间接ELISA测定抗体的效价

间接ELISA测定抗体的效价 【目的】 测定样品中抗体的效价(Titer) 【基本原理】 将特异性抗原包被在固相载体上，加入含待测抗体的样品，使之与固相抗原结合(Ag-Ab)，再加入酶标记的抗抗体(亦称二抗)，与上述Ag-Ab复合物结合形成Ag-Ab-α-Ab-E复合物。此时加入底物，复合物上的酶则催化底物而显色，以酶与底物的显色反应程度来确定待测抗体的效价。由于每步之间均有冲洗步骤，因此若样品中不含相应的抗体，酶标抗体则将被洗掉，底物不显色而呈阴性反应。 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的。 1.包被 固相载体常用聚苯乙烯微孔板，因为聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。吸附主要为物理吸附，不发生化学反应，效果与缓冲液的浓度、pH、温育时间，载体面性质等有关。缓冲液宜偏碱性，离子强度较低，有利于蛋白质的吸附。 2.封闭 由于血清中含有高浓度的非特异性抗体，因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质(例如牛血清蛋白)再包被一次，以封闭固相上的空余间隙。可用含1,BSA、1,明胶3,5,脱脂奶粉封闭。酶标抗体可以用含BSA的PBS稀释，以减少非特异性吸附。 3.温育 温育最好用水浴，室温也可，微孔板浮在水浴面可使温度迅速平衡。且板上应加盖，避免蒸发。应用酶促反应动力学原理，低温可提高结合率，高温可加速反应。 4.待测样品 待测样品溶液中需不存在与标记酶相同的酶、底物、酶抵制剂和其它干扰因素，以防止干扰作用。在检测过程中样本须先行稀释到适当浓度(1:40~1:200)，以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 5.洗涤 洗涤实验操作过程中决定实验成败的一个关键步骤。目的是除去未结合的免疫反应物，终止抗原抗体的继续结合，除去标本中与反应无关的成分和游离的酶结合物以及反应过程中吸附在固相载体上的非特异性干扰物。洗涤次数一般为3,4次，每次3分钟,要微微震荡，特别是最后一次，如有酶结合物的非特异吸附及残留，会使空白值升高，所以要使洗涤彻底。 6.显色 一些底物如TMB和OPD在暗处稳定，底物液要现用现配，酶促反应时注意避光。某些含苯环的底物有致癌作用，使用要多加小心。 最常用的是辣根过氧化物酶(HRP)，高纯度的HRP，其RZ(纯度值)应?3.0，(RZ是HRP在403nm和275nm下的吸光值的比值)，此外比活力应,250U/mg 。HRP的作用底物是HO，22催化反应为: HRP DH2+H2O2———?D+2H2O DH2为供氢体(常用四甲基联苯胺，TMB)，HO为受氢体。 22 【试剂与器材】 1(实验材料 ?待测抗体溶液(免疫后的血清) ?阳性样品(阳性血清) ?阴性样品(阴性血清) 2(试剂 ?抗原: OVA-Ag的偶联物。 ?包被液(0.05 mol/L碳酸盐缓冲液CBS, pH 9.6): Na2CO3 1.59g ， NaHCO3 2.93g 加水至1000ml; ?洗涤液(PBST): 含0.05, Tween-20的 10mM，pH7.4的PBS。 ?封闭液: 1,BSA、或1,明胶、脱脂奶粉3%~5%的PBS。不可加Tween等表面活性剂。 ?抗体、酶联抗体稀释液: 以含2-5mg/ml BSA的PBS或PBST稀释。 ?酶标的抗体: 酶标抗体宜加甘油保存在-20度，稀释的抗体不宜在4度保存超过1星期。新制备或保 存过久的酶标记物，则需用棋盘法确定最适稀释度，并与参考酶标抗体(抗原)进行比较。 ?底物缓冲液(磷酸盐,柠檬酸缓冲液，pH5.0): 甲液:0.1mol/L柠檬酸(C6H8O7?H2O)，即称取柠檬酸21g，加水至1000mL 乙液:0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4?0H2O)，即称取磷酸氢二钠28.4g，加水至1000mL 取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。 ?TMB溶液: 10mg TMB溶于1mL DMSO(二甲基亚砜)中; 4?避光可保存3个月以上，使用时在37-40?下溶解。 ?TMB底物使用液: TMB 60ul ， 底物缓冲液 10ml ， 30%过氧化氢 10ul(临用前新鲜配制) 或TMB 60ul ， 底物缓冲液 10ml ，过氧化脲 mg(临用前新鲜配制) ?终止液(2mol/L H2SO4): 取蒸馏水177.8ml，加浓硫酸(体积比98,)22.2ml。 3(器材 ?酶标板(聚苯乙烯板) ?酶标仪(Bio-Rad 680) ?封口膜(Parafilm)、保鲜膜 ?水浴锅/恒温箱 ?