饮牛沟墓地古人骨线粒体DNA的研究

饮牛沟墓地古人骨线粒体DNA的研究 第43卷第6期 2005年11月 吉林大学(理学版) JOURNALOFJIHNUNIVERSITY(SCIENCEEDITION) Vo1.43No.6 NOV2O05 饮牛沟墓地古人骨线粒体DNA的研究 葛斌文,张全超,周慧,朱泓 王海晶,常娥, (1.吉林大学边疆考古研究中心,长春130012;2.吉林大学化学学院,长春130021; 3.吉林大学生命科学学院.长春130021) 摘要:对内蒙古饮牛沟战国时期墓地的古代人群(Yng古代人群)进行分子生物学 研究,获得 了线粒体高可变一区DNA序列,初步确定了单倍型归属并搜寻其共享序列,与现 代人群对比 构建系统发育树和多维尺度分析.结果表明,饮牛沟古代人群与现代东亚人群在母 系遗传关 系上较近. 关键词:线粒体DNA;古DNA;系统发育分析 中图分类号:Q987文献标识码:A文章编号:1671-5489(2005)06-0847-06 MitochondrialDNAAnalysisofHumanRemains FoundinYinniugouCemetery WANGHai-jing,CHANGE',GEBin.wen,ZHANGQuan.chao',ZHOUHui',ZHUHong' (1.ResearchCenterforChineseFrontierArchaeologyofJilinUnive~i@,Changchun13001 2,China; 2.CollegeofChemistry,JdinUnive~i@,Changchun130021,China; 3.CollegeofScience,JdinUniversity,Changchun130021,China) Abstract:WestudiedancientindividualsburiedintheYinniugoucemeteryofInnerMongoliabymolecular biologicalmethods.WeobtainedfivesequencesofthehypervariableregionI(HVS-I)ofthemitochondrial DNA(mtDNA)controlregionandprimarilyassignedthesequencesintohaplogroupsA,B,D,CorZ,respec- tively.Aphylogenetictreeandatwo-dimensionalMDSplotwereconstructedbasedonpairwiseF盯values (calculatedfrommtDNAHVS-Isequencedata)betweentheYinniugoupopulationand16relativemodern populations.TheresuhsshowtheaffinityoftheancientpopulationwitheasternAsianpopulationsinmatrilin- eallineage. Keywords:mitochondrialDNA;ancientDNA;phylogeneticanalysis 内蒙古自治区乌兰察布盟的凉城县地处蛮汗山脚下,是我国北方古代各族人民活 动生息的重要地 区之一,也是古代北方草原文化与中原文化相互交融的接触地带.内蒙古自治区文 物工作队等单位的 考古工作者于1982年在凉城县饮牛沟发掘了一处东周时期的墓葬….该墓葬东北 距凉城县城l5km. 墓葬地处山前的缓坡地带,海拔约在1200m以上.这一带由于严重的水土流失,形 成了丘陵起伏,沟 壑纵横的荒凉地貌.墓地随葬陶器少,仅限于明器或青铜武器或装饰品以及只有带 钩,在墓葬结构上 以头向北为主,用棺椁等从前未见的习俗出现,这些随葬习俗的大变化正是因为受 不同文化影响而产 生的.在墓葬年代上,饮牛沟出土的带钩或铁制斧的型式呈现战国后期特点,故推 断饮牛沟墓地的年 收稿日期:2005-07.18. 作者简介:王海晶(1974,),女,汉族,博士研究生,讲师,从事分子进化研究,E?mail:w~nshaijing5186@163.con.联系人: 周慧(1954,),女,汉族,博士,教授,博士生导师,从事分子进化研究,E?mail:zhouhui@mail.jlu.edu.ca. 基金项目:国家基础科学人才培养基金(批准号:J0O30O94). 吉林大学(理学版)第43卷 代为战国后期阶段,这个年代和《史记》等所记载有名的赵武灵王的北方侵略时期一致.