基因克隆技术

　基因克隆技术 第五章 基因克隆技术 基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因。 基因克隆的一般程序为: 一、获取目的基因 目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法: 1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。 2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。 3、人工体外合成基因:由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。 4、PCR法扩增基因:PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。 二、选择适当的载体 按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是:(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子;(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选;(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。 1、质粒载体 质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点:分子相对较小(3~10kb);含松弛型复制子因而在 59 宿主细胞的拷贝数高;在复制子外适当位置有由多个单一内切酶位点组成的多克隆区，极有利于外源DNA片段的插入;具有抗药性及插入失活标记，可以从平板中直接筛选阳性重组子。但由于质粒分子太小，只能接受小于15kb的外源DNA片段的插入。因此，插入片段过大，会导致重组子扩增速度减慢甚至插入片段丢失。 2、噬菌体载体 目前使用的噬菌体载体主要有λ噬菌体、Cosmid及M噬菌体等。λ噬菌13体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其基因组为线状双链DNA分子。在λ噬菌体DNA(λDNA)的中间1/3处，是可被替换而不影响噬菌体生长的“非生活区”，此区的DNA可通过遗传工程技术由外来DNA片段所替代。λDNA作为载体的优点是:在体外可包装成病毒颗粒高效地感染大肠杆菌;载体容量大，可将23~25kb的外源DNA片段引入其内;筛选和保存较为方便。 M也是大肠杆菌噬菌体，其基因组为单链线性DNA分子。感染大肠杆菌后，此单链DNA13 转变为复制型双链DNA。克隆复制后，仍以单链形式包装成新的噬菌体释放到介质中。MDNA13分子中有一长507个核苷酸的小“非生活区”可以被外来DNA片段取代。M载体的主要优点是13重组的MDNA仍为单链结构，所以能方便地用于Sanger双脱氧法测定所克隆DNA片段的序13 列，或用于合成RNA探针的模板。M载体的主要问题是容量太小，当插入片段大于1000个核13 苷酸时就很不稳定，容易在增殖的过程中丢失。 结构上看成是一种人工构建的杂种载体，由噬菌体DNA和质粒DNA的某些Cosmid载体从 功能片段拼接而成，其转染细胞及病毒颗粒包装与λDNA相似，但在细胞内的复制则与质粒相同。与λDNA相比，Cosmid的主要优点是载体容量很大，插入DNA片段的长度可高达45kb。 三、构建重组体 DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下，连接到合适的载体DNA上，以便下一步转化之用。这种由两种不同DNA片段重新组合而成的DNA称重组DNA，简称重组体。连接方式有粘端连接和平端连接等多种形式。(1)粘端连接:用相同的限制性内切酶酶切目的基因和载体DNA分子，使之产生相同的粘性末端，在适当的温度下，两种DNA分子的粘性末端互补配对，再用DNA连接酶共价连接，成为完整的重组体。由于粘端连接具有很高的重组效率，在实验中为首选方法。许多情况下，目的基因上找不到适当的与载体上相同的限制性酶切位点。此时可通过在目的基因两端连上人工接头(含适当限制性酶切位点的合成DNA小片段)，再经酶切后即可得到所需的粘性末端。(2)平端连接:在目的基因和载体分子上找不到匹配的限制性酶切点时，可采用平端连接法。少数酶酶切后能直接产生平末端，多数情况下先酶切产生粘性末端，再通过补平反应后成为带平末端的分子。虽然平端连接有更广的适应性，但重组效率远不如粘端连接，阳性重组子筛选的难度也更大。 四、将重组DNA引入宿主细胞 现用原核宿主细胞以大肠杆菌(E?coli)为主。在基因工程中，由于重组DNA是体外制备的，将其转入宿主细胞后，可能会受到宿主细胞限制酶的切割。因此宿主菌必须是无限制基因(或作用)的突变株(r—株)，如常用的E?coli株HB101，DH等。一般将噬菌体DNA引入宿主细胞称为1 转染(transfection)，将质粒DNA引入宿主细胞称为转化(transformation)。 60 在导入重组DNA前，宿主菌用冷CaCl溶液处理，使其细胞膜透性增加而成为感受态细胞，2 以利于重组DNA分子的进入。 