中药指纹图谱

指纹图谱 百科名片 中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理 后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色 谱图或光谱图。 目录 简介 中药指纹图谱技术的特色和创新点 指纹图谱的分类 指纹图谱建立的一般原则 指纹图谱技术研究概况 , DNA指纹图谱分析实验目的 , 实验原理 , 实验材料和试剂 , 实验步骤 展开 编辑本段简介 甘草的HPLC指纹图 中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。总之，中药指纹图谱的研究和建立，对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。 编辑本段中药指纹图谱技术的特色和创新点 如前所述，中药指纹图谱的研究以反映中药的整体化学特征为立论依据，提出以解决两个关键技术为突破口，实现指纹图谱技术在中药质量控制方面的应用。它的特色主要现在三个方面: 四川产芎10个指纹图谱叠加示意图 1、用化的程序获得中药特征性总成分提取物，并用1HNMR、HPLC、UV、IR等多种手段表征其组成和结构。不同的表征手段间的区别主要表现在所得到的信息多少不同和操作上的方便程度不同。同此，核心的问在于这种特征性总成分提取物要有真正的特征性，它的组成和结构要能真正代表这种中药。 2、由于同时采用多种检测手段来表征中药特征总提物的结构和相对组成方式，因此，方便了各部门在质量控制方面可以根据自己的实际情况选择应用。其中，由于1HNMR具有操作简便、快速、检测成本低、重现性好和信息量大等优点，更是中药指纹图谱研究的主要特色之一。 3、中药指纹图谱的解析研究以及中药特征总提物和各单体成分的生理活性研究体现了这一技术的科学性。 中药指纹图谱的研究将近代分离手段和仪器分析技术应用于中药的质量控制，目的在于建立一种新的质量控制方法，因此，是一种具有创新性的研究工作。另外，每种中药指纹图谱的建立和对其进行的解析也均具有显著的创新性。 编辑本段指纹图谱的分类 目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和X—射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点。中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验。因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC—MS和GC—MS等联用技术的应用，中药指纹图谱技术更趋完善。 编辑本段指纹图谱建立的一般原则 中药指纹图谱的建立，应以系统的化学成分研究和药理学研究为依托，体现系统性、特征性和稳定性三个基本原则。为此，才能保证指纹图谱的化、规范化、客观化，从而便于推广和应用。 1.系统性 是指指纹图谱中反映的化学成分应包括该中药有效部位所含大部分成分，或指标性成分的全部，如中药两头尖中抗肿瘤的有效成分为皂苷类化合物，则其指纹图谱应尽可能地反映 其中的皂苷类成分;银杏叶的有效成分是黄酮类和银杏内酯类，则其指纹图谱可采用两种方法，针对这两类成分分别分析，达到系统全面的目的。 2.特征性 是指指纹图谱中反映的化学信息(如保留时间)应具有较强的选择性，这些信息的综合结果，将能特征性地区分中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。如北五味子的HPLC指纹图谱和TLC指纹图谱，不仅包括多种的五味子木脂素类成分，而且具有许多未知类成分，这些成分的峰位顺序、比值在一定范围内是固定的，并且随药材品种不同而产生差异，依此可以很好地区别其来源、产地，判别药材的真伪优劣。 3.稳定性 是指所建立的指纹图谱在规定的方法、条件下的耐用程度，即不同操作者、不同实验室所重复做出的指纹图谱应在所允许的误差范围内，以体现其通用性和实用性。因而要求包括样品制备、分析方法、实验过程、数据采集、处理、分析等全过程都要规范化操作，同时，还应建立相应的评价机构，对其进行客观评价。 编辑本段指纹图谱技术研究概况 以指纹图谱作为中药(天然药物)提取物及其制剂的质量控制方法，已成为目前国际共识，各种符合中药(天然药物)特色的指纹图谱控制技术体系正在研究和建立。美国食品药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料中提供色谱指纹图谱;世界卫生组织(WHO)在1996年 草药评价指导原则中也规定，如果草药的活性成分不明确，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致;欧共体在草药质量指南中亦称，单靠测定某种有效成分考查质量的稳定性是不够的，因为草药及其制剂是以整体为活性物质。色谱指纹图谱尤其是薄层色谱的鲜明的指纹图谱是很有用的。国外指纹图谱的应用，目的在于解决成分复杂，有效成分不明确的植物药质量检测和产品批次间质量差异的问题。其中德国研制的银杏叶提取物制剂是一个突出的例子。他们应用指纹图谱制定了相应的标准，该图谱体现了制剂所含的33个化学成分(主要为黄酮类和内酯类)和各自的含量。经化学成分和药效相关性研究，发现约24%银杏黄酮和约6%银杏内酯组成的提取物具有最佳疗效。此外，采用“混批勾兑”法，可使最终产品质量稳定，指纹图谱重现性良好，含量浮动范围为5%左右。 20世纪70年代我国已有学者尝试使用TLCS对中成药进行分析，因主客观条件的限制，技术和时机的不成熟，没有得到公认;20世纪90年代《中国药典》增设了中药化学对照品和对照药材，为中药指纹图谱的研究奠定了基础。随着色谱技术的迅速发展和检测能力的显著增强，为指纹图谱的研究和应用提供了良好的技术保证。目前我国已对中药注射剂做出了必须用指纹图谱进行检测的规定，同时提出了具体的技术要求;在中药材规范化生产实施过程中指纹图谱 亦有较广泛的应用。 但是作为一项新技术，中药指纹图谱在实际应用中还面临许多问题，只有进一步加强中药材种植加工和中成药生产贮存的规范化;中药化学成分和中药药理研究的系统化和标准化;以及技术上多学科的渗透，才能保证中药质量的稳定，进而保证中药指纹图谱的建立和实施。 编辑本段DNA指纹图谱分析 实验目的 1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程 DNA指纹图谱分析 2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术 3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。 实验原理 1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同 人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。 DNA指纹的图像在X光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。DNA指纹图谱，开创了检测DNA多态性(生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异)的多种多样的手段，如RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多态性)分析、串联重复序列分析、RAPD(随机扩增多态性DNA)分析等等。各种分析方法均以DNA的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA指纹图谱，由于DNA指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。 