高效液相色谱法分析盐藻粉中维生素E

高效液相色谱法盐藻粉中维生素E (李利军) 一、 实验目的 1、 理解高效液相色谱法的基本结构及利用其进行物质定量定性分析的基本原理 2、 掌握利用液相色谱法分析盐藻粉中维生素,的基本原理及方法 3、 熟悉液相色谱仪的操作 二、 实验原理 (一)、 基本原理 被测样品与溶剂混合后在高压泵的作用下通过毛细管进入色谱柱，样品在色谱柱中作定向迁移运动并和工作物质发生互相作用，使多组份的样品逐渐分离为单个组份，再进入检测，通过对比与分析即可定性定量地鉴定样品的各个未知组份。 (二)、 液相色谱的结构简图 图1 高效液相色谱结构简图 现代HPLC(High Performance Liquid Chromatography, 高效液相色谱)按用途分为分析型、制备型、专用型，其基本部件相同。HPLC 仪由输液系统、进样系统、柱系统、检测和记录系统组成，高压泵、色谱柱和检测器为三大关键部件。 1( 溶剂贮存器和溶剂脱气 (1)简单的贮液器为500ml 试剂瓶，盖严，防溶剂挥发，瓶内泵吸液管端装10ul 不锈钢烧结滤头过滤溶剂。溶剂应预先过滤。 (2)流动相脱气 流动相进泵前必须脱气，尤其是水和极性溶剂，否则过柱以后，压力降低放出溶解的空气。气泡将影响分离效率、基线不稳使检测器灵敏度降低，甚至不能正常工作。脱气法:微型真空泵在线脱气、超声波脱气等。 2( 输液系统一高压泵 色谱柱用细粒填料，填充紧密，液体流动相粘度高，阻力大，必须高压输液。泵为关键部件，直接影响整个仪器和分析结果的可靠性。要求:A 输出压力高:一般为150~300kg/cm2压力，最高达500 kg/cm2;B 流量范围宽:0.1~10ml/min 连续可调;C 流量稳定: 流量恒定无脉冲,流量精度及重现性为+/- 0.5%左右;D 耐腐蚀: 耐各种有机溶剂、水和缓冲溶液;E 密封性好:泵室小便于清洗维修。 泵分为两类，恒流泵:柱阻力变化、流动相粘度变化、引起柱压变化而流量恒定，如往复柱塞泵。恒压泵:流量可随外界阻力变化而输出压力恒定，如装柱用的气动泵。HPLC 广泛采用往复柱塞泵，由液缸、柱塞、单向阀和驱动机构组成。泵流量不稳使保留变化，直接影响峰面积重现性和定量精度，使噪音变大，最小检测量变大。双柱塞泵流量平稳，输液精度高，流量精量+/- 0.1% ，流量准确度+/-1% 。双柱塞泵液缸容积很小(几微升~几百微升)适于梯度洗脱。为提供无脉动的准确流量，在输液系统中还需加一些辅助设备:过滤器、混合器、阻尼器、测压装置。 3( 进样系统 HPLC采用六通阀进样，重现性好，操作方便，易于自动化，大大提高了分析精度。注射器进样:绝对误差在5%左右，相对误差在1%。阀进样:误差均在1%以内。进样量由定体积定量管和平头微量注射器控制，注射器体积应为定量管体积的2~3倍。HPLC 柱可注入较大体积的稀溶液，进样体积在10~250ul。 4( 色谱柱 HPLC发展与柱技术的突破是分不开发。色谱柱是色谱仪的心脏，靠它实现分离。 柱要求:分离效率高、柱容量大、分析速度快。色谱柱由柱管、凝胶填料、密封环、过滤板等部件组成。色谱柱要耐高压，耐腐蚀，抗氧化密封不漏液，柱内死积小。对填料质量和装柱技术有严格要求。分析后，不能马上关机，应继续冲洗一段时间，保持柱内清洁。调流速时，逐渐增减柱压，压力陡然升降，易使柱内形成沟槽损坏。保护柱:在分析柱入口端加5~50mm与分析柱固定相相同的短柱，吸留过滤流动相及样品中的有害组分，可经常更换，起到保护延长分析柱的作用，加保护柱虽然柱效有所损失，但在经济和实用方面是有益的。 5( HPLC 检测器 连续地将柱中流出组分的含量随时间的变化，转变为易于测量的电信号记录为样品组分的分离谱图，进行定性定量分析。在液相状态，流动相和样品的许多物理性质十分接近，找到既通用又灵敏的检测器是困难的。 6( 液相色谱仪柱外效应的影响 在HPLC 中，样品在液体中扩散系数比气体中小4~5 个数量级，流速慢2~3 个数量级。因此，从进样到检测，除柱以外的任何死体积(进样器，柱接头，连接管，检测器)都导致峰加宽，柱致下降，因此尽量减少柱外死体积影响。 图2 高效液相色谱图示例 (三)、 高效液相色谱仪的应用 高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。 与试样预处理技术相配合，HPLC 所达到的高分辨率和高灵敏度，使分离和同时测定性质上十分相近的物质成为可能,能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展，有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。