在此时赵长城 延伸至呼和浩特北沿,因此,这样的墓葬变化极可能是表示汉化的现象. 本文研究了饮牛沟墓葬中保存较好,较完整的五座墓葬中的人骨,试图在测定线粒体DNA第一高 变区序列基础上,通过系统发育分析研究饮牛沟古代人群与现代人群间的遗传关系,为进一步探讨战 国时期内蒙古中南部人种组成提供了一定的线索,在探讨该时期中原列国北扩疆土与北方民族南下冲 突融合的历史过程问题上具有重要的学术价值. 1和方法 1.1材料 实验的5个样本均采自内蒙古凉城县饮牛沟墓地.所采集部分均为牙齿.样品编号及人类学鉴定 见表1. Table1Thenumberofsamplesandanthropologydata 1.2实验方法 1.2.1线粒体高可变一区(HVS—I)DNA片段扩增将牙齿样本浸泡在1mol/L盐酸中3,5min,分 别用三蒸水和无水乙醇清洗,牙齿样本的每一面均用紫外照射15min,最后用6750FreezerMill (Metuchen,USA)研磨机研磨成粉末.使用GENECLEAN'forAncientDNA试剂盒 (BIO101,USA)进 行DNA提取,利用4对套叠性引物对线粒体高可变一区(HVS—I)DNA片段进行扩增.使用 QIAEX'11GELExtractionKit(QIAGen,Germany)纯化PCR产物,用于双链DNA直接测序(ABIMod— el310). 1.2.2酶切分型将DNA抽提液利用A,c,D,G型酶切引物进行PCR扩增,产物进行相应的限制性 酶切反应(见表2).酶切体系:10×缓冲液2IxL,PCR产物5IxL,ddHO12.5,酶0.5,37? 水浴4h.酶切结束后,用ABI310序列分析仪进行毛细管电泳利用基因扫描技术检测荧光标记并计算 酶切产物片段长度,观察是否在特定位点进行酶切.B型用荧光引物进行PCR扩增,ABI310序列分析 仪进行毛细管电泳,利用基因扫描技术检测荧光标记并计算扩增片段长度,判断是否有9bp缺失. Table2Speciallyrestrictedenzymesitesandprimers $Indicatesthatthesequenceisfluorescentlabelling. 1.2.3系统发育分析在所得线粒体高可变一区序列中截取310bp(16065—16374,除去了引物区的 DNA序列)的DNA序列用于统计学分析.结合现今人群的mtDNA数据,对饮牛沟古代人群进行了生 第6期王海晶,等:饮牛沟墓地古人骨线粒体DNA的研究849 物统计学分析.人群之间的遗传距离由ARLEQUIN2.0软件计算,采用Tamura/Nei模式,参数为 0.26,转换颠换比设为10:1.基于遗传距离使用PHYLIP3.63软件包构建了邻接树(NJtree),并进行 了多维尺度(MDS)分析. 2结果与讨论 2.1古代人群序列的变异情况 线粒体DNA片段从所有5个样本中成功的扩增出来.所有的抽提和扩增的空白对照均为阴性,表 明在骨样的抽提和扩增过程中未发生污染.4对套叠引物扩增出的片段可连接成一条310bp的高可变 区的序列,测序结果列于表3.在5个序列中共发现5个DNA序列(haplotype),14 个核苷酸变异位点, 均为转换. Table3HVS.Isequencesofthesampies SamplecodePolymorphiepositions 2.2单倍型归属 由于目前各大洲人群的mtDNA变异主要体现在一些由系统发育上构成单系的一组mtDNA世系 (Lineage,haplotype),即单倍型类群(Haplogroup)的分布上,而每种单倍型类群又都有一些特征位点 这些位点在mtDNA编码区和控制区序列中都有体现. 变异, 非洲大陆特异的单倍型类群L比欧亚人群中检测到的单倍型类群古老,界定L类群的突变 +3592Hpa1只在非洲人群和史载中与非洲人群有基因交流的其他人群中存在.L类群可分为Ll和 L2两个亚世系,其中Ll含+10806HinfI和一2758RsaI突变,约52%L类群的单倍型和29%的非 洲人群中所检测到的单倍型可归人Ll中,L2由+16389HinfI,一16390Ava?突变界定,占48%的 L类群和34%的非洲人的单倍型.其余37%非洲人的单倍型(一3592HpaI)构成L3?5J,与欧亚人群 中的单倍型较为相似,可能是欧亚人群单倍型的祖先型.