DNA指纹具有下述特点: 1(高度的特异性:研究表明，两个随机个体具有相同DNA图形的概率仅3×10-11;如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10-19。全世界人口约50亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。2(稳定的遗传性:DNA是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。分析发现，DNA•指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50%给子代。3(体细胞稳定性:即同一个 人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。 1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。我国警方利用DNA• 指纹技术已侦破了数千例疑难案件。DNA指纹技术具有许多传统法医检查方法不具备的优点，如它从四年前的精斑、血迹样品中，仍能提取出DNA来作分析;如果用线粒体DNA检查，时间还将延长。此外千年古尸的鉴定，在俄国革命时期被处决沙皇尼古拉的遗骸，以及最近在前南地区的一次意外事故中机毁人亡的已故美国商务部长布朗及其随行人员的遗骸鉴定，都采用了DNA指纹技术。 此外，它在人类医学中被用于个体鉴别、确定亲缘关系、医学诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记;在动物进化学中可用于探明动物种群的起源及进化过程;在物种分类中，可用于区分不同物种，也有区分同一物种不同品系的潜力。在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。 DNA指纹图谱法的基本操作: 从生物样品中提取DNA(DNA一般都有部分的降解)，可运用PCR技术扩增出高可变位点(如VNTR系统，串联重复的小卫星DNA等)或者完整的基因组DNA，然后将扩增出的DNA酶切成DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫星DNA探针与膜上具有互补碱基序 列的DNA片段杂交，用放射自显影便可获得DNA指纹图谱。 DNA指纹图谱试验 琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。 在基因的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液(一般为碱性)中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。 实验材料和试剂 1. DNA样品:犯罪现场DNA样品(CS)、嫌疑犯1 DNA样品(S1)、嫌疑犯2 DNA样品(S2)、嫌疑犯3 DNA样品(S3)、嫌疑犯4 DNA样品(S4)、嫌疑犯5 DNA样品(S5)。 2.化学试剂和溶液 (1)DNA样品反应缓冲液:100mM Tris，200mM NaCl，20mM MgCl2，2mM DTT，pH 8.0 (2)EcoR?限制性内切酶 (3)Pst?限制性内切酶 (4)电泳缓冲液(50×TAE) Tris 242g 冰醋酸 57.1ml EDTA(0.5mol/L pH 8.0) 100ml 使用时用蒸馏水稀释50倍。 (5)样品缓冲液(DNA sample loading dye) 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青 40%(W/V)蔗糖 (6)溴化乙锭(EB) 10mg/ml (7)琼脂糖agarose(电泳级) (8)DNA分子量标记物:Lambda Hind? DNA markers 3. 仪器设备和消耗品 电泳仪、电泳槽、样品梳、微波炉、水浴锅、移液器(10μl，200μl，1000μl)、离心管、一次性枪头(200μl，1000μl)。 实验步骤 1. DNA样品的制备 采集生物检测样本，在弱碱和螯合剂存在条件下进行组织匀浆，溶解细胞或细胞核膜;利用阴离子去垢剂和蛋白酶，在37孵化数小时，消化蛋白质分离 DNA;使用有机溶剂如苯酚、氯仿等除去残余蛋白质，萃取DNA;用乙醇或某些盐类从溶液中沉淀 DNA。 由于一般采集的样本中的DNA都有不同程度的降解，采用PCR技术扩增出完整的基因组DNA或者特定的高可变位点，以此制备出的DNA样品备用。 中药指纹图谱 百科名片 中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。 中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。 目录 简介 意义 特点 分类按应用对象分类 按侧定手段分类 特性 构建方法 分析、技术化学指纹图谱 色谱指纹图谱 X射线衍射法 核磁共振(NMR)指纹图谱 分子生物指纹图谱 数据挖掘指纹图谱的信息化 指纹图谱知识化 中药方剂指纹图谱智能数据库 技术应用 不足之处 研究现状简介 意义 特点 分类 按应用对象分类 按侧定手段分类 特性 构建方法 分析、技术 化学指纹图谱 色谱指纹图谱 X射线衍射法 核磁共振(NMR)指纹图谱 分子生物指纹图谱 数据挖掘 指纹图谱的信息化 指纹图谱知识化 中药方剂指纹图谱智能数据库 技术应用不足之处研究现状展开 编辑本段简介 以指纹图谱作为中药(天然药物)提取物及其制剂的质量控制方法，已成为目前国际共识，各种符合中药(天然药物)特色的指纹图谱控制技术体系正在研究和建立。美国食品药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料中提供色谱指纹图谱;世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定，如果草药的活性成分不明确，可以提 中药指纹图谱倡导者谢培山教授 供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致;欧共体在草药质量指南中亦称，单靠测定某种有效成分考查质量的稳定性是不够的，因为草药及其制剂是以整体为活性物质。色谱指纹图谱尤其是薄层色谱的鲜明的指纹图谱是很有用的。国外指纹图谱的应用，目的在于解决成分复杂，有效成分不明确的植物药质量检测和产品批次间质量差异的问题。其中德国研制的银杏叶提取物制剂是一个突出的例子。他们应用指纹图谱制定了相应的标准，该图谱体现了制剂所含的33个化学成分(主要为黄酮类和内酯类)和各自的含量。经化学成分和药效相关性研究，发现约24%银杏黄酮和约6%银杏内酯组成的提取物具有最佳疗效。此外，采用“混批勾兑”法，可使最终产品质量稳定，指纹图谱重现性良好，含量浮动范 围为5%左右。 20世纪70年代我国已有学者尝试使用TLCS对中成药进行分析，因主客观条件的限制，技术和时机的不成熟，没有得到公认;20世纪90年代《中国药典》增设了中药化学对照品和对照药材，为中药指纹图谱的研究奠定了基础。随着色谱技术的迅速发展和检测能力的显著增强，为指纹图谱的研究和应用提供了良好的技术保证。目前我国已对中药注射剂做出了必须用指纹图谱进行检测的规定，同时提出了具体的技术要求;在中药材规范化生产实施过程中指纹图谱亦有较广泛的应用。 但是作为一项新技术，中药指纹图谱在实际应用中还面临许多问题，只有进一步加强中药材种植加工和中成药生产贮存的规范化;中药化学成分和中药药理研究的系统化和标准化;以及技术上多学科的渗透，才能保证中药质量的稳定，进而保证中药指纹图谱的建立. 