五、筛选与鉴定重组体克隆 两者相辅相成，互相验证。阳性重组体的筛选可利用载体上的遗传标志，包括抗药性(采用无抗药性的受体菌)、氨基酸合成酸系(用缺该酶系的异养型受体菌)和颜色反应(如α互补效应)等。另一种筛选方法是菌落杂交，将平皿上的转化菌落转印到硝酸纤维膜上，经碱处理使DNA变性，然后用目的基因的标记探针与之杂交，漂洗去多余的探针后进行放射性自显影，根据显影片上的斑点可判断含有目的基因的菌落。重组DNA的鉴定有多种方法，如限制性酶切图谱、DNA测 序，Southern印迹杂交等，可根据情况酌情使用。 实验十三 质粒DNA的小量快速提取 原理 在碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA都发生变性，但质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当用酸性的高盐缓冲液将pH中和至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型并溶解在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。上清液中的质粒DNA因不溶于70,的乙醇，可在加入乙醇后通过离到质粒DNA沉淀。 试剂 1、LB培养基 蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加重蒸水950ml，待完全溶解后，用1N NaOH调pH 2至7.0，补加重蒸水至总体积1000ml，151bf/in高压蒸气灭菌20分钟。 2、氨苄青霉素:100mg/ml 3、溶液?:50mmol/L葡萄糖;25mmol/L Tris—HCl(pH8.0);10mmol/L EDAT(pH8.0) 4、溶液?(临用时配):0.2mol/L NaOH，1,SDS 5、溶液?:0.5mol/L乙酸钾60ml;冰乙酸11.5ml;HO28.5ml 2 6、酚,氯仿:将酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/L Tris,HCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖0.01mol/L Tris,HCl (pH7.6)液层，4?保存。 7、氯仿,异戊醇:将氯仿和异戊醇按24:1的比例混合。 8、TE缓冲液(pH8.0):10mol/L Tris-HCl(pH8.0);1mmol/L EDAT 9、RNase 1mg/ml:称10mg RNase于Eppendorf管中，溶于1ml 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl溶液中，于100?加热15分钟，缓慢冷却至室温，此液为10mg/ml RNase浓度，应用时稀释至1mg/ml。 10、70,乙醇、无水乙醇 操作 1、将含有pBS-SK质粒的大肠杆菌XL-blue 10μl接种到10ml含氨苄青霉素(100μg /ml)的1 61 LB培养液中，37?振摇过液。 2、取1.5ml菌液转入Eppendorf管中，5000rpm离心1分钟，吸净上清。 3、将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液?中，剧烈振荡。 4、加200μl新配制的溶液?，盖紧管口，轻缓颠倒Eppendorf管5次，以混合内容物，禁止剧烈振荡。置冰浴中放置5分钟。 5、加150μl用冰预冷的溶液?，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液?在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，随后置冰浴中5分钟。 6、用微量台式高速离心机12000rpm 离心5分钟，将上清转入另一Eppendorf管中。 7、加等体积酚,氯仿，剧烈振荡1分钟后，12000rpm离心5分钟，将上层液转入另一Eppendorf管中。 8、加等体积氯仿,异戊醇，剧烈振荡10秒钟后，短暂离心12000rpm1分钟，将上层液转入另一Eppendorf管中。 9、室温下加2倍体积的无水乙醇，振荡混合，室温下静置5分钟。 10、12000rpm离心5分钟，去上清液，加1ml 70,乙醇，短暂振摇，然后再离心(12000rpm 分钟)。 11、除去所有上清液，待待残余乙醇挥发干净后，加30μlTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，加1μl RNase (1mg/ml)，37?保温15分钟，取出后即可用于酶切分析或置-20?保存备用。 实验十四 人外周血白细胞DNA制备 一、原理 从全血制备白细胞DNA，可用非离子去污剂Triton X-100直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，在反应体系中含一定浓度蔗糖，维护核膜内外的渗透压，以防止核膜破裂，通过离心等手段即可获得白细胞的细胞核。向核悬液中加入SDS破坏核膜，并使DNA从核蛋白中解离，经蛋白酶K，酚/氯仿抽提等常规制备DNA程序，即可获得白细胞DNA。