664_全血酶联免疫法监测肝移植术后他克莫司血药浓度(修）

664_全血酶联免疫法监测肝移植术后他克莫司血药浓度(修） 酶联免疫法监测肝移植术后他克莫司血药浓度 张宁，吕慧怡，范青，王双双* (大连医科大学附属二院药剂科，大连 116027 *大连医科大学临床药学系2001级实习生) 摘要:目的 为使用他克莫司的肝移植患者制定有效的治疗窗浓度。方法 用酶联免疫 法测定全血他克莫司谷浓度，并对他克莫司谷浓度的监测结果进行回顾性。结果 他克莫司治疗窗浓度范围为:第1个月内为10-17ng/ml，第2-3个月为9-11ng/ml，4-12 个月为5-8ng/ml。结论 此浓度既能达到满意的免疫抑制效果，又能减少他克莫司的不 良反应。 关键词:他克莫司;血药浓度;酶联免疫法;肝移植 Determination of Concentration of Tacrolimus of the Liver Transplant Recipients in Whole Blood With ELISA Zhang Ning,Lv Huiyi,Fan Qing,Wang Shuangshuang* (The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University Dalian 116027 *Studengt of 2001grade Clinical Pharmacy Department of Dalian Medical University) ABSTRACT:OBJECTIVE To find out the valid window concentration of tacrolimus in Chinese liver transplant recipients. METHODS The whole blood concentrations of tacrolimus were measured by ELISA. The levels of tacrolimus in samples were compared and studied. RESULTS The blood FK506 trough level was 10-17ng/ml within the first month,9-11ng/ml from the second to third month ,5-8ng/ml from the fourth to the twelvth month.CONCLUSTONS This range of therapeutic window concentration of FK506 trough levels was ideal for Chinese liver transplant recipients with less rejection and toxic effects. KEY WORDS: FK506;blood concentration; ELISA; liver transplantation 他克莫司(tacrolimus,商品名为普乐可复，代号FK506)，是从土壤真菌Streptomyces tsukubaensin的发酵液中分离而得，是一种具有大环内酯结构的新型强效免疫抑制剂 [1][2]。其预防移植器官排斥的免疫抑制作用比环孢素A(CsA)强10-100倍，临床已 用于肝、肾等多种器官移植的免疫抑制治疗。由于他克莫司的治疗窗窄，患者个体间 和个体自身药动学的差异大，给药剂量和全血浓度之间的相关性差，临床应用时为获 得最佳免疫抑制效果，减少不良反应，需常规监测他克莫司血药浓度以及时调整用药 [3-4]剂量。本文对10例使用FK506的肝移植患者采用全血酶联免疫法进行常规FK506 血药浓度监测133例次，对结果进行了回顾性分析。 1与方法 1 1.1 病例资料与血样 接受同种异体原位肝移植0-12个月的患者10例，男7例，女3例，年龄33-62岁(平均52.5岁)。原发疾病为乙型肝炎肝硬化，丙型肝炎肝硬化，肝癌。肝移植术后第1个月受检全血45份，第2-3个月受检全血46份，4-12个月受检全血41份。 1.2血样采集 10例患者口服FK506胶囊均为每12小时1次(剂量根据浓度监测结果随时调整，口服范围一般为1-6mg)，血样采集为用药后12小时的空腹血2ml放入EDTA钾盐的抗凝管中，血液如不及时检测，即放冰箱中冰冻保存。 1.3试剂与仪器 (1)试剂:意大利Diasorin公司生产的PRO-Trac? TM Tacrolimus ELISA试剂盒，包括:?酶标板;?FK506单克隆抗体;?5×浓缩辣根过氧化酶储存液;?酶标稀释液;?0标准及标准品(标准品的浓度分别为:0.3、1.0、3.0、10、30ng/ml);?质控对照品1，2;?底物液;?终止液; ?10×洗涤液;?