四吡咯二硫代氨基甲酸酯对百草枯致大鼠肺损伤的干预研究

四吡咯二硫代氨基甲酸酯对百草枯致大鼠肺损伤的干预研究 复旦大学 硕士学位论文四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯对百草枯致大鼠肺损伤的干预研究 姓名:邵春风 申请学位级别:硕士 专业:劳动卫生与环境卫生学 指导教师:周志俊 20070510复旦大学,,,,级硕士学位论文 结略语表 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。 作者签名:二陋日期:丕坐掣 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留送交沦文的复印件，允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部或部分，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 …各弛…誊静嗍 坦,宣纽三日复旦大学,,,,级硬士学位论文 中文摘要 四氢毗咯二硫代氨基甲酸酯对百草枯致大鼠肺损伤的干预研究 中文摘要 百草枯(,,,,？,,,，,,)是一种高效非选择性有机杂环类脱叶剂及除草剂，因其起效快，在农作物中无残留，因而目前在世界上广泛应用于农业生产。大量研究表明，百草枯可经胃肠道、皮肤和呼吸道等多种途径进入人体，对机体各个器官特别是肺脏造成出血、水肿、阃质纤维化等不可逆损伤，甚至死亡。百草枯中毒的毒性机制仍不明确，未能找到百草枯中毒特效解毒剂。以往的研究中，发现转化生长因子?,,(,,,?,,)，基质金属蛋白酶(,,,,)及其组织抑制物(,，,,,)在肿瘤及纤维化发生进展过程中可能起重要调控作用。本研究采用整体动物模型，运用分子生物学技术研究百草枯致肺纤维化的可能作用机制，集中探讨氧化损伤，,,,(,,，,,,,,，,，,,(,在百草枯毒性中的作用;并探究四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯(,,,,)对百草枯所致纤维化的干预和潜在的治疗作用:为寻找并确立百草枯中毒的肺损伤治疗提供理论依据。 本研究中，血浆和支气管一肺泡灌洗液(,,,,,)中谷胱甘肽过氧化物酶(,,,,,,)，超氧化物歧化酶(,,,)活力，丙二醛(,,,)含量，肺组织匀浆中羟辅氨酸(,,,)含量采用试剂盒检测。采用,,,,,,法检测,,,(,,, ,,,,表达，,,,(,,蛋白采用,,, ,,,(,, ,,,检测;运用实时定量荧光,,,法检测,，,(,，,，,,,,的,,,,表达。 研究表明，,,,,,,, ,,染毒后，,,大鼠血浆和,,,,中,,,含量增加，,,,,,,、,,,活力减弱，肺组织中,,,含量升高俨,,(,,);给予,,, ,,,,, ,,,,干预以后，使,,,,,,与,,,活力升高，,,,含量减少(,,,(,,或,,,(,,)，干预组肺组织,,,比,,染毒组含量有所降低。,,,,,,, ,,染毒后，造成大鼠肺组织中,,,,，,，,,,,、血浆,,,(,,蛋白表达升高(,,,(,,);与,,染毒组相比，,,,,干预组大鼠肺组织？,,,,(,,,,,,、血浆,,,(,,,蛋白的表达降低?,(,,或,,,(,,)。同时，,,,,也在一定程度上对抗”,”,,染毒造成的,，,,,(,，,，,,(, ,,,,表达的上升(尸,,(,,或,,,(,,)? 另外，实验过程中单纯染毒组出现明显的肺损伤，病理特征为早期的肺出血、水肿、单核细胞浸润及炎症反应表现，晚期表现为成纤维细胞增值、胶原纤维聚集，电镜发现，，型肺泡上皮细胞明显水肿，线粒体肿胀、变形，成纤维细胞内粗面内质网、核糖体丰富等。,,,,干预组动物肺脏也有充血、肿胀、出血等病理改复旦大学,,,,级硕士学位论文 中文摘要 变，但程度较,,组轻微、质地较软，镜检炎性细胞少，局部水肿轻微，成纤维细胞内胞浆较少，无细胞固缩现象。 综上所述，本研究条件下，,,, ,,,,, ,,,,干预使,,,,,,, ,,染毒大鼠体内,,,,,)【与,,,活力升高，?,及,,,含量减少;降低,,,,,,,, ,,染毒大鼠肺组织,,,(,,, ,,,,的表达，下调了血浆,,,,—,,蛋白的表达，减少了肺组织，,，，,，,?,，,，，,，,,, ,,,,的表达;可在一定程度上减轻,,,,,,, ,,染毒引起的肺损伤，其作用机制及对,,致肺纤维化的干预作用仍有待进一步研究。 关键词:百草枯肺损伤四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶组织抑制物转化生长因子,,, ,复旦大学,,,,级硕士学位论文 英文摘要，,,,,,,;, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,,,,,,(,,,,),, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,;,, ,, ,,,,？