微量移液器(50、200、1000、5000μl) ?吸水纸等 【操作步骤】 1. 预实验 (具体操作见正式实验) ?酶标抗体的最适浓度: a.用适当浓度的兔IgG(?10μg/ml)进行包被，洗涤。 b.将酶标羊抗兔抗体(Goat-α-Rabbit-Ag)用稀释液作一系列倍比稀释(1:100,1:200,……)后分别加入已包被的孔中，保温、洗涤。 c.加底物显色。加酸终止反应后，读取吸光度(A)。 结果判断:读取A值在1.0左右，且空白对照的A值,0.1时的酶标抗体稀释度，作为酶标抗体的工作浓度。 ?底物浓度的选择: 用配制不同浓度的底物液: a.取1ml底物缓冲液加128ul TMB，后对半稀释成6个梯度，128，64，32，16，8，4. b.取1ml底物缓冲液加128ul 30%H2O2，后对半稀释成6个梯度，128，64，32，16，8，4. c.各取50ul的A、B液于同一孔中，后加最适浓度的酶标抗体10ul，显色后观察吸光值。 结果判断:最大吸光值的孔，其TMB与H2O2的比即为最适底物浓度。 ?包被抗原浓度的选择: (确定包被浓度后，多包被几板备用) a.用包被液将抗原作一系列稀释后进行包被，洗涤。 b.将阳性样本，和阴性样本用稀释液作1:100稀释加样，保温，洗涤。 c.加按工作浓度稀释的酶标羊抗兔IgG抗体，保温，洗涤。 d.加底物显色。加酸终止反应后读取A值。 结果判断:选择阳性样本的A值为?1、阴性样本的A值,0.2的包被抗原的稀释度作为工作浓度。 2. 正式实验 ?包被: 将抗原(BSA-Ag偶联物)用包被缓冲液稀释为10μg,ml(视抗原，可1-40μg)左右(预实验中确定最适浓度)，加入聚苯乙烯板(0.1ml/孔)，加封口膜于4?过夜(或37?下，孵育6小时)。可包被BSA溶液或只加包被液作为空白对照。 ?封闭: 弃去孔内液体，每孔加200μL封闭液(近满)，37?湿盒保持6h(或4?过夜)，避免非特异性吸附。 ?洗涤: 弃反应液，以洗涤缓冲液洗板3,5次并于吸水纸上轻轻拍干。 ?加待测样品: 以稀释液将待测样品做适当的梯度系列稀释，分别加入到包被有已知抗原的反应孔中，每个稀释度二孔(0.1ml/孔)，并加空白(PBST)或阴性对照液，加封口膜后于37?水浴箱中温育反应45min。不宜太长，否则会提高本底。 ?洗涤: 重复步骤?。 ?加酶标二抗: 以稀释液将酶标抗体做1:1000以上适当稀释(预实验中确定最适浓度)，加入反应孔中(0.1ml/孔)，加封口膜后于37?水浴箱中温育反应45min。 ?洗涤: 重复步骤?。 ?显色: 加底物液(预实验中确定最适浓度)，每孔加0.1ml，室温下避光反应10,30分钟，其间不时观察，显色满意即加终止液。 ?终止: 加终止液50μl/孔终止反应。 ?测OD值: 用Bio-Rad酶标仪测定每孔在450nm波长的OD值。 ?结果判断: 若待测孔OD,0.1且大于阴性对照孔的2.1倍(P/N,2.1，其中PO 待测血清在某一稀释倍数测定的OD值，N为阴性血清在相应稀释倍数时测定的OD值)，判定为阳性，以判定为阳性的血清最高稀释倍数为血清抗体效价。(或把OD450值绘图后，观察曲线的变化趋势，应是一条S形的曲线，中点值为其效价。) 【注意事项】 ?每次实验均应做空白对照(以PBS代替样品)、阳性对照及阴性对照，前者为本底值，在实验结果时应扣除本底值，阳性对照,阴性对照,0.1,空白对照则实验成立。 ?洗涤在Elisa试验中至关重要，在洗涤操作中，由于板凹孔容量小，孔间距离近，故每次加入的洗涤液量即要达到洗涤充分又要避免相邻孔内液体互相污染，切忌剧烈振荡。 ?使用微量加样器加样必须注意的关键点是:加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。包被一般只要100ul/well，封闭至少要加200ul/well，最好把孔加满。显色液和终止液视情况而定. ?TMB可配成1,的溶液，4?避光保存，可使用3个月以上。临用时以底物缓冲液适当稀释使用，应在预试验中确定二者的最适配比，稀释的酶标结合物置于室温条件下过久，会影响底物的显色反应。变色的TMB不宜使用。 ?为使显色反应便于比较，置室温暗处的反应时间应一致，以阴性对照稍有显色时，为最佳终止时间，一般为10,30min。终止反应3-5min后，应立即比色。必要时可设阳性对照，以固定显色及终止的时间。 ?在实验确定各种浓度后，要在每次实验中保持各种条件的稳定，如各块板的抗原包被浓度、孵育时间、温度等等。 【参考文献】 1. 朱正美等，简明免疫学技术，科学出版社，2002，p161-169; 2. ELISA Procedure for Measuring Serum Antibody Titer; 3. Peter Hornbeck, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons. Inc.,1991.