生物传感器检测环境中痕量多环芳烃的

生物传感器检测环境中痕量多环芳烃的 生物传感器检测环境中痕量多环芳烃的研 1究进展 1221廖兴盛 庞娅 汤琳 李雪 1 长沙学院生物与环境科学系～湖南长沙410003 2 湖南大学环境科学与工程学院～湖南长沙410082 摘 要 多环芳烃,Polycyclic aromatic hydrocarbons～PAHs,是一类普遍存 在于环境中的难降解―三致‖有害有机污染物。如何克服传统方法的不足～快速高 效的检测环境中的多环芳烃引起了广泛的关注。随着生物科学和环境科学的发 展～生物传感技术在环境中的应用越来越广。一系列高选择性、高灵敏度的生物 传感器被用来检测环境中的有害有机物、重金属、病原菌等。运用生物传感技术 来检测PAHs～具有现实意义。文章简要列出了传统检测多环芳烃的方法及其缺 点～重点介绍了免疫生物传感器、酶生物传感器和微生物传感器等在检测环境中 痕量PAHs的应用情况～以及需要改进的问题。对该技术的发展前景进行了展望。 环境监测 关键词 生物传感器 多环芳烃 Study Progress on Determination of Environmental Trace PAHs by Biosensor 1221Liao Xing-sheng, Pang Ya, Tang Lin, Li Xue (Department of Biological Engineering and Environmental Science, Changsha College, Changsha 410003,China; Department of Environmental Science and Engineering, Hunan University, Changsha 410082, China) Abstract: Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are known to be a kind of toxic, mutagenic and carcinogenic pollutants in environment. How to determine PAHs quickly and efficiently has attracted great concern. Along with the development of biology science and environment science, biosensor technology is widely applied in environment field. A series of biosensors with high selectivity and sensitivity are applied to detect organics, heavy metals, bacteria and etc. And the determination of PAHs using biosensor has great importance. In this paper, traditional analytical methods for PAHs and their drawbacks are briefly stated. The immunosensor, enzyme sensor and geno-sensor for detecting trace PAHs and their problems to be resolved are discussed. Key words: biosensor; PAHs; environmental monitoring 基金项目:湖南省自然科学基金资助课题(11JJ6017);湖南省环保科技计划资助课题(湘环函 [2011]394号);国家教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT 0719) 作者简介:廖兴盛(1974,)，男，博士，讲师，主要研究方向为水污染控制技术与环境修复 工程，E-mail:xingsheng_liao@163.com 1 多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)广泛存在于环境中。