亚洲人群通过是否有10394DdeI突变位点, 所有的单倍型都可分在两个大的聚类群中,其中M聚类群含+10394DdeI和 +10397AluI突变,包 含有c,D,G和E等单倍型类群,另一个聚类群N中没有这两个突变,包含A,B和F等类群. 先通过D环序列分析,初步确定出该个体可能属于何种单倍型类群,进而对这种单倍型类群的其 他区域特征变异位点进行酶切分析或测序证实是一种较为快捷,方便和经济有效的做法.一般地,有 些单倍型类群如A,B,c和z等都可以简单地根据高变一区序列变异情况予以划分.由高变区序列分 析再到特定区域RFLP的验证应当是今后人群mtDNA分析的一种走向J. 依据文献[6]对高可变一区序列5个样本进行了初步判断,Yl具有16189突变位点,可能为N型 中的B亚型;Y2具有16223—16298.16327motif,推测是M型中的C亚型;Y3样本由于具有16223和 16362突变位点,可能为M亚型中的D亚型;Y4样本由于具有16223,16260和16298突变,推测是 M型中的C或Z亚型;Y5样本根据其突变位点16223.16290.16319.16362motif,可能为N型中的A亚 型. 本实验还对5个样本酶切分型进行了验证.由于Y3和Y5取样时只有一颗牙齿,为保证高可变一 l622 l6l8 l6ll l6O9 吉林大学(理学版)第43卷 区序列真实性,进行反复抽提和测序,只剩下很少抽提液进行酶切实验,未得到酶切结果;Y4样本进 行多次c亚型扩增,均未得到序列,可能是此段mtDNA遭受了严重破坏,这是古 DNA研究中常见的 问题;实验得到Yl和Y2两个样本的酶切结果,证实Yl为N型中的B亚型;Y2为 M型中的C亚型. 2.3共享序列的分布 为了研究所得到的序列在现今人群的分布情况,将饮牛沟战国晚期墓地古代居民 的线粒体DNA 高可变一区的5种单倍型在GENBANK数据库中通过BLAST寻找其共享序列. 共享序列的分布情况见 表4,在这些古代个体中,Y2和Y5找到完全共享人群,这些共享人群主要分布在东 亚和北亚,且主要 分布于中国境内各省. Table4DistHbufionofthesequencesofYinniugouindividualamongmodernpopulations AncientindividualSharingpopulationsandnumberofindividuals Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 None Shandong(1);Sichuan(2);Shanghai(2);Liaoning(2);Guangxi(2);Fujian(2); InnerMongolia(2);Mongolia(3);Xinjiang(3);Evenk(4);Yunnan(6) None None Yunnan(1);Shanxi(1);Qinghm(1);Hunan(1);Gansu(1);Anhui(1);Shandong(1); Xinjiang(1);Zhejiang(2);Mongolia(3) {NoneindicatesthatnosharingsequencehasbeenfoundinpresentDNAdatabase. 2.4系统发育树的构建 我们选择了东亚的北方汉族(山东,辽宁),来自内蒙古蒙古族人,日本人,韩国人;北 亚的蒙古 国蒙古族人,布里雅特人,雅库特人,阿尔泰人;中亚的维吾尔人,哈萨克人,吉尔吉斯人,土库曼人, 乌兹别克斯坦人;西南亚的库尔德人;小亚细亚的土耳其人和欧洲人(英国,瑞士,巴斯克)作为对比 人群,基于mtDNA数据计算了群体间的遗传距离,并根据遗传距离构建了群体系统发育树(图1).在 系统发育树中,饮牛沟古代人群与内蒙古的蒙古族人的遗传距离最近,并聚集在一起,其次,饮牛沟 古代人群与韩国人和中国北方汉族人的分支较短,与土耳其和欧洲距离最远.系统发育树明显分成东 亚,北亚和中亚欧洲3支,饮牛沟古代人群位于东亚分支上.说明饮牛沟古代人群在母系遗传上与现 代东亚人群接近. Jap Fig.1Neighbor-joiningtreebasedonpairwiseFsTvaluesbetween17populations Hart:No,hemHart;Kor:Koran;Jap:Japanese;Uig:Uighur;Kaz:Kazakh;Kir:Kirghiz;Kud: Kurd;Tur:Turkman;Uzb:Uzbek; Bur:Buryat;Yak:Yakut;Ah:Altaian;[rag:InnerMongolian;Mon:Mongolian;Eur:Europea n;Tuk:Turk;Yng:thisstudy. 