 ,还存在很多问题 ,如技术成本 用共价键连接 , 昂贵 、复杂 、检测灵敏度低 、重复性差等问题 。今 有以下几种方法 : 硅烷化寡核苷酸直接点样于玻 后基因芯片技术的发展着重解决这些问题 ,同时 片上制成寡核苷酸微阵列 ; 硫代寡核苷酸通过二 具有以下几个发展趋势 。其一 ,由于光脱博爱户 硫键与巯基修饰的玻片连接 ; 氨基修饰的玻片与 原位合成法已被专利保护 ,大力发展如分子印章 5 末端带氨基的寡核苷酸探针通过共价键 的 连等技术新型 DNA 阵列原位合成法 。其二 , 将高 丙烯酰胺修饰 ;丙烯酰胺硅烷化的基片与 5 - 密度芯 片 制 备 技 术 与 DNA 片 段 连 接 反 应 相 结 接 的寡核苷酸连接 。合 ,制 备 大 片 段 DNA 高 密 度 芯 片 。其 三 , 利 用 M EM S 技术研制高效集成性毛细血管阵列芯片 3 基因芯片技术的发展概况 以及相应的微流体系统 ,实现生物芯片的智能化 和自动化 。 3 . 1 国内外发展概况 早在 20 世纪 80 年代 ,Bains W 等人就将短 4 基因芯片在预防兽医学上的应用 的 DNA 片段固定在支持介质上 , 借助杂交方式 4 . 1 基因诊断 进行 序 列 测 定 。1991 年 美 国 Aff ymet rix 公 司 Step hen P A Foldo r 博 士 提 出 基 因 芯 片 概 念 。基因诊断是基因芯片最主要的应用之一 。从 1996 年 ,该公司研制了世界上第一块 DNA 芯片 , 患病动物基因组中分离出 DNA ,与基因芯片杂交 并在此基础上不断改进和完善 。美国的 Illumina 得出病变图谱 ; 与正常图 谱 比 较 分 析 , 获 得 病 变 和 Nanogen 公司也在试图开发低成本的 DNA 芯 DNA 信息 ,知道 DNA 突变部位和序列 ,从而做出 正确诊断 。可以检测肿瘤病 、遗传病 、传染病等 。片生产方法 , Nanogen 公司的微电子芯片也将完 1 1 2 王胜利,李进德,刘冠江 ()1 南阳农业学校 ,河南 南阳 473003 ;2 河南省农业科学院 中图分类号 : S858 . 23文献标识码 :A() 文章编号 :1004 - 3268 200410 - 0080 - 02 饲养业的发展 。 奶牛梨形虫病又称焦虫病 、血孢子虫病 ,是梨 形虫通过蜱的叮咬而传播的一种血液原虫病 。临 1 材料与方法 床表现以发热 、贫血 、黄疸 、尿色深 、淋巴结肿大等 为特征 。近几年 ,南阳市大力发展奶牛饲养业 ,随 1 . 1 供试药物 着奶牛饲养密度的增加和市场交易的频繁 ,梨形 贝尼尔 ,兰州整丰制药有限责任公司生产 ;黄 虫病的流行范围扩大 ,发病率 、致死率呈逐年上升 色素 , 河南商丘华康兽药有限公司生产 ; 咪唑苯 趋势 。2001 年 , 在南阳市梨形虫病高发区普查 , 脲 ,中国军需大学制药厂生产 ;牛环形泰勒虫裂殖其感染率最高时达 93 . 6 % ,其中环形泰勒虫感染 体胶冻细胞苗 ,宁夏畜牧兽医研究所生产 ;驱焦散 占 59 . 4 % ,双芽巴贝斯虫感染占 27 . 7 % ,牛巴贝 中药方剂为自制 。 斯虫感染占 6 . 6 % ,环形泰勒虫与双芽巴贝斯虫 驱焦散处方 :常山 100 g、青蒿 120 g、草果 100 g、 和环形泰勒虫与牛巴贝斯虫混合感染占 6 . 3 % 。 槟榔 60 g、乌梅 60 g、厚朴 60 g、青皮 100 g、陈皮 60 梨形虫病已成为威胁奶牛生产和安全最严重的疾 g、柴胡 100 g、黄芩 100 g、川羌活 60 g、建曲 100 g、甘 病 ,严重影响养殖户饲养奶牛的积极性 ,制约奶牛 草 60 g、生姜 120 g、大枣 30 枚作引 。 收稿日期 :2004 - 07 - 06 () 作者简介 :王胜利 1956 - ,男 ,河南内乡人 ,高级讲师 ,本科 ,主要从事人畜共患病及免疫学研究 。 3 Rogers Y H , Ping JB , Huang I J ,et al . Immobilizatio n 4 . 2 基因防治 of oligo nucletides o nto a glass support via disulfide 针对病变基因序列设计基因 药 物 或 核 酸 疫 bo nd : a met hod for p reparatio n of DNA microarray 苗 ,改变靶序列以及表达 ,达到防治的目的 。对目 () J . Anal Biochem ,1999 ,266 1:23 - 30 . 前难以防治的肿瘤病 、烈性传染病如口蹄疫 、马立 4 Pease AC , Solas D , Sullivan EJ ,et al . Light genented 克病等的防制有根本性的改变 。Behr 等研究了 olgo nucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis ( ) 结核杆菌有毒株 H37 Rv、牛型结核杆菌有毒株 J . Proc Nate Sci U SA ,1994 ,91 :5022 - 5026 . ( 5 邹宗亮 ,王升启 ,王志清. 基因芯片制备方法研究进 ) 和牛型结核杆菌减毒活疫苗 卡介苗 BC G基因 () 展 J . 生物技术通报 ,2000 1:7 - 10 .组之间的差异 ,制作了 H37 Rv 株基因所有开放阅 6 Mc Gall G ,L abadie J ,Brock P ,et al . Light - directed 读框架的 DNA 芯片 ,进行帄行的比较基因杂交 。 synt hesis of high - density oligo nucleotide arrays using 结果显示 ,牛型结核杆菌有毒株相对于 H37 Rv 有 semico nductor p hotorsist s J . Proc Natl Sci U SA , 11 个基因片段的缺失 ,而卡介苗相对于牛型结核 1996 ,93 :13555 - 13560 . 杆菌有毒株有 5 个基因片段的缺失 。这对于研制 7 金晓明 ,李双官 . 基因芯片技术研究状况及展望 J .新疫苗有理论指导意义 。 () 福建医学杂志 ,2002 ,24 2:103 - 105 . 8 Wat so n SJ , Akil H. Gene chip s and array revealed : a 参考文献 : p rimer o n t heir power and t heir uses J . Biol p sychia2 1 Wilgenbus KK , Licher P. DNA chip s technology ante () t ry ,1999 ,45 5:533 - 543 . port s J . J Mol Med ,1999 ,77 :761 - 768 . 田村见 . 基因芯片在生物制药和预防兽医学研究中 9 De Benedet ti VM . DNA chip s : t he f ut ure of bio mar k2 ( ) 2 的应用 J . 广东畜牧兽医科学杂志 ,2001 ,26 1: 16 () ers J . Int J Biol Mar kers ,2000 ,15 1:1 - 9 . - 18 .