一方面是各种矿物燃料(煤、石油、天然气等)、木材、纸以及其他碳氢化合物的不完全燃烧或者是在还原条件下热解形成的。另一来源是火山活动和自然界植 [1]物、微生物的合成。据报道:燃烧的香烟中就能检测到300种以上的PAHs。他们数量多、分布广、具有低水溶性、高亲脂性、辛醇-水分配系数高、难以降解、在环境中有一定残留水平的特点。随着苯环数量的增加，其脂溶性增强，水溶性变小，毒性变大，在环境中存在的时间延长，潜在危害也越大。作为一类持久性有机污染物，多环芳烃类化合物有较强的致突变致癌和致畸的效应。目前在人类已经发现的500多种致癌作用的化合物中，有200多种为PAHs及其衍生物[2]。并且它们容易通过食物、水、空气等介质进入人体，对人体健康产生很大危害。因此面对这些普遍存在且危害大的物质，如何突破传统方法效率低，检测设备要求高的局限，建立一种高效准确的监测和检测多环芳烃的方法变得尤为重要，生物传感技术的出现顺应了这种要求，并且为多环芳烃的检测打开了一个新的方向。 1 检测多环芳烃的传统方法 传统的检测环境样品中的PAHs包括样品的预处理和测定两个基本过程。样品的预处理目的是浓缩待测样品，同时尽可能的除去其他干扰物质。其处理效果直接关系着测定结果的准确度和精确度。常用的预处理方法有液-液萃取，固相 [3,4,5]萃取和超声波辅助萃取等。 液-液萃取是依据PAHs在不同有机溶剂中的溶解度不同来进行的，此方法原理简单，但是需要大量的超纯溶剂，多步转移，费时费力，重复性差。固相萃取的优点是快速简单，无溶剂乳化的现象，操作也安全，缺点是固相萃取柱的直径小，因而限制了流量的增大。利用超声波能强化溶剂的萃取效果的原理而发展的超声波萃取法也很常用。虽然该方法快速、省溶剂，但是对仪器设备和操作人员要求高，因而限制了它的广泛应用。 [6]目前PAHs的常规检测方法为高效液相色谱法(HPLC)。但是面对PAHs a]蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[j]荧蒽等，的同分异构体，如:如苯并[ 此方法的检测准确度明显下降。气相色谱法(GC)也是常用的方法之一。该方 2 法对轻PAHs分析有优势，就通常情况下，填充柱气相色谱用于分析轻PAHs(分子量小于300)。在分离重PAHs时，就需要高分辨率的色谱柱。色质联用法(GC-MS)可以对待测物质进行准确的定性和定量分析，对于气体中PAHs检测 3 [7]限可达pg/m，但是仪器设备复杂昂贵，而且只能分析具有挥发性和热稳定性好的物质。此外核磁共振色谱法、傅立叶红外转换法等也被用来检测多环芳烃。 以上这些方法有其各自的优点，但是也存在一些共同的缺点。主要是所用的设备昂贵，操作过程繁琐，样品常常需要繁杂、冗长的萃取、提纯、浓缩操作，色谱分离等步骤耗费时间，而且试剂用量大、费用高。尤其是在分析生物样品时，这类方法更显得有些不足。生物传感技术的出现和应用给多环芳烃的分析和检测带来了广阔的前景。 2 生物传感技术及其应用于痕量PAHs的检测 生物传感技术是利用生物有机成分(如酶、抗体、核酸、细胞、微生物等)作为敏感基元，对待检物质进行专一的识别，产生的信号经过信号传导器转变为可以输出并加以程序化定量的电信号、光信号，进而检测出待测物质的量的一项新技术。其检测依据是基于免疫学、酶学、生物化学、生物工程学、环境科学等多种理论。传感技术涉及电化学、压电学、光学、声学等多个领域。整个原理可简化为:分子识别?特定结合?信号传导和放大。 [8,9]基于生物传感技术的传感器种类繁多，一般从以下3个角度来进行分类:?传感器输出信号的产生方式，?生物传感器中分子识别元件上的敏感物质，?生物传感器的信号转化装置。具体如图1所示。 3 酶电化学测定装置电化学传感器酶传感器 场效应晶体管微生物半导体传感器微生物传感器 抗体或抗原光纤光敏二极管免疫传感器测光型传感器 细胞器热敏电阻细胞器传感器测热型传感器 动、植物组织测声型传感器SAT装置组织传感器 图1 生物传感器的分类 Fig.1 Classification of biosensor 生物传感技术在环境领域有着广泛的应用。