,,, ,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,？,,,(,,,,,,,,,。),, , ,,,,,,,,;,,,, ;,,,,;, ,,,,,;,,,，,,,;, ,, ,,,, ,,,,,?,,,,,, ,,, ,,, ,,,, ,,,,;,,,;, ,,, ;,,,,,,,,,,,; ,,,, ,,,,,,,, ,,,,;,,,,, ,, ,,, ;,,,,(，,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,, ,, ,,,,,, ,,,,; ,, ,,,,,,,,,,,,，,,,,;,,,,, ,, ,,,,,,,，;,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;, ,, ,,,,,,,,,,，,,,,,,,, ,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,，,, ,,,,,,,,,(,,,, ;,,,,;, ,, ,,,,,,,,,,(,,,,,,,，,,, ,,,;, ,,;,,,,,, ,, ,,, ,,,,;,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,;,,,, ,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,;,,,,,;,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,(,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,,(,,,,,,,)，,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,’,)，,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,，,,,),,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,(,,,,,,,,,，,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,—,,，,,,,,(,,, ,，,,—, ,,, ,,, ,, ,,,,, ,, ,,,,？,,,,,,,,;,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,, ,, ,,,, ,,,;,,,; ,,,;,,,(,,,,,,,,，,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,;,,, 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,,,,,, ,,, ,,, ,, ,,, ,,,, ，,;,,,,,, ,,,,,(,,, ,,,,,),,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,(,,,(,, ,, ,,,(,,，,,, ,,, ,,,，,,, ,,,,,, ,,, ,复旦大学,,,,级磺士学位论文 英文摘要,,,,, ;,,,,,,,,,,,,,,(,,, ,,,,,, ,, ,,,,～,, ,,, ,,,—,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,(,,,(,, ,, ,,,(,,)，,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,, ,,(,(,, ,, ,,,(,,)(,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,，,，,,?, ,,,, ,,,,;,, ,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,;,,;,(,,,(,, ,,，?,(,,)( ，, ,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,,;,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,;,,;,,,,,, ,,;, ,, ,,,,,,,, ,,,,,，,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ;,,, ,,,,,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,,,, ,, ,, ，， ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,,，,,,,,,,，,,,,,,,, ,,,,;,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,; ,,,,;,,,,(,,,),,, ,,;, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,?,,,,,,,, ,,,,,;,,,,,,;,,,;,,,(,,,,,,, ;,,,,,, ,,;, ,, ,,,,,,,,,,，,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,;,,,, ,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,，,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,, 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百草枯(,,,,？,,,，,,)，又名克芜踪(,,,,,,,,,)、对草快，化学名称是,，,,二甲基(,，,(,联吡啶阳离子盐(,，,’,,,,,,,,,,,，,’,,,,,,,,,,,,,)，是一种非选择性有机杂环类速效触杀型脱叶剂及除草剂，由于其起效快，在农作物中无残留，因而,,,,年开始作为农药及植物生长调节剂在世界范围内广泛应用于农业生产【,】。,,,,年英国医学家,,,,,,,,,首先描述了,例百草枯意外中毒死亡事件〔,,，随后，世界各地相继报道百草枯中毒病例并对百草枯毒性进行了深入的研究。大量研究表明，百草枯可经胃肠道、皮肤和呼吸道吸收，其中人类中毒主要通过消化道吸收，药物可随血流分布到各个脏器，对胃、肠、肺、肾脏、心脏、肝脏造成损害;特别是，百草枯可特异性聚集于肺脏而造成肺出血、肺水肿、肺间质纤维化等不可逆损伤【,, ,,。虽然各国学者对此做了广泛深入的研究，但至今为止，各国学者仍未寻找到百草枯中毒特效解毒剂，因而百草枯中毒病死率极高。据报道，百草枯中毒病人总病死率为,,,,,,，口服,,,百草枯浓缩液病死率更高达,,,,,(,,瓯,,。 百草枯在我国也有着广泛的应用，自,,,,年湖北某公司采用中温钠法首先生产 以来，百草枯农药在国内的生产规模迅速扩大，国内年使用原药(,,,,)量达,,,,吨左右，且逐年增高:随着百草枯在我国生产和使用量的增加，急性百草枯中毒人数有增多的趋势。以百草枯为关键字，检索得近年国内相关医学杂志报道百草枯中毒案例达,,,,余例，病死率达,,(,,;且有关文章数逐年增加，其中,,,,年为,,篇，,,,,年,,篇，,,,,年,,篇。我国是农业大国，在目前经济技术条件下，农业生产仍需要使用百草枯。基于世界粮农组织的推荐，我国政府要求在百草枯农药中加入催吐剂，以减少中毒时的吸收量。尽管如此，中毒事匀痪痈卟幌隆,虼耍芯堪俨菘葜路嗡鹕耍乇鹗欠蜗宋撇?窖捌涓稍な侄尉哂谢睦砺垡庖搴椭卮蟮氖导庖濉?,,诱导组织损伤的生化机制尚不完全清楚，有研究表明，百草枯的毒性与其氧化还原特性有关。因百草枯进入机体后，首先被还原性辅酶,, ,？,,,哟转化为,,，，而还原性辅酶，，州,,,,,则转变为辅酶，，(,,,,,:此后，,,，再与氧作用产生超氧离子(,,)，同时本身回复阳离子态，,,再在超氧化物歧化酶(,,,)的作用下，转变为过氧化氢(,,,,)【,,。,,,,半衰期长，容易透过细胞膜，并且在由铁催化的芬顿反应中，可迅速形成,,，同时,,，与,,,,在铁存在的情况下亦可作用产生。,,，引起脂质过氧化等一系列连锁反应，生成更多的自由基，在细胞内或细胞 ,复旦大学,,,,级硕士学位论文之间引起氧化性损伤，,,,,,耗竭等,,,,，在中毒早期造成肺出血，水肿等炎性表现，,，,】，中毒晚期,,,,,天出现不可逆肺纤维化，并多死于肺功能衰竭【,,(,,】。 转化生长因子,(,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,;,,,，,,,(?是一种细胞外基质沉积促进剂，它可以刺激各种细胞外基质成分的合成和沉积，包括上调基质成分的转录、翻译和翻译后步骤，促进基质蛋白和受体的产生，减少基质降解酶以及增加降解抑制剂的合成。同时它还是一个强大的细胞增殖调节剂，通过血小板衍生生长因子促进肺成纤维细胞增殖。,,,(,在增加细胞外基质产生的同时，还可抑制蛋白水解酶的产生，使细胞外基质沉积进一步增加。