2.5多维度分析 利用SPSS11.5软件,采用欧式距离模型对所选人群做二维多维度分析.结果见图2. 饮牛沟墓地的古代居民与东亚人群(NorthernHan人群,InnerMongolian人群和Korean人群)有着 第6期王海晶,等:饮牛沟墓地古人骨线粒体DNA的研究85l 较近的亲缘关系.图2中各个人群的分布与所构建的无根邻接树十分相似.无论在地理位置上,还是 在人群的分类上,这一结果都是合理的. Yak Bur 0Mon KirYng .TukTrKaz.KorImg EuKu. r Uzb. a 三Uig 一 4—3—2—101234 One—dimension Fig.2Two-dimensionalMDSplotbasedonpalrwiseFsTvalues(calculatedfrommtDNAHV S.IsequencedataJ betweenYinniugoupopulationsand16referencepopulations 2.6讨论 本实验的样本取自内蒙古凉城县蛮汗山南麓饮牛沟墓地的五座战国晚期墓葬,这批墓葬存在着两 种截然不同的葬俗,考古学家们推测:墓地中东西向,头向东的墓主,可能是匈奴势力北辙后,继续留 在当地的匈奴人的一支.此种葬法应为匈奴穹庐向日,"朝出营,拜日之始生"的风俗在葬俗上的反 映.而南北向,头向北的墓主,则可能是赵国势力北上后,进入到原匈奴住地的华夏族.饮牛构墓地的 人骨材料的形态学研究分析表明:饮牛沟古代居民与现代东亚蒙古人种颇为近似. 古代DNA(ancientDNA)研究是近年来由分子生物学,考古学,人类学及古生物学等交叉产生的 一 个新的研究领域-10].从标本中提取出DNA,扩增出相关的目的片段,并有效地防止外源DNA的 污染成为古代DNA研究的关键,我们采取了一系列严格的措施防止现代DNA分子的污染.所用试剂 均为DNA.free的,所有一次性耗材均经高压灭菌(12l?,15min),烘干后使用;样本的抽提和扩增 均设置了空白对照,结果为阴性;同一样本均进行两次以上抽提,扩增和测序,获得了相同的序列;所 得的实验样本序列均与试验中所涉及人员的序列对比,未见相同序列. 实验获得了5个真实的饮牛沟古代样本mtDNA高可变一区序列,其中4个样本含16223(c—T) 的取代,这一位点在北亚,东亚的谱系中占有很大的比例(蒙古为65%,日本为40.7%),在欧洲谱系 中却很少见,只占7%左右.2个序列同时含有东亚特异的变异位点,即16223C---,T和16362T---,C... 饮牛沟样本高可变一区的序列中多数样本c,D和z归属于亚洲特异的M分支下.少数A和B属于亚 洲和欧洲共有的N分支.单倍型A,B,c和D主要分布在东亚和北亚人群中,部分分布在中亚人群 中[.在GENBANK数据库中寻找其共享序列,共享人群主要分布在东亚和北亚,且主要分布于中国 境内各省.因此,初步判断饮牛沟古代人群与东亚人群在母系遗传上有较近的亲缘关系. 为进一步确定这个墓地人群的遗传关系,我们基于l6个现存人群的mtDNA高可变一区序列和饮 牛沟古代人群的序列进行了系统发育分析和多维尺度分析.系统发育树是关于个体,群体和物种之间 关系的进化假设.目前有多种方法构建系统发育树,当人群的亲缘关系很近时,不 同的构树方法所得 系统发育树在分支上总是或多或少存在差别,但在理论上却很难判定哪种系统发育树更合理.多维尺 度分析法以两个群体间的遗传距离作为尺度,而不考虑群体的进化发育关系将群体间遗传关系的远近 反映在二维或多维图谱中.多维尺度分析可以克服系统发育构树方法中的许多问题.因此我们采取两 种分析方法研究饮牛沟墓地的古代人群与现今人群的亲缘关系,以确保分析结果的真实和可靠.两种 分析方法结果一致,表明饮牛沟古代人群与东亚人群(NorthernHan人群,InnerMongolian人群和 Korean人群)均有着较近的亲缘关系.这一结果为进一步探讨战国时期内蒙古中南部人种组成提供了 一 定的线索,在探讨该时期中原列国北扩疆土与北方民族南下冲突融合的历史过程问题上具有重要的 852吉林大学(理学版)第43卷 学术价值. 对为实验提供古人骨样品的内蒙古文物考古研究所和在资料收集过程中,中国人民大学人文学院 的魏坚先生以及内蒙古文物考古研究所的塔拉,陈永志,曹建恩等先生给予的大力帮助,在此表示感 谢. 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