酶传感器、免疫传感器、DNA传感器等各种传感器被用来检测环境中的有害有机物、重金属、病原微生物等。 [10]Zhang等 用FeO@SiO核壳磁性纳米颗粒结合磁性碳糊电极来固定漆酶，制342 -8作了酶生物传感器来检测堆肥样品中的对苯二酚。其检测下限可达1.5×10 [11]mol/L，并且该传感器的稳定性好，使用寿命长。Tang等利用伴刀豆蛋白A与糖蛋白的特异性吸附将辣根过氧化物酶层层吸附(该实验中为四层)在玻碳电极表面，制作了测定苯肼的可逆抑制型酶传感器。而从酶联免疫技术基础发展的免 [12,13,14]疫生物传感器广泛用于除草剂、杀虫剂的检测。而以核酸分子杂交为基础的DNA生物传感器，可以用来测定DNA的浓度，或者是识别部分碱基的排列顺序，确定微生物的种属，这是一般生物传感器所不具备的特征。 正因为这些生物传感器的应用和不断发展，该技术也逐渐成熟，基于该技术来检测环境中的多环芳烃的生物传感器也不断出现，此类技术的应用给PAHs的检测开辟了一个新的方向，下面将重点介绍。 2.1 检测PAHs的免疫传感器 [15]免疫生物传感技术用于检测环境中的PAHs研究较早。和酶生物传感器及基因生物传感器相比，检测PAHs的免疫传感器具有检测限低，检测种类多，制 4 作简单等特点。既可以直接利用抗原和抗体的结合反应引起的电信号或光信号的 [16]171变化来进行检测，也可以使用标记型传感器。其原理可用图2简易表示。 PAH抗原和抗体的识别 荧光检测 光信号 信 号 SPR检测 ,m质量信号 QCM检测 DPV,I-t检测 目标物浓度 电化学信号 图2 免疫技术检测PAHs示意图 Fig.2 Schematic diagram of detecting PAHs by immunosensor 免疫反应中能产生抗体的抗原一般是大分子物质。相对分子量低于1000的物质不具有免疫原性。多环芳烃本身不具备诱导产生抗体的能力，必须与蛋白质结合才可以诱导针对小分子物质的抗体应答。通常PAHs免疫传感器第一步是合成人工抗原。常用的载体蛋白有牛血清蛋白(BSA)，钥孔血蓝蛋白(KLH)，和 [16]171卵白蛋白(OVA)。目前针对PAHs的载体蛋白几乎都是BSA。因为它的物化性质稳定，不易变性，价廉易得，而且BSA的赖氨酸含量高，自由氨基多，可以提供多个交联基团。在不同pH和离子强度下BSA均有较大的溶解度，因 [17]而其适用范围大。PAHs的水溶性很差，如常温下苯并[a]芘在水中的溶解度为0.004-0.012 mg/L，但是在有机溶剂下，其溶解度大大提高。BSA在含有有机溶剂如吡啶、DMF等情况下，均可以和半抗原进行偶联且在偶联后依然保持可溶状态。 2.1.1 阵列型免疫传感器 多环芳烃类污染物在环境中通常是以多种物质共同存在，这就要求生物传感器的检测具有多样性，并且尽可能减少免疫应答中的交叉反应。阵列型免疫生物传感器的出现满足了这个要求。因为此类传感器结合了生物芯片阵列化的优点， [18]而抗原-抗体反应使得检测的特异性也高。Patricia Fernandez-Calvo实验小组运用多阵列竞争型免疫传感器测定了不同分子量的PAHs。通过把抗原捕获探针固定在载体上面，当定量的抗体和不同浓度的抗原物质反应后，再和抗原捕获探针发生竞争反应。以抗体为示踪剂，上面结合了荧光素标记的蛋白质，检测时，荧光强度越高，说明待测物质浓度越低，留下足够的抗体和捕获探针结合。该方法 5 对小分子量的PAHs，萘(naphthalene)、对羟基苯酚(4-phenylphenol)和4-叔丁基苯酚(4-tertbutylphenol)的检测范围为0.1-0.5 mg/L。其优点是可以同时测定多个样品。 2.1.2 非标记型免疫传感器 基于表面等离子体共振免疫传感器(Surface Plasmon Resonance简称SPR [19]immunosensor)来测定多环芳烃的报道也很多。Gobi K Vengatajalabathy构造了一个高灵敏度的SPR免疫传感器来检测苯并[a]芘(benzo[a]pyrene简称BaP)和2-羟基联苯(2-hydroxybipheny简称HBP)。