编辑本段意义 中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。这也正好符合中医药整体学说。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真 正结合起来，有助于阐明中药作用机理。总之，中药指纹图谱的研究和建立，对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。 编辑本段特点 中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分 中药指纹图谱相关书册 系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。 中药指纹图谱(fingerprinting) 是借用DNA指纹图谱发展而来。最先发展起来的是中药化学成分色谱指纹图谱，特别是高效液相色谱(HPLC)指纹图谱。HPLC具有很高的分离度，可把复杂的化学成分进行分离而形成高低不同的峰组成一张色谱图，这些色谱峰的高度和峰面积分别代表了各种不同化学成分和其含量。由此可见，中药指纹图谱比DNA指纹图谱更进一步的发展在于:不但有特征的体现(各种化学成分的个数和相对位置——保留时间)可作定性鉴别使用，还体现了量的概念。峰的高度和峰面积表示了某个化学成分的含量，而各峰的峰高(或峰面积)的比值体现了各种化学成分间的相对含量;量的概念的引入、定性和定量的结合赋予中药指纹图谱更大的功效;中药指纹图谱不仅可以进行个体、某物种的“唯一性”的鉴定，还可以将其“量”的特征和其他体系挂钩。 因此，中药指纹图 谱不仅是一种中药质量控制模式和技术，更可以发展成为一种采用各种指纹图语来进行中药理论(复杂系统)和新药开发的研究体系和研究模式。 编辑本段分类 狭义的中药指纹图谱是指中药化学(成分)指纹图谱，广义的中药指纹图谱则可按应用对象、测定手段进行不同的分类。 按应用对象分类 中药指纹图谱可用于中药制剂研究、生产过程的各个阶段，按应用对象来分类，可分为中药材(原料药材)指纹图谱、中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱和中药制剂指纹图谱。如分得更细，还可包括用于工艺生产过程中间产物的指纹图谱。值得注意的是建立中药材化学指纹图谱必须考虑诸多因素的影响。中药品种混杂，历史上形成的同名异物、异名同物，以及同一物种受产地环境、不同有效部位所含成分的波动大等因素，给质量控制带来了很多困扰。因此对于某一种中药材的指纹图谱，需要有大量的数据积累，才能制定合理的相似性标准。 按侧定手段分类 中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药生物指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱，由于每个物种基因的唯一性和遗 传性，中药材DNA指纹图谱可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它对中药材GAP基地建设、中药材种植规范(SOP)、选择优良种质资源和药材道地性研究极为有用。 中药化学(成分)指纹图谱是指测定中药材所含各种化学成分(次生代谢产物)而建立的指纹图谱。虽然化学成分是次生代谢产物，受生物环境和生长年限的影响而产生个体间较为明显的差异，但植物的代谢具有遗传性，作为同一物种的个体在化学成分上也具有相似性(similarity)，可以用化学成分的谱图来建立指纹图谱。中药化学(成分)指纹图谱主要有光谱法和色谱法:如紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振谱(NMR)，薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)，以及各种联用技术。中药材化学指纹图谱对控制中药材质量具有更直接、更重要的意义。 编辑本段特性 指纹图谱应该具备指纹性，即:(1)专属性强。指所制订的指纹图谱应该是该 LT—II型全自动薄层成像系统 药材所独有的、能与其它药材相区别的，其反映的化学信息是具有高度的选择性的;(2)稳定性好。即中药材的指纹图谱应该是从某中药材的多批次中归纳出的共性，图谱中的共有峰或特征峰应相对稳定;(3)重现性好。所制订的指 纹图谱在规定条件下应能再现指纹特征(如共有峰数目、大小、位置等)，其误差应在允许的范围内。只有这样，所制订的指纹图谱才具有实用价值。中药指纹图谱是借助于波谱或色谱技术获得的中药(主要是植物药)次生代谢化学成分的光谱图或色谱图。 编辑本段构建方法 目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和X—射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点;中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验。因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC— MS和GC—MS等联用技术的应用，中药指纹图谱技术更趋完善。 1 薄层色谱法(TLC) 薄层色谱具有选用范围广,重现性好等优点，常用于中药各种成分的鉴别。用固定波长对薄层展开的各斑点作薄层扫描图谱比目测的层析图谱更为客观准确，因而具有更好的指纹鉴别意义。但由于受薄层板的质量和开放式层析系统等外界因素的影响，易引起一定 的实验误差。 2 气相色谱法 (GC) 气相色谱是封闭性色谱，受外界影响较少，具有高性能、高选择性、高灵敏度等优点，适合于药材及制剂中挥发性成分指纹图谱的研究。一般使用质量型检测器-氢火焰离子化检测器(FID)。钱浩泉等,5,用气相色谱法建立了高良姜及其边缘植物挥发油成分的指纹图谱。具体应用中多与质谱联用，不仅具有 GC 的高分离效能，而且兼备了质谱鉴定的高灵敏度和准确性。 3 高效液相色谱法 (HPLC) 高效液相色谱具有分离效率高，分析速度快，定量精密度高，检测器种类多，稳定性好等特点。不受样品挥发度和热稳定性的限制，比气相色谱法应用范围更广，样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测，是构建指纹图谱的主要方法之一。由于中药成分的复杂性，构建指纹图谱一般采用梯度洗脱，因为逐步提高流动相洗脱能力可获得较多色谱峰，提供更多指纹信息。在考察条件时，要对指标成分和非指标成分都予以考虑，由于药材中各种成分的吸收波长及对不同检测器的响应不同，在构建指纹图谱时也需要加以考虑。实际应用中多使用多种联用技术， 五味子水煎物指纹图谱共有指纹峰相对峰面积 充分利用各检测器的互补性，从不同角度反映药材及制剂的全貌，从各种图谱中得到结构信息。 4 高速逆流色谱法 (HSCCC) 它是目前国际上较新型的液,液分配色谱技术，利用相对移动的两种互不相溶溶剂，在处于动态平衡 的两相中将具有不同分配比的组分分离。已有报道,6,将 HSCCC应用于生物碱、黄酮、木脂素、蒽醌等天然产物的分离分析。具有分离效率高，溶剂用量少，无吸附，样品回收率高,重现性好和适用范围广等优点。 5 高效毛细管电泳法 (HPCE) 高效毛细管电泳技术是以高压电场为驱动，毛细管为分离通道，依据样品中各组分淌度和分配行为上的差异而实现高效快速分离的新型电泳技术。毛细管电泳的广泛应用取决于其多变的分离模式，几乎涉及分析化学中所有的分离对象，小到无机离子，大到蛋白质和高分子聚合物，也能够分析不带电荷的中性物质,7,。具有所需样品少、溶剂消耗少、抗污染能力强、可直接分析水溶液等优点。其中毛细管区带电泳 (CZE) 和胶束电动毛细管电泳色谱 (MECC) 是中草药分析中最常见的两种模式。但该方法的重现性有待提高。 