细胞生物学综合实验报告

细胞生物学综合实验 生命科学学院, 姓名 学院, 专业, 班级,10B班, 实验课程名称,人类淋巴细胞株的培养, 指导教师及职称 许琳峰 , 开课时间 2012 至,2013 学年,上 学期 云南师范大学教务处编印 人类淋巴细胞株的培养 实验名称: 实验时间: 2012.3——2012.4 实验室: 睿智楼3栋424 小组合作: 第四小组 1、细胞培养准备工作(清洗、消毒、灭菌) 2、培养基的配制 3、细胞传代培养 实验主要内容: 4、死活细胞的鉴别 1、能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒，掌握干热 灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 一、实验目的 2、熟练掌握RPMI 1640培养基的配制方法。 3、熟练掌握细胞传代培养的操作方法，观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。 4、掌握死活细胞的鉴别原理及方法。 1、细胞培养准备工作(清洗、消毒、灭菌) (1)、清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。 (2)、体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。 (3)、灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧 失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。 2、培养基的配制 细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方 制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相 似。 3、细胞传代培养 二、实验原理 当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定的密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，以适当比例转移到另一个或几个容器中扩大培养，此过程为传代培养。一般将传代培养的累积次数作为传代细胞的代数。 4、死活细胞的鉴别 细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。 原理:许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入 死亡的细胞内，使其着色，以次来区别死活细胞。 三、实验大体 细胞培养准备工作 培养基的配制 细胞传代培养 死活细胞的鉴别 四、装置示意图 五、实验仪器，材料及试剂 (一)工具 超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器 细胞培养瓶、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸、pH试纸、微孔过滤器(0.22μm)及注射器、离心管 微量加样器(移液枪)、倒置显微镜、光学显微镜、高压灭菌锅、蒸馏水器、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、血球计数板、滴管、显微镜、 血球计数板 (二)材料 微孔滤膜(直径25mm):孔径为0.22um、各种规格的Tip 、培养细胞、人类淋巴细胞株。 (三)试剂 75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、 HCl、 酚红、RPMI 1640干粉、小牛血清、青霉素、链霉素、NaHCO3 、L-谷氨酰胺、三蒸水 台盼蓝(染料)、乙醇 :0.4%台盼蓝溶液 六、实验步骤 清洗 胶塞处理 塑料制品的清洗 tip和tube的清洗 洗液的配制 消毒和灭菌 化学消毒法 准备(清洗与灭菌) 合成培养基的配制 小牛血清的处理 生长培养基的配制 每小组先用一个培养瓶配制50ml的生长培养基 没人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内 然后向细胞培养瓶内接种400ul的人淋巴细胞株原液 放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖(直立放置 ) 取20ul细胞悬液放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混合，放置1min。 取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。注意滴液勿有气泡，也不能太多，否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。 低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。 七、实验操作方法 (一)洗液的配制 常用的洗液是硫酸-重铬酸钾溶液。洗液可根据需要配制不同的浓度 成分 强酸洗液 次强酸洗液 6.3g 315g 12g 600g 重铬酸钾 100ml 5000ml 20ml 1000ml 浓硫酸 20ml 1000ml 100ml 5000ml 蒸馏水 配制方法: (1)将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。 (2)将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。 