其原理是把和BSA偶联的BaP、HBP通过物理吸附作用固定在金表面传感器芯片上，不同浓度的抗原—抗体结合物以流动注射进样，经过传感器表面。抗原抗体分子的相互作用导致传感器表面折射率的变化，从而引起共振角的变化，进而反映出待检测物质的浓度。该SPR传感器对BaP和HBP检测范围分别是0.1-300 µg/L和0.1-1000 µg/L。并且用胃蛋白酶溶液可以洗掉结合在金表面传感器的抗体，使该传感器在符合检测要求的范围类重复使用50次。类似的还有利用物理吸附把抗原BaP-BSA 固定在金膜传感芯片上，使用SPR作为信号传感器。其检测的线性范围为0.01-1000 µg/L，并 [20]且不受HBP的影响。另外一种非标记型的免疫传感器—压电晶体传感器也被用来检测PAHs。其原理是利用石英表面负载质量的变化,m与频率偏移,f的关系作为定量检测的基础。文献[21]中，先用硫辛酸(Thioctic Acid)修饰金膜石英晶体，清洗干燥后，再浸入溶解有N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中4 h。经过处理的石英晶体在PBST缓冲溶液下固定BaP-BSA抗原。采用竞争式免疫测定来检测BaP。这类免疫传感器的特点是其信号传导装置的灵敏度高，抗干扰性强，抗原-抗体反应引起的微小变化都能被反映出来。通过合适的进样装置，该类免疫传感器有望用于空气中多环芳烃的实时、自动监测。 2.1.3 标记型免疫传感器 在标记型生物传感器中，常采用酶、荧光物质和金属离子来标记抗原或抗体。 8-9[26]文献22，23，24对此有详细报道。Fahnrich等使用碱性磷酸酶标记的一次性的丝网印刷电极制作了测定菲(phenanthrene)的免疫传感器。用酶标记的抗体和没有标记的抗体与固定在丝网印刷电极上的抗原竞争反应，采用了三种竞争 6 模式:间接同暴露竞争法(indirect co-exposure competition assay) 、间接竞争法(indirect competition assay)和间接置换法(indirect displacement assay)来检测，碱性磷酸酶作用的底物为磷酸对氨基苯(p-amino phenyl phosphate)。其中效果最好的是间接同暴露竞争法，其检测的最低限为0.8 µg/L。而Meimaridou等人发展的基于彩色编码微球技术的流式细胞计数免疫分析法可以测定溶液和 [25]食品中的苯并[a]芘及其他多环芳烃类物质。同样的溶液条件下，该分析方法对苯并[a]芘的检测灵敏度是表面等离子共振免疫生物传感器的8倍，并且对多 [27]306环芳烃的选择性高，其测定结果可以与色质联用法媲美。此外，Liu等制作了高灵敏度的辣根过氧化物酶(HRP)标记的生物传感器检测苯酚类物质。目前关于荧光和金属离子标记的PAHs免疫传感器还没有报道。首先是因为用生物传感器来检测多环芳烃的研究本身就处于新兴阶段，其标记物质集中在常用的酶上。另外这两种物质和抗原或抗体的结合方法不如酶结合方法简单，实验的可操作性要差些。但是用荧光物质或者是金属离子标记的生物传感器具有检测限低， [23]7灵敏度高，重现性好的特点。和酶标相比，此类标记方法，不用担心标记物容易失活的问题，也不容易引起抗体活性的改变，是检测多环芳烃的免疫传感器的发展方向之一。 2.2 检测PAHs的DNA传感器 把DNA生物传感器应用于多环芳烃的检测，是该类传感器的新发展，也是 [28]运用生物传感器对PAHs进行深入研究的表现。Pandey等研究了一种DNA传感器来检测芳香族化合物。他们用固定的双链DNA分子层作为生物识别元件，当目标物存在时，溴化乙锭指示剂流动注射响应信号减弱，从而得到相应目标污 [29]染物的浓度信息。Ruey-an Doong等人构建了溶胶-凝胶阵列的DNA生物传感器来检测不同环数的PAHs，通过把含有溴化乙锭(ethidium bromide)染色的DNA溶胶-凝胶滴在载玻片上，制成了阵列生物传感器。依据PAHs和DNA之间发生的交互反应可以同时检测多种PAHs。随着人们对微生物降解PAHs的机理研究增多，与此相关的DNA生物传感器的研究也增多。