6 紫外可见光谱 (UV) 紫外可见光谱反映不同化学物质的电子共扼体系特征，具有加和性，对于混合物的鉴别专属性差，分辨率低，故紫外光谱很少用于指纹图谱的构建。 7 红外光谱和近红外光谱 (IR) 红外光谱是由分子的振动,转动能级跃迁产生的光谱，红外光谱具有高度的特征性。近红外光谱法在中药质量控制方面有较好的应用前景。 8 核磁共振法 (NMR) 从纯有机化合物的核磁共振氢谱上可获得结构信息，包括各类质子的化学位移、数量核偶合关系。核磁共振谱具有高度的重现性和特征性，易于 解析和进一步研究，可评价药材和中成药质量的均一性和稳定性。 9 质谱法 (MS) 将中药提取液置质谱仪中进行电子轰击电离，可获得提取液中化学成分的质谱指纹谱，不同中药提取液所含成分不同，所得质谱图显示的分子离子峰及进一步，裂解碎片峰不一致，可供鉴别。 10 X射线衍射法 物质被X射线照射可产生不同程度的衍射现象，只要某一混合物的组成是恒定的，其衍射图谱可以作为该混合物的特征图谱。该法具有图谱指纹专属性强，信息量大,所需样品量小等诸多优点，X射线衍射法在动物类药材鉴定与辨别中有独特的优势,8,。 11 分子生物学法 (DNA) 利用聚合酶链反应从不同生物样品中人工合成 DNA片断，而这种 DNA片断的大小、数目可因不同的生物而异，故称之为 DNA指纹图谱。该技术具有重复性好、灵敏度高的优点。限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)是最常用的构建 DNA指纹图谱的方法，但该法费时费力，应用受到限制。随机扩增多态 DNA(RAPD)标记，可以在特异 DNA序列尚不清楚的情况下，检测DNA的多态性，这是构建中药指纹图谱的新方法，具有极好的应用前景。 罗志勇等,9,采用 RFLP技术,分析了人参、西洋参基因 DNA指纹图谱。[1] 编辑本段分析、技术 随着分离分析技术的发展，中药质量研究也由过去“四大鉴别”(基元鉴别、性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别) 发展到反映中药材全貌的指纹体系，即反映中药材的多元化学组成特性的化学指纹图谱和反映生物体 (除矿物、树脂类外) 特性的基因指纹图谱，从有效成分和遗传物质两方面实现对中药材的质量控制，为中药材以及中成药提供综合的和可量化的质量评价方法。 化学指纹图谱 中国中药指纹图谱的研究已有相当的基础，最早可以追溯到20世纪60 正在进行中药指纹图谱研究 年代，如采用薄层色谱、紫外光谱、红外光谱法来描述中药材主要成分的特征，这是早期的原始的指纹图谱，具有直观、在简单情况下容易比较差异的优点。随着分析技术的飞速发展和微电脑的广泛应用，基于化学计量法的中药指纹图谱的研究方法向高效、灵敏、专属、智能化、联用型的方向发展，高效液相、高效毛细管电泳、高速逆流色谱、核磁共振、近红外光谱等新兴分析技术的应用和各种数学分析方法的运用，为中药指纹图谱的研究与发展提供了广阔的前景。 紫外光谱指纹图谱 紫外光谱法是1995年以前指纹图谱常用的方法。由于不同中药所含的不饱和程度有差异，因而导致其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度亦有差异，以此达到鉴别效果。常用导数光谱及结合各种数学分析法来消除样品中的一些无关吸收，排除原图谱中的某些干扰。 红外光谱(IR )指纹图谱 红外光谱又称分子 振动转动光谱，是一种分子吸收光谱。当样品受到频率连续变化的红外光照射时，分子吸收了某些频率的辐射，并由其振动或转动运动引起偶极矩的净变化，产生分子振动和转动能级从基态到激发态的跃迁，使相应于这些吸收区域的透射光强度减弱。记录红外光的百分透射与波数或波长关系的曲线，就得到红外光谱。一般的红外光谱是对整个化合物分子的鉴别，比单纯的官能团的化学定性鉴别专一性更强。而中药材的红外光谱在本质上与纯化合物红外光谱不同，它是混合物中各个组分红外光谱的叠加。中药材各种化学成分只要在质和量的方面相对稳定，并且样品处理方法按同一要求进行，则其红外光谱也是应该相对稳定的。因此这样得到的混合物红外光谱应该是具有一定的客观性和可重复性。利用上述原理，不同混合物的红外光谱各主要吸收峰归属，只要在4000-400cm，范围内比较光谱差异即可。这种差异可以表现在三个方面:一是在某一波数处鉴别双方只有一方有明显差异;二是在某一波数内，鉴别双方的光谱中，吸收峰的形状和强度都有明显差异;三是“指纹区”，面貌不同。 近红外光谱法 近红外光谱法(NIRS)是一种用于鉴定有机物质十分有用的技术，是中红外光谱中C-H， N-H，O-H和S-H的共振吸收，具有高信息量。波长范围为780nm-2500nm，而且该光谱取决于粒子大小、多晶型、残留溶剂、湿度等等因素。因此待测物光谱的鉴定不可能直接与参比物质光谱比 较后确定，需要通过一系列样本的检测(必须预先知道样本中相关成分的含量或样本的定性归属)，运用化学计算学手段，建立样本与信息之间的数学模型。运用该模型即可以对未知样本(例如新近购进的原药材或新生产的成品等)进行辨别分析(给出结果:合格与否、含量多少等)。该方法为非破坏性方法，可实现产品的无损检测，具有检测速度快，操作简单，所需样品少，适宜于液体、固体、粘稠流体的分析及过程控制等优点。但是在进行定性定量分析中必须采用一定的数据处理，需要掌握一定的化学计量知识。 荧光光谱 中药注射剂常含荧光性物质，但因不同注射剂所含具体荧光性物质不同，同种注射剂又因厂家的具体配方的差异或制备工艺条件的波动，均会使其特征的荧光激发、发射光谱不同或其强度呈现差异;根据注射剂的荧光图谱的差异达到快速鉴别、认定和控制配方、工艺的目的。 荧光光谱不像红外光谱那样具有明显的指纹特征，但具有高灵敏度的显著优势，且差异更为一目了然，易于判断，因此，可以作为红外光谱指纹技术的一种补充，用于中药注射液的鉴别和认定，以及生产工艺的控制和成药热稳定性研究等。 色谱指纹图谱 色谱指纹图谱最实用、应用也是最广泛。中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式 之一。色谱指纹图谱最大的优点是具有分离的功能。 薄层色谱(TLC)指纹图谱 TLC为传统的定性、半定量分析方法，在中国“七五”、"十一五”及“ 中药 九五”公关课题中有大量采用薄层色谱法进行地道药材的定性鉴别。该法操作简单、分析速度快速、一次分析样品多，提供信息量大，用固定波长对薄层展开的各个斑点进行扫描，所得扫描图谱比目测的层析图谱更加客观准确，因此具有较好的指纹鉴别意义。其最大的缺点是重现性以及精密度差，所以在指纹图谱应用中受到限制，但可以作为中药指纹图谱研究的借鉴和补充。 气相色谱(GC)指纹图谱 中药指纹图谱技术 GC最适合于各种主含易挥发性成分药材及其制剂的分析，尤其是毛细管气相色谱法，分辨率很高，往往一个色谱可以分出百个成分。该法灵敏度高、分离度好，分析速度快，但是分析范围只是局限于低沸点成分，是指纹图谱研究的主要方法之一。 高效液相色谱(HPLC)指纹图谱 HPLC适用于成分复杂而不易分离的分析对象，具有分离效能高，灵敏度高，分析速度快，不需要气化，检测手段多等优点，是目前指纹图谱技术中用途最广泛的一种方法。 高速逆流色谱(HSCCC)指纹图谱 HSCCC是当前国际流行的新型的液-液分配技术。应用动态液一液分配原理，利用相对移动互不混溶的两相溶剂，在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的样品组分离。其特点是不用 固相载体作固定相，克服了样品吸附、损失、峰形拖尾问题。操作更为简便，容易掌握。对样品的预处理要求低，仅需一般粗提物即可。该技术的回收率高，能实现梯度操作，亦能重复进样，在中药质量分析控制研究中，尤其在指纹图谱研究中有较好的应用前景。 