,,等人研究发现，,,,(,,在博来霉素引起的肺纤维化大鼠中表达升高，并在第,天达到高掣”,，,,,,通过实验证实,,,(,在百草枯和高压氧环境所诱导的肺纤维化模型中表达明显增强，,”;而,,,(,,表达下调或缺陷的小鼠用石棉粉尘药物诱导的肺纤维化程度明显减轻【,,,，因而阻断或抑制,,,(,的表达可能会干预肺纤维化的进程，如,,,,等的研究表明用,,,(,抗体或抗血清可以明显降低羟脯氨酸水平和脯氨酰羟化酶的活性明显，减轻博来霉素诱发的仓鼠肺纤维化【,,( 肺间质纤维化是一种病因和发病机制尚不清楚的肺部疾病，早期病理改变为肺出血、水肿等炎性损伤，晚期为纤维化的形成。多数学者认为肺间质纤维化是细胞外基质(,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,，,,,)合成和降解不平衡的结果。基质金属蛋白酶(,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,)是一种主要的参与细胞外基质蛋白，如胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖和弹性蛋白等合成、降解过程的一大类酶。近年来研究表明,,,,及其特异的组织抑制物(,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,，,,,)在肺损伤与修复以及肺间质纤维化形成过程中起着重要的调节作用。,,,,,,,,,发现，博莱霉素诱导的鼠肺纤维化模型中,,,,,和,,,(,,表达上调，,,,(,、, ,,,,和，,佃(,,无上调表现，而,，,,,，表达明显上调【旧。卢韶华等对博莱霉素诱导大鼠实验性肺纤维化的研究发现，肺泡上皮不单是致纤维化因素的损伤对象，其损伤后活跃增生的肺泡?型上皮细胞可以通过释放,,,(,,,，催化,,,(,，从而引起和(或)加重肺基膜的损伤【嘲。章巍等的研究表明，,,,,,、,,,(,、,,，(,,,及其组织抑制物,，,,,，、,，,,(,在博来霉素引起的大鼠肺纤维化过程中起了重要的调节作用〔,,,。 四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯(,,,,,,,,,,, ,,,,,,;,,,,,,,,,，,,,,)是二硫代氨基甲酯(,,,,,,;,,,,,,,,)的吡咯衍生物，是一种已知的抗氧化剂，可对抗炎症的发生、发展过程，降低细胞损伤程度。赵建等采用小鼠动态吸入全氟异丁烯 ,复旦大学,,,,级硕士学位论文 前言(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,。,,，,)全身暴露染毒装置对实验小鼠进行染毒，观察四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯(,,,,)对拙,，,,，鼠吸入性急性肺损伤(,;,,, ,,,, ,,,,,,，,,)的防治效果，结果发现,,,,对小鼠,,，,吸入性肺损伤具有预防作用，并进一步探求其机理可能缘于,,,,对,,(?;,的抑制作用，进而抑制炎症细胞因子?，,,、，,(,等的过度表达，从而抑制了过度炎症的进一步发展〔,,，,,】。 我们借助整体动物模型，运用分子生物学等技术研究联吡啶类化学物百草枯致肺脏纤维化的可能作用机制，集中探讨氧化损伤，细胞因子,,,(,,、,,,,，,，,,,在百草枯毒性中的作用，进一步阐明百草枯染毒致肺纤维化反应早期的分子机理;并探讨四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯(,,,,)对百草枯所致纤维化的干预和潜在的治疗作用;为寻找并确立百草枯中毒的肺损伤治疗提供理论依据，为相关部门立法，提供准确、重要的科学证据。 ,复旦大学,,,,级硬士学位论文 材科与方法,(材料与方法,(,材料,(,(,动物 健康雄性,,,,,,,,,,,,,,(,,)大鼠,,只，体重,,,,,,,,，由复旦大学实验动物中心提供，实验前适应性饲养,,，动物可自由活动、饮水和进食。,(,(,主要试剂、药品 受试物,,,百草枯浓缩液(余为催吐剂、臭味剂、染色剂及无活性杂质，由上海兴农化学品公司馈赠);,,,,(购自美国,,,,,公司);超氧化物歧化酶(,,,)、谷胱甘肽过氧化物酶(,,,—,,)、丙二醛(,,,)、羟辅氨酸(,,,)检测试剂盒购自南京建成生物研究所(批号:,,,,,,,,)。,,, ,,,?,, ,,,(,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,:,,,,,,,,)，,,,,, ,,,,,,,(，,,,,,,,,,公司)，,,,,, ,,,(,,,,,,,,,公司)，琼脂糖(深圳精美生物公司)，,,,, ,,, ,,,,,,(,，,,,,,公司)，,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,;,,, ,,,,,,,,, ,,邪,,,,,,,,公司)，,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,, ,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,)，引物由上海,,,,,,公司合成。 