研究发现不同微生物降解多环芳烃的途径虽然有差异，但是其中有些关键性酶是共有的，例如邻苯二 [30]酚2，3-双加氧酶。它是多环芳烃开环反应的一个重要酶。基于降解PAHs的关键性酶的基因序列的DNA生物传感器将会是一个研究热点。因为这类研究有 7 助于我们了解微生物降解PAHs的机理，包括何种酶参与，在什么情况下有利于微生物对此类酶的分泌等等信息。在筛选降解PAHs的微生物方面，DNA生物传感技术也大有可为，进行这类研究，有时候需要检测几个碱基的变异，因此DNA生物传感器的信号传导装置直接关系着结果的灵敏度。文献[31] 、[32]、[33]报道的基于光学和压电学的检测系统具有很高的灵敏度，可以达到µg/L。DNA生物传感器运用多环芳烃的研究将有利于我们更加深入地了解生物降解PAHs的机理，进而合理的控制微生物环境，促进PAHs的降解。 2.3 检测PAHs的酶传感器 基于酶对底物催化的酶生物传感器的研究最早。制作这类传感器的关键是如何有效的固定酶并保持酶活性。纳米颗粒、量子点、多壁碳纳米管、壳聚糖和脂质体的应用能较好的解决这一问题。 因为这些物质要么具有纳米粒子的特性如比表面积大，含有功能基团，也易于修饰功能基团;要么生物兼容性好，能提供 [27]307-308一个适宜的微环境来保持酶的活性。Liu等使用基于多壁碳纳米管的生物纳米多层膜来检测苯酚类物质。在该试验中，羧基化的多壁碳纳米在巴比妥酸盐(barbiturates)溶液中通过交换吸附被聚丙基胺的盐酸盐(polyallylamine hydrochloride简称PAH)包被，增加了多壁碳纳米管的水溶性。在pH=8.0时，辣根过氧化物酶(HRP)带负电，PAH-MWNTs带正电荷，在聚苯乙烯磺酸(PSS)溶液中，(PAH-MWNTs/HRP)n通过层层组装(layer-by-layer(LBL)assembly)固定到处理过的金电极表面，构成了用于测定一系列酚类物质的酶生物传感器。该研究还发现不同取代基的苯酚类物质的响应灵敏度不一样。其敏感性为NH >OH>CH >Cl>NO，与他们的电子转移能力成正相关。 232 检测多环芳烃的酶生物传感器，其检测对象多为PAHs降解过程中的中间产物如酚类物质、水杨酸等等，而直接以多环芳烃为底物的酶生物传感器还未曾见报。虽然研究发现锰过氧化物酶(manganese peroxidase)在双氧水和氯离子存在 [34]的条件下可以催化荧蒽 (fluoranthene)、苯并[a]芘。发现苯并[a]芘、1,2-苯并[a]蒽对苯醌还原酶2(EC=1.10.99.2)有抑制作用，20 mmol/L的苯并[a]芘对其 [35]抑制率可以达到90%。但是目前基于酶生物传感器用于PAHs的检测报道很少，主要是因为酶对多环芳烃的催化以及PAHs对酶的抑制作用及其机理还不清楚，并且已知的酶的获取不是很方便，他们多为生化酶，商品化产品少，价格昂 8 贵。但是随着对与PAHs相关酶及其相互作用的研究的增多，用酶生物传感器检测多环芳烃的应用会越来越多，其实际应用前景也很大。 2.4 检测PAHs的微生物传感器 环境中存在很多降解PAHs的微生物。如芽孢杆菌属(Bacillus)、分枝杆菌属(Mycobacerium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、鞘氨醇单孢菌属(Sphingomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、假单孢菌属(Pseudomonas)和黄杆菌属(Flavobacterium)等细菌以及白腐真菌(White rot fungi)。很多细菌能以低分子量的PAHs(小于4个环)作为唯一的碳源和能源。在降解PAHs的过程中，可以产生一些发光物质，因此可以根据产生的发光物质的浓度来检测多环芳烃。P.Gavlasova等人利用假单孢菌(Pseudomonas sp. P2)在降解联苯的过程中产生 [36]一种黄色的物质，在λmax=398 nm处来测定它的峰值，以此作为定量的基础。该传感器方法新颖，对某种多氯联苯的检测限为0.5 mg/L，并把它用于矿物油和土壤中的PAHs的检测。