毛细管电泳(CE)指纹图谱 毛细管电泳(CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE)，以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的电泳分离分析方法，是近年发展起来的一种新的分离技术，是电泳技术和层析技术结合的产物，兼有高压电泳的高速高分辨率及HPLC的高效率等特点，其选择性与高效液相有很大的互补性。因此在指纹图谱研究方面的应用越来越广泛。 联用技术 由于中药复方制剂成分复杂，现行的各种单一测定方法给出信息少均无法建立较完善的指纹图谱，因而有人提出建立多维指纹谱尝试解决这一问题。所谓多维，即采用多种分析仪器联用的模式来测定指纹图谱，各谱图间相互补充信息，可对复杂供识品有更清晰完整的认识。目前最常用的是高效液相(或气相色谱)/二极管阵列检测器/质谱/质谱联用方式 (HPLC或GC/ DAD/ MS/ MS) 所得的多维指纹图谱。多维谱的建立既能较系统、较完整地解决中药复方制剂质量控制的难题，又为中药研究中缺乏标准品的难题提供了种新的解决途径。除了手性化合物外，从概率上要找出4个或以 上图谱信息完全相同的化合物几乎是不可能的。 X射线衍射法 当某一物质进行衍射分析时，该物质被X射线照射而产生不同程度的衍射现象。可分为单晶X衍射法与粉末X衍射法。物质组成、晶型、分子内成键方式、分子的构型等决定该物质产生特有的衍射图谱。如果该物质是一混合物，X-射线衍射图是各混合物各组分衍射效应的叠加。只要这一混合物的物质组成是恒定的，其衍射图谱可以作为该混合物的特征图谱。X -衍射指纹图谱具有指纹性强，图谱稳定可靠等特点。尤其是X衍射Fourier谱分析法可用于动物类药材的鉴定与伪品识别。 核磁共振(NMR)指纹图谱 核磁共振氢谱(1H-NMR)是鉴定有机化合物结构的重要的方法之一。它 中药指纹图谱的相关会议 可以获得化合物的包括各类质子的化学位移、数量、偶合关系等多个结构信息。如可以用一定程序获取植物类中药的特征性化学成分(或化学成分组)的总提取物，同时这些特征的化学成分的含量是相对固定的，则在规范的提取分离条件下，植物类中药的1H-NMR图谱与植物品种存在着严格的对应关系，没有混淆的可能性。图谱中的信号强弱反映了混合物中各组分的相对含量。在对特征总提物进一步分离得到单体后，通过结构鉴定和NMR研究，可以对指纹图谱中的各 特征谱线进行归属。 分子生物指纹图谱 随着分子生物学技术的迅速发展，DNA分子技术己越来越多的用于中药材品种鉴别的研究。分子生物指纹图谱是指采用分子标记技术得到的某一中药材品种的DNA指纹图谱。如对于人参、西洋参一类中药材的鉴别，用传统的方法(性状、显微、理化等鉴别方法)都显片面性，结果往往很模糊，因而其产地、生长年限、加工方式等因素与其性状和成分不呈很强的相关性，但应用分子生物学技术可以迎韧而解。 编辑本段数据挖掘 指纹图谱的特征信息的分析与提取又称作数据挖掘。中药指纹图谱形象地反映了药用植物物种具有遗传特性的次生代谢“共有特征”，又由于次生代谢中地域、生长环境、采收等多种不定因素影响，具有统计学中多元随机分布的“模糊性”。数据挖掘技术就是利用模糊数学、统计学、计算机技术等建立一种同时反映这两种特征的方法，即从中药指纹图谱数据信息库中提取隐含的及有潜在应用价值、最终可理解的模式的过程。它是发现和解析中药指纹图谱潜在信息的有力工具，目的是评价和控制中药质量及研究中药定量组效关系(quantitative composition-activity relationship，QCAR);包含三个过程; 中药指纹图谱 指纹图谱的信息化 指纹图谱信息化包括数据的获取和数字化。主要过程为针对某类样品和要求，确定合适的获得指纹图谱的分析方法(如色谱或光谱等)，建立整个分析方法的各种操作条件，进行测试，以获得不同样品的指纹图谱，即数据的获取。对所得指纹图谱进行分析，确定其数字特征。如对红外指纹图谱、可用峰的波数和强度作为其数字特征来表示某个峰。 指纹图谱知识化 获得信息化后的指纹图谱，需要研究如何来利用这些信息，即实现指纹图谱知识化。指纹图谱知识化包括信息解读、比较和判断，化学信息和药效信息相关性研究和信息的利用，即从大量指纹图谱数据中得到有关规律和知识。采用的方法有聚类分析、模式判别、关联度分析、人工神经网络等。 (1)聚类分析 聚类分析就是根据一定的规律和要求，对研究的对象进行分类。其基本思路是用“相似度”来衡量样品之间的亲疏程度，并以此来实现分类。通常将相似度大的样本归为一类， GoodSee-20E经济型薄层成像系统 相似度小的样本归为不同类。对于不同批次的中药样品其色谱指纹图经计算机快速辨识处理可依据样品批与批之间的相似度，确定中药样品批间的稳定性。 模糊聚类分析的基本步骤如下: A. 计算样品之间的相似度，并 将其构成模糊相似关系矩阵R。在由m个己量化的指纹特征组成的m维空间中，可用多种方法定义样品之间的相似度。如:相关系数法、最大最小法、算术平均最小法、几何平均最小法、绝对指数法、广义夹角余弦法、马氏距离法、欧氏距离法等。 B. 用上述方法建立起来的模糊相似关系矩阵R，只有自反性和对称性，而没有传递性，需要将模糊相似关系矩阵R改造为模糊等价关系矩阵R`，再进行分类。 C. 取一定M值，作等价矩阵的截矩阵，依据取值的不同得到动态聚类谱系图。 (2)模式判别 模式判别的基本思路是先建立标准样本模式的色谱指纹图谱，然后对未知模式(待鉴定样品)色谱指纹图谱进行计算机解析，依据其与标准样本模式的“隶属度”、判别未知模式的真伪及优劣。 (3)关联度分析 众所周知，衡量药品质量的终极标准是药效。采用化学分析方法控制药品质量是一种间接的质量控制手段。一般来说，西药是成分单一的化合物或化学成分明确的混合物，这些化学成分的性质和数量决定了药品的疗效，因此定性和定量地控制这些化学成分就可全面地控制药品的内在质量。但中药与西药不同，中药相当于一个大复方，其成分多而复杂，大部分中药的化学成分不完全明确，某些已知成分并不能代表中药的全部疗效，因此传统的质量控制模式即单一成分的定性与定量难以控制药品质量。就中药指纹图谱而言，也存在着指纹图谱与药效相脱节的问题。所谓 关联度，是指两个系统或两个因素间关联性大小的量度。关联度描述了系统发展过程中因素间相对变化的情况。如果两者在发展过程中相对变化基本一致，则认为两者关联度大;反之，两者关联度小。 (4)人工神经网络 随着模式识别理论的发展，人工神经网络的实践也得到了迅速的提高，在诸多领域都有广泛应用。1990年以来，人工神经网络在中药研究领域逐渐得到了应用。与经典模式识别相比，神经网络法更接近人脑思维过程，具有自组织性和容错性的优点。神经网络的结构和学习算法已有很多种，在中药指纹图谱中用到的主要有BP(反向误差传播)，自适应神经网络(ART)，自适应线性机(MBL)及模糊神经网络(FANN)。 (5)其他 实现指纹图谱知识化的方法还包括峰重叠法、夹角法、决策树，遗传算法及近邻算法等。近来又出现了几种相似度计算的方法。 中药方剂指纹图谱智能数据库 将从药材、中间体直至最终产品的大量指纹图谱汇集成数据库，采用数学方法比对等，就能确定各个峰之间的相关性，从而做到对整个生产过程实现“全过程质量管理”，而对基础研究和新药开发，则可实现全过程化学成分群的表征。再加上多维信息(HPLC/PDAD/MS/MS)的指纹图谱，对整个研究而言存在大量信息需要处理，建立指纹图谱智能数据库，就能较好的解决此类问题。 编辑本段技术应用 当前，中药指纹图谱技术在世界已成为一种发展趋势。首先是美国食品与药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图。世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定:如果草药的活性成份不明，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致。