病理组织常规试剂如,,,中性福尔马林、梯度酒精(,,,，,,,，,,,,)、二甲苯、苏木素、,,盐酸酒精、中性树胶等均为纯试剂，由复旦大学劳动卫生教研室提供。 制备电镜切片常规试剂如,,戊二醛、,,四氧化饿、丙酮(,,,,,,，,，,,‰,,,, ,,,)，,,,,,,,，醋酸铀、构椽酸铅等均为分析纯试剂，由复旦大学上海医学院电子显微镜中心实验室提供。 ,,,,,, 三色染色法试剂如丽春红、酸性品红，冰醋酸、苯胺蓝、亮绿等试剂均为分析纯试剂，由复旦大学中山医院心血管研究所病理科电子显微镜中心实验室提供。,(,(,主要仪器与设备 离心机(,,, ,,，,,, ，,,,,,,,,,,,, ,,,) 低速大容量离心机(,?(?，上海安亭科学仪器厂) 可见分光光度计(,,，,, ,,,,，,,,,, ，,;) 紫外分光光度计(,,,,,,,;,,,,,,，,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ，,;) ,复旦大学,，,,,级磺士学位论文 材料与方法 电热恒温水箱(;, ,,,型，上海益恒实验仪器有限公司) 微量旋涡器(,—,，上海精科实业有限公司) 微量移液器(,,,,,山,,,,,，,,,,,，,,,,，,，,,，, ,,,;,(,山，,,,,,,,,,,,) 自动消毒器(,,,,,。,,,,,, ，,,,,,,,,, ,,(,,,) 电子天平(,,,,,,,。,,,,,,, ,,,,,,) 光学显微镜(,,,,,,。,,,,,,,) 透射电镜(,,,,,，,,,,,, ,,, ,,,,,,，,,,,) 制冰机(,, ,,，,,,,,,,, ，;, ,,,,,,,) 机械匀浆机(,,, ,，上海地理模型厂) 低温离心机(,,;,,,,, ,,，正;) 超低温冰箱(,,,,, ,,,,,,,—,,,,,，,,,,,, ,,,;,,,, ,,,,,,,,,,,) ,,,仪(,,,,,,。,,,,,,, ,,,,,,,,,,) ,,， ,,,,, ,,,,,,(,,,,，,,,,,,, ,,,,,,,,,,) 微型电泳槽(,,,,,,,，,,,,,,;,, ,,,,,;,四 全自动凝胶成像仪(,,, ,,; ,,,,，,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ，,;) 所用手术器材均经高压消毒处理，采血用注射器及试管均在实验前用,,,,,,肝素预处理过，所有操作均在无菌条件下进行。,(,方法,(,(,动物分组及给药 参考预实验结果，共分为,组，每组,只大鼠。其中,组为,,单纯染毒组，每只大鼠经口一次性灌胃,, ,,,,,,,:另,组为,,,,干预组，大鼠用同样剂量,,染毒后立即腹腔注射,,,, ,,, ,,，,;,一次;余,组为对照组，灌胃等体积的生理盐水。,(,(,标本采集,(,(,(,血标本采集及处理 ,复旦大学,,,,级硕士学位论文 材料与方法 分别在染毒后第,、,、,,、,,天取,组,,单纯染毒组动物，,组,,,,干预组动物和对照组,,,只动物。腹部皮肤常规酒精消毒，动物经,,,水合氯醛(,(,,,,,,,,)麻醉后打开腹腔，从腹主动脉采集血样,,,;血样置于抗凝管(,,,,,,,肝素)中，并以,,,,,,,,,离心,,,,,,，取上清，分装保存(,管,”,保存，,管(,,”,保存)。用于测定大鼠血中超氧化物歧化酶(,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,，,,,)、谷胱甘肽过氧化物酶(,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,—， ,)活性及丙二醛(,,,,,; ,,,,,,,,,,，,,,)，转化生长因子(,,,(,,,—,,)含量。,(,(,(,支气管肺泡灌洗液 每次取完血样本后，无菌条件下立即剪开胸壁，充分暴露两侧肺脏，切开气管，插入长,,,,(直径约,,,，内经约,(,,,,)细塑料管，手术线加以周定，消毒血管钳结扎左肺，用,,,生理盐水反复灌洗右肺,次，最后约得到,,,支气管一肺泡灌洗液,,,,,):将获得的,,,,以,,,,,,,,,离心,, ,,,，取,,,,上清液，用于测定,,,，,,,,,,，,,,等。,(,(,(,肺组织病理标 本采集 待,,,,灌洗完毕后，剪下整个肺脏，矢状面切取左肺组织置入盛有,,,福尔马林的瓶中固定，以备组织学光镜检查。