沙门氏菌检测方法研究进展

沙门氏菌检测研究进展 核心提示:畜禽饲用含有沙门氏菌的饲料，如果菌量达到一定数目，就可引起疾病或带菌，因此准确、快速地检测饲料中的沙门氏菌，对于防止畜禽和人类沙门氏菌污染具有十分重要的意义。传统沙门氏菌检测方法，由于其检测周期长、漏 畜禽饲用含有沙门氏菌的饲料，如果菌量达到一定数目，就可引起疾病或带菌，因此准确、快速地检测饲料中的沙门氏菌，对于防止畜禽和人类沙门氏菌污染具有十分重要的意义。传统沙门氏菌检测方法，由于其检测周期长、漏检率高、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的沙门氏菌检测方法。 1 对传统的沙门氏菌检测方法的改进 由于检测沙门氏菌的传统培养基选择性和特异性不能达到今人满意的效果，沙门氏菌在饲料中的检出率又较低，而柠檬酸菌属、变形杆菌等均可能对沙门氏菌的检测产生干扰，因此传统的沙门氏菌检测方法需不断改进，其改进内容主要集中在选择性培养基的选择上。如由于沙门氏菌具有可特异性地分解丙烯乙二醇产酸，使中性红指示剂变红的生化特征，在分离培养基中加入丙烯乙二醇、5一溴一4-氯-3一吲哚一β-D呋喃半乳糖，可实现对沙门氏菌的分离与鉴定工作同步进行，使沙门氏菌检测所需时间从常规方法的 4,6 d缩短至2 d;采用Salsyst培养基进行增菌后，在Rabah培养基上进行分离培养，可及用对沙门氏菌的快速检测，大大减少了检测中所需培养基种类，同时培养过程全部在37?下进行，操作简便;采用Salsyst增菌液，对热伤害沙门氏菌环恢复效果，比常规检测方法中采用缓冲蛋白胨水和四硫磺酸盐煌绿增菌液更好，使检测灵敏度得到较大的提高。 2 快速酶触反应及代谢产物的检测 快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将它们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，成为今后微生物检测发展的一个重要发展方向。据anafi等报道，沙门氏菌属(包括各亚属)均产生辛酯酶，这一性能是肠杆菌科除沙雷氏菌属外其它各属细菌所不具备的，因此可用来鉴别沙门氏菌与肠杆菌科其它属细菌。近来，Aguirre,Ruiz,anafi，Freydiere等用意大利Bilife公司的试剂“UAP Test”测试肠杆菌科细菌、假单胞菌属、气单胞菌属和类志贺氏邻单胞菌，该法对沙门氏菌有很高的敏感性和特异性，操作也十分简便、快速。中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN 0332,94即为用4-甲基伞形酮辛酯(UAP)试剂对沙门氏菌进行检验的方法。 3 免疫学方法检测沙门氏菌抗原或抗体的技术 3(l 抗血清凝集技术 早在1933年，Lanefield就成功地用多价血清对链球菌进行了血清分型。随着抗体制备技术的进一步完善，尤其是单克隆抗体的制备，明显提高了细菌凝集实验的特异性，可用于沙门氏菌的分型和鉴定，如以沙门氏菌属特异单抗HRP标记抗体为核心试剂直接ELISA试验，为沙门氏菌检验和诊断提供了新技术。扬州大学研制两株针对沙门氏菌属共同位的单抗 BS和 de7它们与 99,的沙门氏菌属内不同血清的沙门氏菌反应，在此基础上，建立了直接的ELISA方法，并构建了沙门氏菌快速检测试剂盒。 3(2 乳胶凝集实验 将特异性的抗体包被在乳胶颗粒上，通过抗体与相应的细菌抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。通常此法需获得细菌纯培育物，再将培养物与致敏乳胶反应。目前FDA认可的产 品有Batigen、Spetate、irsreen、 Serbat等，见表 l。 3(3 荧光抗体检测技术 用于快速检测细菌的荧光抗体技术主要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。间接法是在检样上滴加已知的细菌特异性抗体，等作用后经洗涤，再加入荧光标记的第二抗体。如研制成的抗沙门氏菌荧光抗体，用于750份食品样品的检测，结果表明，与常规培养法符合率基本一致 3(4 酶联免疫测试技术 酶联免疫技术应用，大大提高了检测的敏感性和特异性，现已广泛地应用在沙门氏菌的检验，如Salnella,TEK、 TERA、 BaTre、 Assurane、EQUATE等，见表1。应用酶联免疫技术制造的ini-Vidas全自动免疫仪，是用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高，速度快，可以在48 h的时间内快速鉴定沙门氏菌。 4 聚合酶链式反应(Plyerase hain reatin，PR)技术 PR技术原理为提高DNA探针的敏感性，可先将靶 DNA序列扩增，增加 DNA数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。1983年 illus和 etus发明了最基本的扩增 DNA或增加样品中特殊核苷酸片段数量的方法-聚合酶链反应即PR法。PR法建立在三步重复发生反应的基础上。?通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA;?退火延伸引物至特异性寡核苷酸上;?酶促延伸引物与DNA配对合成楼板，引物退火，变性DNA片段，引物杂交形成的模板可参与再次反应。溶液中核苷酸通过酶聚合成相互补对的DNA片段，并能重新裂解成单股DNA成为下次PR复制的模板。