欧共体也将色谱指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制。中国专业技术人员对中药指纹图谱进行了较早的研究。例如广州市药品检验所、北京大学、沈阳药科大学、陕西师范大学、陕西中医药研究院等科研单位均已从不同角度、不同层面对中药指纹图谱技术作了深入研究，有些技术已在实践中得到了应用。 中药指纹图谱技术是符合中医理论及现状的较好的质量控制技术。因为它并不需要详细了解药物的具体活性成份信息，只需要了解个别指标性活性组分信息，以指标性成份峰作为标记，结合非指标成份进行比对，用来综合评价药物质量，既符合中医药理论的整体观点，也满足了对中药质量的可控、保证其疗效的要求。 运用中药指纹图谱和指标成份定量相结合的方式，既可以完善表述中药的整体性特征，又别于西药单一成份定量的质量控制模式，要根据中国的国情，建立自己的中药质量控制体系，评价体系，尽快建立一支高水准、高素质的科研院所和专业技术队伍，使中药指纹图谱技术得以推广和应用。 中药指纹图谱是 用多学科交叉、综合技术手段对复杂物质组成体系，质量稳定性进行评价的检测方法。又是分析科学、中药学、分离科学以及化学、生物信息学等二级学科交叉，综合应用研究的结果，是中药现代质量标准体系的核心技术之一，又是解决药品质量控制和监督这一 图谱 关键问题而采取的一种方法。通过相似性和相关性比对，发展质量变异和缺陷，从而全面特异地把握住中药的质量命脉。又为中药新药研发带来了一种崭新的研究模式，从整体综合的角度把握住了药物多靶点作用及针对性，为新药发现和快速筛选提供了思路和方法。 中药指纹图谱技术主要体现了信息获取、信息处理、信息挖掘三方面的内容。具体的讲，就是从中药物质基础的角度出发，运用现代分离分析科学的手段，获取中药化学指纹图谱。结合药效研究和相关物质成份的分离鉴定，经效谱关系研究，获取中药药效组分指纹图谱，并将已取得的指纹图谱用于中药材，中间体和中药复方制剂的质量控制，以及创新药物研究的实践中，最终解决中药质量评价的科学性和关键问题;解决制约中药发展，走向国际市场的瓶颈问题。 中药指纹图谱质控技术又与GAP基地建设，SOP质量管理息息相关。中药生产标准化是中药产业现代化发展的基础和关键，而中药指纹图谱技术又是中药现代化建设的主要技术手段之一，对中药“安全、有效和质量可控”，保证物种的延续，遗传基因的 稳定性，品种的地道性和药用价值起着至关重要的作用。 编辑本段不足之处 在实际应用中，中药指纹图谱还面临许多问题，主要有四点:一是中药来源的混乱无序，指纹图谱研究首先需要解决这个源头问题。中药材作为一种天然产物，受品种、产地、生长环境、种植管理、采收期、炮制加工方法等多种因素影响，难以控制，不同药材其指纹图谱有一定的差异，不利于指纹图谱的应用。因此在制定标准指纹图谱时，所选取的药材来源及成药的工艺应相对稳定，有足够的代表性，同时保证质量，才能保持标准指纹图谱的先进性和代表性;二是新技术的应用还不够前沿，对于中药这样一个复杂体系，需要解决分离与检测两大问题，而采用单一分离模式勉为其难，采用传统的检测手段或单一联用技术也易丢失大量信息;三是由于实验室条件，仪器设备的不同造成指纹图谱差异，从药材提取分离到分析检测全过程的标准化、规范化程度不够，影响实验室之间的重现性，难以推广。应在实验条件和仪器进行规范的条件下建立“标准图谱”;四是对大量信息的化学计量处理方法还不够完善，指纹图谱的特征性不够明确具体，指纹图谱与药理作用的相关性缺乏研究。在药理方面，隋因等用血清指纹图谱研究红花对豚鼠离体心脏的作用，为研究中药复方有效化学成分与药理学之间的联系，提供了思路。[2] 编辑本段研究现状 随着现代分析技术的发展，指纹图谱技术是当今国际公认的控制中药质量的质控模式。它能从原药材的栽培、引种，中成药生产工艺的规范与优化，到产品质量标准的制定提供全方位的质量保证。近年来国外对草药产品的质量评价也在提倡指纹图谱,1，2,，随着各种分析技术的创新和提高以及计算机应用技术的不断发展，世界各国对天然药物的了解和研究在不断深入，中药指纹图谱技术在国内外已成为一种发展趋势,其研究的方法和技术更趋成熟完善，成为国际公认的控制中药和天然药质量最有效的方法和手段。日本汉方药在20世纪80年代就采用高效液相指纹图谱控制质量,3,。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制，美国食品药品管理局允许草药保健品申报资料时提供色谱指纹图。世界卫生组织在 1996 年草药评价指导原则中也规定:如果草药的活性成分不明，可以提供色谱指纹图以证明产品质量的一致性。在英国、印度、加拿大等国家在植物药的研究中，也对指纹图谱十分重视。在许多国家的药典中，色谱指纹图谱已成为主要的分离分析方法。而我国药典的中药部分，这一分析技术还未占主导地位。在医药科技“十五”计划中，重点提出解决中药材质量规范化问题。2000年国家药品监督管理局颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，要求中药注射剂必须进行指纹图谱的研究，并 建立其相关的标准。规范了中药指纹图谱的研究，从而促进了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。而国外许多研究机构对中药指纹图谱的研究主要为建立指纹图谱与药效的相关性研究，是以中药理论和新药开发研究体系为主的模式。我国对中药指纹图谱的研究尚处于初级阶段，与发达国家相比有一定差距。目前主要为使用各种方法建立中药材及制剂的指纹图谱，以及对相应信息进行数字化处理，使其能够评价和控制中药材及制剂的质量。[3] 指纹图谱技术 (一)中药指纹图谱的定义、特点和分类 中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。 中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。 目前，中药指纹图谱技术已涉及众多方法，包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和X—射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC 具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点;中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测，且积累较丰富的应用经验。因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC— MS和GC—MS等联用技术的应用，中药指纹图谱技术更趋完善。 (二)中药指纹图谱建立的意义 中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。这也正好符合中医药整体学说。在此基础上，如果进一步开展谱效学研究，可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。总之，中药指纹图谱的研究和建立，对于提高中药质量，促进中药现代化具有重要意义。 (三)中药指纹图谱研究概况 以指纹图谱作为中药(天然药物)提取物及其制剂的质量控制方法，已成为目前国际共识，各种符合中药(天然药物)特色的指纹图谱控制技术体系正在研究和建立。美国食品药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料中提供色谱指纹图谱;世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定，如果草药的活性成分不明确，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的 一致;欧共体在草药质量指南中亦称，单靠测定某种有效成分考查质量的稳定性是不够的，因为草药及其制剂是以整体为活性物质。