HPLC 成为解决生化分析问最有前途的方法。 由于HPL C具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用，流出组分易收集等优点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发展方向。液相色谱-质谱连用技术受到普遍重视，如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等; 液相色谱-红外光谱连用也发展很快，如在环境污染分析测定水中的烃类，海水中的不挥发烃类，使环境污染分析得到新的发展。 三、 仪器、试剂、样品 1、主要仪器:高效液相色谱仪 型号:岛津LC,10A 输液泵:LC-10ATvp 泵型:串联双泵塞 流量范围:0.001,9.999mL/min?2%或?2mL 压力设定范围:1.0,39.2MPa?10%或?1.0MPa 紫外检测器:SPD-10Avp 波长范围:190,600nm 光谱带宽度:8nm?0.1nm 漂移:2×10-4AU/h 噪声:?0.35×10-5AU 双波长检测:190,370nm或371,600nm的任意双波长 波长扫描: 1,5nm 5段设定，10,50nm/sec 色谱柱:Shim-pack VP-ODS 系统控制器:SCL-10Avp 脱气单元:DGU-14A 柱温箱:CTO-10ASvp 生产厂家:日本Shimadzu(岛津)公司 2、维生素E样品 DL-alpha Tocopherol 4-7783 Lot:LB29650 EXP:AUG/2006 STORAGE:FREEZE 100mg-Neat 595 North Harrison Road?Bellefonte，PA16823-0048 USA?Phone 814-359-3441 3、实验样品:内蒙古兰太生物工程公司杜氏盐藻粉 四、 实验方法 1、标准曲线法 与分光光度分析中的标准曲线法相似，首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。具体做法是:用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点，测定方法存在误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。 在测定样品的组分含量时，要用于绘制的标准工作曲线完全相同的色谱条件作出色谱图，测量色谱峰的峰面积或峰高，然后根据峰面积和峰高在标准工作曲线直接查出进入色谱柱中样品组分的浓度 知道进入色谱柱中样品组分的浓度后，就可根据样品处理条件及进液量来计算原样品中该组分的含量了。 2、单点校正法 当待测组分含量变化不大，并已知这一组分的大概含量时，可以不必绘制标准工作曲线，而采用单点校正法，即直接比较法定量。先配制一个和待测组分含量相近的已知浓度的标准溶液，在相同的色谱条件下，分别将待测样品溶液和标准样品溶液等体积进样，作出色谱图，测量待测组分和标准样品的峰面积或峰高，然后由式(1)直接计算样品溶液中待测组分的含量: …………(1) 式(1)中 cs………….... 标准样品溶液浓度; ci.…………... 样品溶液中待测组分浓度; As(hs)………. 标准样品的峰面积(峰高); Ai(hi)………... 样品中组分的峰面积(峰高); 单点校正法实际上是利用原点作为标准工作曲线上的另一个点。因此，当方法存在系统误差时(即标准工作曲线不通过原点)，单点校正法的误差较大。 本实验采用单点校正法。 3、色谱条件 色谱柱:Shim-pack VP-ODS 150×4.6mm 流动相:甲醇 流速:1.0mL/min 漂移:2×10-4AU/h 波长:290nm 进样量:10μl 五、 仪器基本操作 1)( 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 2)( 打开HPLC工作站(包括计算机软件和色谱仪)，运行主程序。 3)( 进入HPLC控制界面主菜单，点击File，选择Method，新建或设定色谱条件。 4)( 选择Control菜单下Preview Run，走基线。 5)( 待基线基本走平稳后，选择Control菜单下Single Run，设定Run information 后，点击Start按钮，进样。 6)(样品分离结束后，选择Reports菜单View下的Method Custom Report进行分析。 7)( 关机时，先关计算机，再关液相色谱。