Sayler和他的合作者利用萘降解代谢途径中的nah操纵元 [37]和发光基因lux融合，构建了对萘有特异检测效果的微生物传感器。 由于多环芳烃能对微生物产生毒害作用，于是可根据毒害作用效应构建生物传感器来检测PAHs。常见的是依据多环芳烃对发光细菌发光强度的抑制作用来 [38]检测多环芳烃的毒性和浓度。如张金丽用发光细菌(Photobacterium phosphoreum，T3 变种)来检测萘、菲、莹蒽、水杨酸、儿茶酚、邻苯二甲酸的毒性。浓度越高，其抑制细菌发光的能力越强，检测到的发光度也就越低。文献[39]中，把发荧光的细菌GC2溶到有玻璃珠子的琼脂介质中，然后固定到聚丙烯管子上，其检测系统为荧光检测仪。使用生物表面活性剂鼠李糖脂(rhamnolipid)来提取土壤中的菲(phenanthrene)，以提高菲的水溶性。该生物传感器对菲的最低检测限为2 mg/L。它的检测限虽然不如免疫传感器灵敏，但是用于对大气、土壤、和水中PAHs毒性的评定具有快速、简便的特点。文献[40]中报道了将固 [41]定荧光细菌作为传感器的敏感元件，对PAHs进行分类和监测。而最近，Hung等人将绿色荧光蛋白标记的细胞色素移植到斑马鱼体内，利用改造的鱼作为生物传感器对水体中浓度为0.02-0.08 μg/mL 的多氯联苯进行定量检测。因为多氯联苯可作为配体与芳香烃受体结合，通过与微生物体内的核酸类物质相互作用，刺激细胞色素1A1基因片段的表达，通过检测绿色荧光信号的强弱来反应多氯联 9 苯的浓度。和免疫生物传感器相比，微生物传感器的定量效果要差些。但是可以 较直观的了解PAHs的毒性，在环境毒理学方面的研究具有广泛的应用前景。3 结论 和传统的化学传感技术和离线分析技术(如HPLC或MS)相比，生物传感技术具有高选择性、高灵敏度、低成本的优点，能在复杂体系中进行快速在线连续监测。在环境污染物质检测上显示了巨大的优势。 用生物传感技术检测环境介质中的多环芳烃，省去了传统检测PAHs时复杂的样品预处理过程，大大提高了检测的效率。并且对设备的要求不高，可以达到要求的检测限甚至到ppb级别。目前该技术正朝着微型化、自动化、阵列化方向发展，以方便、快速的检测多个多环芳烃类物质。用生物传感器来检测环境中的多环芳烃，将会朝着自动进样系统，检测系统、数据处理系统集成化、一体化，构成可以实现自动采样、进样、分析样品、处理数据的智能型便携式监测仪，这对于掌握多环芳烃在环境的分布迁移，防治其对人类的危害具有重大意义。目前检测PAHs的生物传感器还有许多需要研究和改进的地方。首先针对免疫传感器的抗原合成还很有限，主要集中在一些常见的PAHs中，如苯并[a]芘、蒽、菲、萘等。如何有效的修饰功能基团(氨基、羧基、羟基等)到多环芳烃上，研发出灵敏度高、特异性强、稳定性好的高质量抗体技术还有待努力。分子印迹技术(Molecular imprinting technique)的出现可以促进这一问题的解决。还有一个不能忽视的事实就是很多PAHs在分子结构、分子量、电子密度等方面具有相似性，并且没有功能基团，这样导致的交叉反应(Cross reaction)使基于抗原-抗体反应的特异性有所下降。对于酶生物传感器，筛选合适的酶来催化PAHs，或者是选择合适的PAHs抑制酶的活性，是促进该类传感器发展的两个方面。此外，针对生物传感器本身而言，检测结果的重现性，以及实验装置的重复利用性也需要改进。虽然用生物传感技术来检测多环芳烃，目前还处于初生阶段，国内尚未进行相关研究，但是由于该分析技术具有传统方法无法相比的优越性(效率高、特异性强、成本低等)，在检测多环芳烃，分析降解多环芳烃的微生物以及多环芳烃的毒理学研究都可以发挥重大作用，因此该类技术的研究会越来越受关注，其作用也会越来越大。 10 参考文献: [ 1 ] Sanl，Raquel M O，Joseph L(GC/MS analysis of PAHs in single puff of cigarette smoke [J](Journal of analytical and applied pyrolysis，2003，66(1-5):155-163. 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