注意:操作时注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应立即用大量清水冲洗。 (二)RPMI 1640 培养液配制 1、每组称取 RPMI 1640干粉 0.52g，溶于50 ml 的三蒸水。 2、置于搅拌器上搅拌 20 min，直到液体变为澄清为止。 (三)RPMI 1640 合成培养基配制 1、加入 0.1ml 1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。 2、配制好的培养基，用时用饱和 NaHCO3液调节 pH 至 6.8-7.0。 溶好以后的培养液在超净台中进行0.22μm滤过除菌，分装至细胞培养瓶中。 3、瓶口封好，-20?或4 ?贮存。 (四)RPMI 1640生长培养基的配制 50ml 储备液浓度 终浓度 44.5 RPMI 1640培养液 —— —— 0.5 30mg/ml 0.3mg/ml 谷氨酰胺 0.05 100000u/ml 100u/ml 双抗 5 10% 小牛血清 —— (五)传代培养操作方法 每小组先用一个培养瓶配制50ml的生长培养基 每人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内 然后向细胞培养瓶内接种400ul的人淋巴细胞株原液 放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖 根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置 (六)死活细胞鉴别操作方法 1、取20ul细胞悬液放入干净的离心管中，加入等体积的0.4%的台盼蓝染液混合，放置1min。 2、取一干净的血球计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。注意滴液勿有气泡，也不能太多，否则会使盖片浮起而是细胞计数不准。 3、低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。找出计数板上的方格，计算四角大格内总的细胞数，压着大格线者只计左侧或上方，不计右侧或下方。 4、计算: 每毫升原液细胞数 = 4大格细胞总数/4 × 10000 × 稀释倍数 细胞存活率(%)=(细胞总数-死细胞数)/ 细胞总数 注:每个大方格边长为1mm，则每个大方格面积为1X1=1mm2。盖上盖 玻片后，载玻片与盖玻片之间高度为0.1mm,所以每个计数室的体积为 0.1 X 1 X 1=0.1 mm3 1ml = 1000 mm3 每个大格有400个小格，所以每个小方格体积为 0.1/400 =1/4000mm3 =1/4000,000ml 七、实验现象及结果 1、洗液的颜色为黑色 2、RPMI 1640培养液的配制时，置于搅拌器上搅拌20min后，液体变的澄清。 3、RPMI 1640合成培养基的配制通入二氧化碳之前为红色，通入二氧化碳之后变为金黄色。 4、死活细胞的鉴别 (1)低倍镜下看到细胞的颜色有无色，深蓝色。 (2)计数结果如下表 第一个大格 第二个大格 第三个大格 第四个大格 A 45 51 49 53 活细胞 B 64 45 48 47 54 48 48 50 平均 A 12 13 15 12 死细胞 B 11 14 18 17 12 13 16 14 平均 (3)计算 197每毫升原液细胞数 = = 985000个 ，10000，24 197细胞存活率(%) = = 78% ，100%252 八、实验 (一)、注意事项: 1、洗液的配制时，向重铬酸钾中倒入浓硫酸时，速度要慢，且边到要变搅拌。 2、清洗和消毒是组织培养实验的第一步，所以在清洗实验用具时，一定要反复彻底的洗干净，消毒也要做得彻底。当然灭菌手段的选择也很重要。 对不同的物品需要采取不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌物品丧失了营养价值。 3、要使细胞能够在体外长期生长，必须满足两个条件:第一、供给细胞存活所必须的条件。第二、严格控制无菌条件。 4、培养基的配制。在此过程中涉及到的新买的小牛血清一定要灭活。 5、细胞传代培养，在此过程中要防止可能的污染，操作一定要在超净工作台内进行，操作人员要能正确地操作超净工作台，实验开始前打开照明灯并通风，然后操作人员要点燃酒精灯，并且用酒精棉球擦手，使其消毒，之后用移液抢取样等步骤都要在酒精灯旁边完成。培养瓶盖等盖取下之后即盖上，以免被污染。 6、死活细胞的鉴别，一定要注意滴液不要有液泡，也不能太多，否则会 使盖片浮起来而使细胞计数不准。 (三)实验分析与讨论 1 血清在细胞培养中的作用, 答:血清含有一定的营养成分，含有细胞生长所必须的生长因子，酶，微量元素和激素，有保护作用，提供生长和贴附因子等，是合成培养基无法取代的，此外还能中和有毒物质的毒性。 2 要使细胞能在体外长期生长，必须满足哪些条件, 答:(1)提供细胞存活所必须条件，如适量的水，无机盐，氨基酸，维生素，葡萄糖及有关的生长因子，氧气，适宜的温度。注意外部环境酸碱度和渗透压调节。 (2)严格控制无菌条件。 3 配制培养基是调节PH值的目的是什么, 答:是为了保证细胞在体外生存所适宜的酸碱度 (三)、实验小结 本次实验是通过小组的形式完成的，实验分成四次完成，由于时间有点长，导致各实验的衔接不是很好，实验过程当中也出现了很多问题，但是在实验中的每一步都严格按照要求完成。此实验的灭菌做的较好，培养基未被污染，相对不足的是PH的调试不是很精确，还有取量也不准确，使得实验有了一定的误差。 此次实验，小组当中的各个同学都很积极，大家都很主动，实验中遇到问题时，大家一起讨论和解决，通过同学们的努力和老师的指导，实验顺利的完成了.。实验中出现的问题，在以后得学习当中我们将会努力加以 改正。 指导老师评语及得分: 签名: 年 月 日