色谱指纹图谱尤其是薄层色谱的鲜明的指纹图谱是很有用的。国外指纹图谱的应用，目的在于解决成分复杂，有效成分不明确的植物药质量检测和产品批次间质量差异的问题。其中德国研制的银杏叶提取物制剂是一个突出的例子。他们应用指纹图谱制定了相应的标准，该图谱体现了制剂所含的33个化学成分(主要为黄酮类和内酯类)和各自的含量。经化学成分和药效相关性研究，发现约24%银杏黄酮和约6%银杏内酯组成的提取物具有最佳疗效。此外，采用“混批勾兑”法，可使最终产品质量稳定，指纹图谱重现性良好，含量浮动范围为5%左右。 20世纪70年代我国已有学者尝试使用TLCS对中成药进行分析，因主客观条件的限制，技术和时机的不成熟，没有得到公认;20世纪90年代《中国药典》增设了中药化学对照品和对照药材，为中药指纹图谱的研究奠定了基础。随着色谱技术的迅速发展和检测能力的显著增强，为指纹图谱的研究和应用提供了良好的技术保证。目前我国已对中药注射剂做出了必须用指纹图谱进行检测的规定，同时提出了具体的技术要求;在中药材规范化生产实施过程中指纹图谱亦有较广泛的应用。 但是作为一项新技术，中药指纹图谱在实际应用中还面临许多问题，只有进一步加强中药材种植加工和中成药生产贮存 的规范化;中药化学成分和中药药理研究的系统化和标准 化;以及技术上多学科的渗透，才能保证中药质量的稳定， 进而保证中药指纹图谱的建立。 【摘要】 概述了中药指纹图谱技术在中药制剂研究中对于投料药材甄别、炮制工 艺优化、监控生产工艺、质量控制等方面的应用，以及制剂谱效结合、指导新药研发方面的 应用，展望了指纹图谱技术在中药制剂研究开发应用中的前景。 【关键词】 中药指纹图谱技术 制剂研究 Abstract:This article reviewed the applications of fingerprint technology in preparation research of Chinese medicine, such as screening of the materia medica, optimization of processing technology, monitoring the production technology and quality control of the finished product. The combination of effect and chromatographic fingerprint, guidance in research and development of new drug were also reviewed. It gives a good prospect of application of fingerprint technology in preparation research of Chinese medicine. Key words:Fingerprint of traditional Chinese medicine; Preparation research 随着近年来“回归 自然 ”的潮流在世界各国日益盛行，中药与天然药物受到国际医药界 的广泛关注，成为研究开发的热点。虽然我国有几千年应用中药的 历史 ，但中药产业总体 上仍处于较初级的 发展 阶段，中成药类贸易逆差显著，缺乏高附加值产品和优势品种。缺 乏“符合中药特点同时又被国际社会认可的质量标准和规范化的质量控制体系”成为制约中 药 现代 化事业的深入发展、制约我国传统中药产品进入国际医药大市场的瓶颈之一。因此, 加强对中药制剂的质量控制,寻找一种切实可行的质控方法成为当前中药发展中亟待解决的 问题。应用指纹图谱技术对中药进行质量控制是当前我国中药研究的一个热点,也是中药未 来发展的一个方向。中药制剂，如何吸收指纹图谱技术的精髓，将其用于自身发展，是一个 值得思考的问题。本文就指纹图谱技术在中药制剂研究中的应用作一综述。 1 指纹图谱技术在中药领域的研究现状 1.1 中药指纹图谱的检测方法中药指纹图谱技术主要是指采用光谱和色谱等技术，获得 组分群体的特征图谱或图像，并结合 计算 机技术对所获得的资料进行分析，通过适当的数 据处理方法对图谱进行“过滤”和简化，获得专属、稳定、实用的特征数据，从而对药物的真 伪进行鉴别以及对药物质量进行控制。中药指纹图谱按测定手段分类可分为中药化学(成分) 指纹图谱和中药生物指纹图谱，而化学(成分)指纹图谱在中药制剂分析研究方面应用尤为广泛，根据在研究中所使用的具体方法与技术的不同，主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、高效毛细管电泳色谱法(HPCE)、高效逆流色谱法(HSCCC)、X射线衍射法(XRD)、X射线荧光光谱法(XRF)等。同时，联用技术是目前最受重视的手段,HPLC/MS，HPLC/UV，HPLC/NMC，HPLC/MS/MS等联用技术给中药分析带来了崭新的前景,指纹图谱也达到多维、多息阶段。 1.2 中药指纹图谱信息的处理方法中药指纹图谱的数字化可以 科学 地进行图谱的比实际应用中借助于化学计量学和计算机技术将数字化指纹图谱的数字编制成软件以供使较, 用。目前中药指纹图谱的计算机解析方法有人工神经 网络 法、欧氏距离、绝对距离、Minkowsky距离、相关系数法、峰匹配度及夹角余弦法等。这些方法都有各自的特点和应用范围，如何针对实际问题在实际应用中选用合适的相似度评价方法，使中药指纹图谱的评价更加科学、客观、准确，是亟需解决的问题。为此，学者们进行了相关研究。程翼宇等,1,根据指纹图谱色谱峰峰数弹性、峰比例同态性和峰面积同态性等3个指标组成的相似度测量评价方法，考察了以上相似度测度，并计算不同批次参麦注射液产品指纹图谱相似性，结果表明夹角余弦测度适于分析评价不同批次间药品质量的稳定性。聂磊等,2,则发现夹角余弦、相关系数、Nei系数较适用于中药品种的鉴定，对于组成中药用量的比例不变，但其总量变化的情况，距离系数和改进的Nei系数较能体现，故较适用于与总量有关的中药及中药材的质量分析。 2 指纹图谱技术在中药制剂研究中的应用 2.1 在投料药材真伪甄别、质量评价的应用投料药材的质量优劣可直接影响制剂的质量，因此建立完善、全面评价中药材质量的标准显得犹为重要。我国中药材种类众多，同名异物、一物多名的现象极为常见，这为中药材的真假甄别带来困难。加之药材市场假货横行,混淆品、伪品屡见不鲜，如果没有合适的评价中药材质量的方法，很容易影响中药制剂的质量，甚至造成临床用药的不安全性。针对这种情况，国家鼓励具道地性药材的地区建立中药材GAP基地，种植优质、规范的中药材，并号召中药行业进行中药材指纹图谱的研究，建立药材的指纹图谱特征库，以规范全国药材质量。迄今为止，大部分中药材已建立了指纹图谱评价方法，为制剂投料药材的真伪甄别、质量评价提供了依据。 2.2 在药材炮制工艺优化中的应用中药的药效往往在炮制后才能显现出来，不同的炮制方法对药物的性味、归经、作用、毒性均有影响。只有选择合适的炮制方法，把握恰当的炮制技巧，才能使中药的药效得到体现。传统的炮制标准大多依赖感官经验，缺乏严格、客观 的指标，对炮制前后药物化学成分的变化缺乏分析，对炮制工艺过程中的技术参数的控制缺乏科学的解释。由于中药成分复杂，配伍后的化学成分的变化就更加复杂。因此,很难找到确切的有效成分作为分析指标。指纹图谱技术的引入为炮制质量标准的建立、炮制工艺的指导提供了科学依据。许腊英等,3,采用RAPD技术对不同产地的茅苍术炮制前后进行DNA指纹图谱研究，发现不同产地的茅苍术生品DNA指纹图谱一致，炮制前后DNA指纹图谱发生了较大变化，几种炮制品之间也存在不同程度差异，说明炮制工艺对药材DNA分子鉴定有较大影响，可将DNA指纹图谱技术用于中药炮制品的质量标准研究。