消化液(2)仪器:美国Universal Microplate Reader ELX800 NB 酶标仪，Adoff管(江苏海门天星塑料制品厂) 1.4测定方法 建立6个点的标准曲线，标准液浓度分别为0，0.3，1.0，3.0，10.0，30.0ng/ml，并带2.0，15.0ng/ml两个质控液跟踪监控。取标准系列液、0标准、质控对照和检测标本各25μl放入1.5ml Adoff管，加入150μl消化液，震荡30秒，混匀，室温下静置15min，然后放入75?水浴箱中静置15min。取出涡旋30秒，混匀，4500rpm离心10min，分别取上清液100μl加入酶标板，除空白对照管外每管加50μlFK506单抗，空白对照管加50μl酶标稀释液，用薄膜覆盖酶标板放入温育震荡器，700?50rpm置37?震荡30min。取出加酶标液50μl(用酶标稀释液5倍稀释酶标浓缩液)，震荡60min(条件同前)。取出洗板3次(用蒸馏水将洗涤缓冲液作1:10稀释)，然后每管加200μl底物液，震荡15min(条件同前)。再加入100μl终止液,用酶标仪450/630nm测定吸光度，使用4PL软件作吸光度对应浓度标准曲线图，根据每管吸光度查标准曲线得出浓度。 2结果 2.1 质量控制 每次测定时带2.0，15.0ng/ml两个标准质控，日间RSD分别为8.70%和3.22%，所得实测质控值全部在有效范围内，由此可见，所得FK506浓度监测结果真实、可靠。 2.2 FK506全血谷浓度测定 将133例次全血FK506谷浓度测定值按术后不同月份分组，取每月平均值，术后第一个月为8.89?6.45ng/ml，第2，3个月为7.73?3.39ng/ml，4-12个月为6.91?4.39ng/ml。在所监测的133例次中，发生中毒反应11次，第1个月 2 内5次，2-3个月5次，4-12个月以后1次;发生排斥反应6例次，其中第1个月内2 例次，第2-3个月3例次，4-12个月以后1次。由于一年后所监测患者均出院，不能 随时观察，所得结果可能不准确，所以未纳入本研究范围内。 3讨论 在开始用FK506初期，我们参照治疗窗浓度，术后第1个月内为15-20ng/ml， [5]术后第2，3个月为10-15ng/ml，第4-12个月为5-10ng/ml维持。但有6例排斥反应 和8例中毒反应，其中第一个月发生排斥反应2次，血药浓度均,10ng/ml，发生中毒 反应5例次血药浓度均,17ng/ml;2-3个月发生排斥反应3例次，血药浓度均,9ng/ml， 发生中毒反应2例次，血药浓度均,11ng/ml;4-12个月发生排斥反应1例次，血药浓 度均,5ng/ml，发生中毒反应1例次，血药浓度均,8ng/ml。鉴于以上情况，我们将 治疗窗浓度范围作了适当的调整。第1个月内为10-17ng/ml，第2-3个月为9-11ng/ml， 4-12个月为5-8ng/ml。此浓度既能达到满意的免疫抑制效果，又能减少FK506的不良 反应。但也不能仅仅依赖血药浓度判断病情，还须靠临床经验和其他辅助检查来帮助 判断，才能减少不良反应和排斥反应的发生，发挥药物的更大疗效。 参考文献 [1]KinoT, Hatanaka H,Hashimoto M, et al.FK506,a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I.Fermentation , isolation ,and physio-chemical and biological characteristics [J].J Antibiotics,1987,40:1249. [2]Wallemacq PE,Reding R.FK506(tacrolimus),a novel immunosuppressant in organ transplantation :clinical ,biomedical ,and analytical aspects [J].Clin Chem,1993,39(11):2219. [3]MacFarlane G,Scheller D,Ersfeld D,et al.Asimplified whold biood enzyme-linked immunosorbent assay(ProTrac ?) for tacrolimus (FK506) using proteolytic extraction in place of organic solvents [J].Ther Drug Monit,1996,18(6):698. [4]Venkataramanan R,Swaminathan A,Prasad T,et al.Clinical Pharmacokinetics of tacrolimus [J] Clin Pharmacokinet,1995,29(6):404. [5]Sewing KF.Pharmacokinetics,dosing principles,and blood level monitoring of FK506 [J].Transplant Proc,1994,26(6):3267. 3