因此每次循环特异性DNA将以双倍量增加。典型扩增经过20,40次循环能引起100万倍的扩增。在PR反应中引人Taq聚合酶使反应得以半自动化和简便反应程序。用扩增DNA进行的PR反应具有无与伦比的优越性。 由于沙门氏菌血清型特别繁多(目前世界上已分离出近2 000多个血清型，我国也已发现了近百个血清型)，因此，对沙门氏菌的检测往往不能准确和灵敏，而 Xiaing Li(2000)，ARLA BURTSHER(1999)， Kapley A((2000)等利用 PR技术却能准确地检测出微量的沙门氏菌。 核酸探针(Nulear aid Prbe)的应用 (l 核酸探针 将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子核酸探针或基因探针。 (2核酸探针的类型 根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分成DNA探针或RNA探针，一般大多选用DNA探针;根据选用基因的不同分成两种，一种探针能向微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。这类探针检测的基因相当保守，包括大部分rRNA，因为它既可能在一种微生物中出现，又可代表一群微生物。 (3 探针检测技术中存在的问题 检测一种菌就需要制备一种探针，目前尚未建立所有致病菌的探针，尽管检测速度快，但要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养，任何一种方法不可能有 100,的特异性和敏感性，所以必须考虑假阳性和假阴性的问题。 沙门氏菌污染量小，常受应激损伤，不易恢复，现用检测方法得到阴性报告最少需4d阳性 报告还要延迟2,3d。研究检测沙门氏菌的探针难度大，因为它拥有2 000多个血清型， Fillal等人从染色体序列和构建的质粒文库中分离到一个适用于沙门氏菌检测的探针。它能和沙门氏菌而不和其他微生物及样品培养基发生非特异性反应。这种用同位素标记的探针，能识别350株不同的沙门氏菌。由于该方法最小检出量只有 1个细菌,25 g样品，所以需要增菌培养。 AA最近认可了Gene,Trak沙门氏菌比色分析法，见表1。这种探针标记物为异硫氰酸荧光素(FIT)，再用辣根过氧化酶标记抗FIT的抗体结合放大探针，在多聚腺苷酸尾部和多聚胸腺嘧啶侵染棒固相薄膜上杂交，对239株沙门氏菌的特异性检出率为 100,，假阳性率为 0(8,。 表1 美国FDA认可使用的沙门氏菌检测系统和试剂盒 类别 商品名称 分析手段 沙门氏菌 Autirbi,GNI 生化试验 自动检测系统 核酸杂交分析 GENE-TRAK 同位素 GENE-TRAK 比色法 免疫分析 Batigen LA Spetate LA irsreen LA elllex LA Serbat LA LA 1-2 Test Iun-Diffusin PATH-STIK Dipstik-EIA Salnella-TEK EIA TERA EIA Unique Dipstik-EIA Salnella-TEK EIA TERA EIA Unique Dipstik-EIA EQUATE EIA BaTrae EIA Assurane EIA Isgrid HGF 其它商品化 SRT ediu/tility 快速检测方法 Rabah ediu 和培养基 UAP 8,Esterase XLT-4 ediu 注:EIA，酶免疫分析;LA，乳胶凝集;HGF疏水格栅滤膜;UAP，4-甲基伞形酮酮辛酯(4-ethylubelifefylaprylate)。 6 沙门氏菌检测仪器及自动化系统 近年来，随着计算机技术的不断发展，对病原微生物的鉴定技术朝着微量化、系列化、自动化的方向发展，从而开辟了微生物检测与鉴定的新领域。最有代表性的是AS微生物自动分析系统，见表1。 AS为美国VITEK厂产品，属于自动化程度高的仪器，由7个部件组成应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质，可用于不同的用途，卡片用后可弃去。 操作时，先制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬液接种到各种细菌的小卡上，将其放入具有读数功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测培养基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受的生物编码。最后由计算机判定，打印出鉴定结果。 该套系统检测卡片为14种，每一种鉴定卡片要含有25种以上的生化反应指标，基本同常规检测鉴定，检测所需时间最长不超过 20 h。 7 其它沙门氏菌检测方法 IS,GRID检测系统(表1)是一种基于疏水性膜(HGF)的过滤系统。该系统通过使用这种含有1600个小方格的滤膜，来对微生物进行检测或计数。 首先，稀释的样品通过5 u的不锈钢预过滤器过滤，过滤掉可能引起微生物分析误差的样品残渣颗粒。 然后，样品通过流水的滤膜过滤。再将滤膜放在特异性的琼脂培养板上培养，以检测目标微生物。培养完成后，在膜上检测目标微生物，并阳性区域的数量。 滤膜不会染上琼脂培养基的颜色，从而很容易地区别微生物，并进行鉴别和记数。此方法快速简便，重复性好，而且，除沙门氏菌外，还适用于大肠杆菌157:H7、酵母、霉菌、大肠菌群及大肠杆菌的检测和计数。