随机选定各组中大鼠各,只，迅速取左下膈面肺组织，用剃须刀片切成约,×,×,(埘恤)大小,,,块，置入盛有,,戊二醛小瓶中，封盖后以,,,注射器抽吸瓶内空气至肺组织沉入底部，及时送至电镜室行组织超微结构检查。右肺组织用,,,,,,,,,,自封袋分装并立即放入液氮中并转到一,,”,冰箱中冻存，留作提取,,,，测定羟辅氨酸(,,,,,,,,,,,,,,，,,,’)等。,(,(,检测指标和方法,(,(,(, ,,,，,,,?,,，,,,及,,, 测定大鼠血、,,,,中,,,、,,,,,,、,,,指标，取,,,,,右肺标本测定,,,,,,,,,湿重)，实验按照试剂盒提供的方法进行检测。为减少标本存放时间过长或不一致，影响实验结果的可靠性，每次标本的酶学测定均在取样当日成批检测以减少操作误差。,(,(,(,血浆,,,—,,蛋白含量测定 ,,复旦大学,,,,级硕士学位论文 材料与方法 于(,,”,冰箱中取出冻存血浆，,”,缓融，采用酶联免疫吸附检测法(,,，,,)，具体操作步骤按,,,,,,公司试剂盒提供方法进行。,(,(,(,肺组织鼢蚺抽提 将肺组织从超低温冰箱取出后称取,,,,,,，剪成碎片，移入匀浆器中;加,,,,,,,,,(,,,,,,,,,组织)，冰上匀浆后，移入,(,,, ,,管中，,,,,,,，,”,离心,,,,,;上清液移至,,管中，加入,(,,,氯仿，用力振荡,,,,;，室温放置,,,,后,,,,,,，,”,离心,,,,,;取上清移至另一离心管，加,(,,,异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置,,,,,，,,,,,,，,”,,离心,,,,,。弃上清，用,(,,, ,,,乙醇洗涤，漩涡混匀，,,,,,，,,,离心,,,,;弃上清，晾干，加入,,,,无,,,酶的水，,,”,溶解,,,,,。取,山,,倍稀释，紫外分光光度法测定,,,纯度和含量。余,,,?冰箱中冻存。,(,(,(,逆转录(,,,,,,, ，,,,,;,,,,,,,，,,) 使用,;,,;,,,,公司,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ;,,,合成试剂盒将,,,模板逆转录成;,,,。取,,(, ,,,，加,?,,,,,(,,),,引物，加水至,,,,,，混匀，,,”,,孵育,,,,;取出立即冰浴，加,山,×,,,,,,，,山,,,,,抑制剂，,一,,,,，混匀离心，,,”,孵育,,,,,;加,,(,,, ,;,,,,,,,,,,,,,,,逆转录酶，使终体积为,,山，,,?孵育,,,,,，,,?,,,,,终止反应。,(,(,(,多聚酶链式反应(,;,) 引物通过文献查阅所得【,,】，引物均由上海生工生物有限公司合成，具体如下表所示: 表,(,(基因及其引物 每个标本各取,山;,,,，用,,,,;,,,,公司的,,,试剂盒对目标基因,,,,,,和内参标基因,,,;,,,进行多聚酶链反应，反应体系如下表所示:复旦大学,,,,级硕士学位论文—— 塾壁与方法模板,,,,,,,,,,,, ,(,,, ,,,,,,,,引物, ,,,,,,,,, ,(,,, ,(,,(,,,,,引物, ,,,,,,, ,(,,,, ,(,,(,,,,,,,,,,,,,, ,× ,,(,,, ,,,,,,,——, ,,(,,,,—,篁堡墼 , 垄些～ ,,,,反匝条件: ,,,,变性,,,,, , ,,。(, ,,,，,,”, ,,,，,,,(, ,,,，,,个循环(,,,,,,,,) ,,,, ,,,，,,,, ,,,，,,。, ,,,，,,个循环(,,,,,,,) , ,,”,延伸,,,,,, , 取,山,,,产物于含,(, ,,,,,,溴乙啶的,(,,琼脂糖凝胶中电泳，,,,, ,,, ,,,,,,作为,,,,,,标记,,,分子量，在,,, ,电压条件下电泳,,,,, ,,,，电泳结 束后，将凝胶放入凝胶成像分析系统中，用,,,,,,,, ,,,,,(,,,,,,,,,,)图像分析软 件分析,,;,,,和,,,(,,的光密度值，岍,;,,,为内参照，计算,,,,〔,,基因相对表 达丰度，公式为: 目的基因相对表达丰度,目的基因光密度值，内参基因光密度值。 ,(,(,(,实时荧光定量多聚酶链式反应 从,,,,,,,查获目标基因,,咿(,，,，，,，,(,和内参标基因肚，;,(,的,,,,序列应 用,,’,,,自, ,(,软件设计各基因引物(表,(,)，充分分析引物的发夹结构、引物间配 对、引物自身配对、稳定性及错配等情况，根据综合评定结果选用最佳上下游引 物，并应用,,,,,引擎对设计的每条引物进行特异性分析，确保每条引物与基因 库大鼠己知的其他基因无同源性。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。 ,,复旦大学,,,,级磺士学位论文 材.