赫炎等,4,采用HPLC指纹图谱定量分析及多变量多因素分析，考察虎掌南星炮制加工中的矾水浓度、浸泡时间及矾水温度对虎掌南星饮片物质基础的影响，得到温度对虎掌南星指纹图谱有显著 ,考察制炭温影响的结论，提出应尽量在春秋季节的温度环境炮制虎掌南星。李娆娆等,5度及受热时间对中药槐花高效液相指纹图谱的影响，指出槐花制炭温度以(185?2)?，加热30 min为宜，为槐花炭炮制工艺的规范化研究提供了实验数据。中药制剂整体作用的发挥有赖于方中各中药饮片作用的发挥，只有有效控制中药饮片的质量，才能生产出质量稳定、安全有效的中药制剂。中药指纹图谱在实现对中药饮片进行科学、客观、公正、有效的质量控制及指导炮制工艺改革方面将起到越来越重要的作用。 2.3 在监控生产工艺中的应用生产工艺不稳定是引起中药制剂质量不稳定的重要因素之一，只有建立科学的生产工艺评价方法，指导工艺的优化，才能保证成品质量稳定。现今评价生产工艺的优劣往往以某单一化学成分的含量或药材浸出物的总量为主要指标，但此类指标均无法全面表征制剂半成品的组成特征。近年来学者们纷纷把目光投向指纹图谱技术，将指纹图谱技术应用于制剂工艺研究，利用指纹图谱的全面性与完整性追踪工艺过程，找出敏感环节加以控制，进而确保成品质量的稳定。王冬梅等,6,建立了贯叶连翘提取物的HPLC-UV-MS指纹图谱分析方法，选取提取物中的lO个主要成分色谱峰作指标，考察了提取工艺对有效成分的富集程度、工艺的批内和批间稳定性以及抗氧化剂与药材采收方法对提取物中金丝桃素类、贯叶金丝桃素类和黄酮类化合物等主要成分含量的影响。姚仲青等,7,采用指纹图谱监控赤芍总苷提取精制工艺，比较不同除杂方法对赤芍指纹图谱的影响，优选出氧化镁吸附除鞣质的处理方法。胡楚楚等,8,提出一种基于指纹图谱分析技术的中药提取工艺稳定性评价方法，通过单因素实验，获取实验条件(如溶剂倍数、溶剂浓度、提取时间和提取次数等)变化时的红参提取液色谱指纹图谱。比较并选取基于欧式距离计算方法的相似性测度计算指纹图谱相似度值，并且在所得实验数据的基础上，应用3次样条函数对相似度、工艺参数特性曲线进行拟合，实验结果表明以指纹图谱相似度为指标可定量考察样品 色谱指纹图谱与工艺参数之间的关系，较灵敏地表征了提取工艺参数波动导致的药材提取物整体质量变化情况，并可用于指导工艺参数的调整，优于传统的以单一化学成分含量为指标的工艺评价方法。苏薇薇等,9,采用指纹图谱技术监控田基黄注射液的生产过程, 根据生产中各化学成分的变化趋势，有针对性地对生产工艺中的敏感步骤进行严格控制,可使生产过程更加科学、合理。 2.4 在成品质量控制中的应用指纹图谱针对中药多成分的特点，能全面、系统地反映中药的整体特征，在中药制剂质量控制的应用中显现了很大的优越性。早在20世纪90年代，已有学者提出将指纹图谱技术应用于中药制剂质量的控制。2000年，国家食品药品监督管理局制定并发布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，率先在注射剂质量控制中应用指纹图谱技术，要求中药注射剂在固定中药材品种、产地和采收期的前提下，制定中药材、有效部位或中间体、注射剂的指纹图谱，确保中药注射剂的质量稳定、可控。随着注射液指纹图谱研究的展开，更多其它剂型的中药制剂也相继开展了指纹图谱研究，使中药制剂质量评价上升到了新的台阶。赵陆华等,10,建立了肾宝合剂的高效液相指纹图谱，8个共有峰体现了淫羊藿、补骨脂、蛇床子3种药材的特征，为全面控制肾宝合剂的质量提供了可靠的方法。邓文红等,11,用RP-HPLC法对灵芝原料、原料药、灵芝注射粉针、水针进行分析，确定了12个共有峰，确定了以上4种药剂的指纹图谱，为灵芝及其制剂的质量控制提供更为科学的依据和有效的鉴别方法。随着分析技术的多样化，不同分析技术被应用到中药制剂指纹图谱分析中，为指纹图谱研究带来了新的思路和方法。刘小平等,12，13,分别应用X射线衍射法、红外光谱法对著名方剂六味地黄丸进行了鉴定研究，建立了六味地黄丸的X射线衍射Fourier标准指纹图谱、红外光谱标准指纹图谱。孙国祥等,14,建立了复方甘草片的毛细管电泳指纹图谱，显示了毛细管电泳技术在复杂中药样品的指纹图谱分析中具有独到的专长和优势。随着研究的深入，指纹图谱除在中药制剂的质量控制中发挥举足轻重的作用外，还被赋予更艰巨的任务，在更多的中药研究项目中发挥作用。刘韶等,15,采用指纹图谱为考察手段，选择具有代表性的复方汤剂黄连解毒汤，对传统饮片汤剂与现代颗粒汤剂进行整体质量比较，发现样品之间相似性较好，说明颗粒汤剂代表饮片汤剂是可行的。 2.5 中药制剂谱效结合研究中药谱效学是立足在中医药 现代 化理论上，借助中药指纹图谱技术，建立指纹图谱中所有的成分与中药质量疗效的内在关系，作为质量控制标准的重要依据。谱效学研究，把中药化学成分与其作用产生的生物效应有机结合起来，使对中药质量的评价更 科学 、直观。多维多息谱等理论的提出正是谱效学理论 发展 的极致。目前， 谱效结合研究在中药制剂中的实践应用刚处于起步阶段，但有关学者进行的探索可给予我们提示和启发。宁黎丽等,16,“吴茱萸汤药效物质基础的方法学研究”，该研究通过对吴茱萸汤进行组方药量变化，在原方基础上按正交实验法组成9个不同配比的处方，同时对其进行高效液相色谱(HPLC)分析和镇痛与止呕两个指标的药理实验，对所得化学数据和药理数据进行逐步回归分析，确定吴茱萸汤的药效物质基础。宋宗华等,17,研究伤寒论名方“苓桂术甘汤”(茯苓,桂枝,白术,甘草)的配伍机制及药效物质基础，采用正交实验设计对方中组成药味进行药味与药量同时加减拆方，选择小鼠常压耐缺氧、对抗氯仿所致小鼠心律失常和利尿3项药理指标对所得16个处方进行药理实验，采用方差分析逐步回归分析(SREG)与典型相关分析(CCOR)将所得药理数据和组方药味及药量相关联，探讨复方苓桂术甘汤的配伍机制;同时对各处方进行HPLC色谱指纹图谱研究，将所得药理数据和各指纹峰的峰面积(即各化合物的含量)相关联，探讨复方苓桂术甘汤的药效物质基础，并确定桂皮酸、甘草酸和去氢土莫酸为质量控制指标。上述研究均是谱效学在中药制剂研究中的有意义的尝试，同时为阐明复方中药的药效学和物质基础提供了科学的思路。 2.6 为中药新药研发提供新思路、新模式谱效学发展继而形成了组效学。组效学是指通过药物信息学的方法进行信息的挖掘研究，去除和药效无关的化学成分，找出和药效活性真正相关的药效成分群(药效组分)，这样得出的中药药效组分指纹图谱就可以为建立中药新药创制理论体系提供化学研究、药效研究和信息科学相结合的新的途径和方法。中药指纹图谱包括信息处理、信息获取、信息挖掘3方面的内容。清华大学罗国安教授认为,18,，在中药化学指纹图谱、药效物质成分鉴定和中药药效活性测定的基础上， 充分利用现代化学与生物信息学研究的成果， 开展指纹图谱信息与药效活性信息的相关性研究， 以实现中药化学指纹图谱向中药药效组分指纹图谱的转化，从而建立中药指纹图谱组效学研究体系。针对研究药材、方剂的功效和所涉及的有关靶位或靶点，开展从整体、器官、细胞和分子生物学等不同层次和水平药 理学 研究，寻找能够较准确反映方剂药效或功能主治，并具备快速、准确、样品用量小的活性筛选指标，在建立快速中药体内外组分检测方法的基础上，寻找中药的药效组分检测方法的基础上，寻找中药的药效组分群，并建立中药药效指纹图谱，从而 总结 形成一套完整的中药药效组分快速筛选体系和方法。 3 前景展望 目前，中药注射剂已全面建立相应的指纹图谱质量控制体系，我们相信在不久的将来，指纹图谱技术将会应用于所有剂型的中药制剂，全面替代目前以单一成分指标控制制剂质量的模式，并在指导制剂工艺的改革、药材—中间体—成品的质量控制、贮藏条件的选择、中药新 药研究等方面发挥更大的作用。指纹图谱技术的发展，必定为中药制剂的研究开发带来更美 好的明天。