Triton X-100直接法，操作简便，经济，DNA得率高，可用于临床。 二、试剂和器材 试剂 1、溶液?(pH7.6):0.32mol/L蔗糖;5mmol/L MgCl;1,Triton X-100;0.01mol/L Tris-HCl 2 (pH7.6)。 2、溶液?:75mmol/L NaCl;24mmol/L EDTA Na(pH8.0)。 2 3、10,SDS 4、蛋白酶K:20mg/ml，-20?贮存。 5、1×TE (pH8.0):10mmol/L Tris-HCl (pH8.0);1mmol/L EDTA- Na (pH8.0)。 2 6、0.9,NaCl 7、TE饱和重蒸酚(pH8.0) 62 8、氯仿/异戊醇混合液(24:1V/V) 9、10mol/L NHAC 4 10、无水乙醇(AR)，-20?贮存。 11、70,乙醇，-20?贮存。 以上试剂1、2、5、6、9均需高压灭菌，4?贮存备用。 器材 高速冷冻机;恒温水浴;离心机;电泳仪及电泳槽。 三、操作 1、取2~5ml外周全血，加9倍体积的预冷溶液?，振摇约5~10分钟至溶液均一透明，于 4?3000×g离心10分钟。 2、弃上清液，沉淀加0.9,NaCl适量洗涤3000xg离心10分钟。 3、弃上清，加5ml预冷溶液?悬浮核沉淀，加SDS至终浓度0.5,和加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，混匀，65?水浴保温5小时。 4、加1/2体积TE(pH8.0)饱和，混匀，旋转室温3分钟，再加1/2体积的氯仿/异戊醇，颠倒塑料管，轻轻充分混匀，于600×g室温离心3分钟，溶液分出两相，用大口塑料吸头吸取上层液于一洁净离心管中，反复抽提至界面清洁。 5、取上层液，再用等体积氯仿/异戊醇抽提1次，600×g室温离心3分钟。 6、取上层水相，加1/3体积的10mol/L NHAC和2倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀，纤4 维状DNA即从溶液中析出。 7、用大口塑料吸头吸出丝状沉淀物，用70,乙醇洗 涤1次，抽干，溶于适量1×TE(pH8.0)中，4?贮存备用。 8、电泳鉴定(见质粒DNA的限制性酶及电泳分析)。 实验十五 质粒DNA的限制性酶切及电泳分析 原理 限制性核酸内切酶能特异地识别和切割双链DNA中的碱基顺序，本实验中所用的pBS-SK质粒分子总长约2.9kb，经酶Hind?切割后，闭合环状质粒DNA即变成线性DNA分子。 不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在琼脂糖凝胶中有不同的电泳迁移率，因而可通过电泳使其分离。 试剂 1、限制性内切酶Hind? 2、10×酶切缓冲液 3、6×上样缓冲液 0.25,溴酚兰;0.25,二甲苯青;30,甘油水溶液 4、50×电泳缓冲液 称242g Tris碱，加HO 800ml，待完全溶解后，加57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA 2 (pH8.0)，用HO定容至1000ml。临用前用HO稀释成1×电泳缓冲液。 22 63 5、琼脂糖 6、溴化乙锭(EB) 10mg/ml:取EB 0.10g完全溶解10ml水中，避光室温保存。 EB有一定毒性，接触含EB的溶液时，务必戴上一次性手套。 7、DNA分子量:λDNA/Hind? 操作 一、pBS-SK的限制性酶切 1、取实验十四中制备的pBS-SK溶液5μl，10×酶切缓冲液3μl，双蒸水20μl，混匀; 2、加核酸内切酶Hind? 2μl (20u/μl)，轻敲管底使内容混匀，置离心机中离心数秒。 3、置37?水浴中保温1小时后，即可进行电泳分析。 二、质粒DNA酶切片段的电泳分析 1、制胶 先将电泳板两端用胶布密封，在距一端约1厘米处插入上样梳齿板，然后将电泳板水平置于实验台上。 称取DNA电泳用琼脂糖0.4g放入100ml三角烧瓶中，加40ml 1×TAE缓冲液，将烧瓶置微波炉或电炉上加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。待凝胶溶液冷却至60?左右时，加溴化乙锭(10mg/ml) 2μl，混匀后趁热将凝胶溶液倒入电泳板上。室温下待凝胶完全凝固(约需30分钟)，揭去两端胶布，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。 2、电泳 向电泳槽中加1xTAE缓冲液至刚没过凝胶表面。 取三支Eppendorf管，标号，如下表准备电泳样品。 1 2 3 分子量标准 未酶切质粒 酶切质粒 样品 10μl 3μl 15μl 6×上样缓冲液 3μl 3μl 3μl 双蒸水 5μl 12μl — 混匀后，依次全部加入三个点样孔中，注意加样器吸头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。 接通电源，调节电压至5V/cm，电泳1小时后，将凝胶板取出。在紫外灯下结果。 注:本实验使用的分子量标准为λDNA/Hind?，含有7个长度不等的DNA片段:23130bp; 9416bp;6557bp;4361bp;2322bp;2027bp;564bp;125bp。 64