氨基酸/LDH纳米复合物新型药物剂型的研究分析

氨基酸/LDH纳米复合物新型药物剂型的研究分析 摘要:本实验为克服氨基酸药物在体内生物利用度低～无法发挥应有作用的缺点～利用 LDH纳米材料～使用纳米插层技术～制备出氨基酸/LDH纳米复合体～从而得到一种新型药物剂型。本实验利用了离子交换法将缬氨酸,Val,和组氨酸,His,两种氨基酸插入到LDH中～并对得到的复合体进行了进一步的表征。X射线衍射、红外图谱、热重分析以及透射电镜的结果都表明～ Val能插入到LDH中～而His则无法插入～并且插层的Val可利用Na CO从Val/LDH复合体中洗脱了下来, 23 因此～我们可以将Val/LDH复合体作为制备氨基酸/LDH纳米复合体等以及其它纳米复合体药物的前驱体。同时～利用Val和His不同的插层能力, 可利用此方法将Val和His这两种氨基酸进行分离～从而得到了一种新的氨基酸分离方法。 关键词:层状双氢氧化物,LDH,～纳米复合体～缬氨酸～组氨酸 前言: 医药是氨基酸相对用量不大但品种最多的一个部门～目前世界上用于药物的氨基酸及氨基酸衍生物的品种达100多种。洛斯氮平衡理论的确立与人类发现在正常代谢组织蛋白中缺乏某一种即会导致整个有机体代谢紊乱～使氨基酸成为维持人体营养和治疗很多疾病的医疗药物。氨基酸在医药行业的应用包括氨基酸作为蛋白质的基本组成单位～ 1 直接参与生物体内的新陈代谢和其他生理活动～可用作营养剂、代谢改善剂、抗溃疡、防辐射、抗菌、治癌、催眠、镇痛、以及为特殊病人配制人工合成膳食等。氨基酸药物世界年总量现已达4至5万吨～作为专门疗效的氨基酸及其衍生物产品有数十种～如治疗氨中毒、肝昏迷的谷氨酸、精氨酸,治疗消化道溃疡的组氨酸、谷氨酰胺,治疗肝脏疾病的天冬氨酸、精氨酸、蛋氨酸,治疗心脏疾病的牛磺酸、组氨酸、天冬氨酸,治疗支气管炎及肺气肿的半胱氨酸,可增强免疫能力的苯丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸等等。 另外氨基酸衍生物作为治疗药用于临床目前相当活跃～无论在治疗肝性疾病、心血管疾病～还是溃疡病、神经系统疾病、消炎等方面都已广泛使用～用于治疗的氨基酸衍生物不下数百种。如4-羟基脯氨酸在治疗慢性肝炎、防止肝硬化方面都很有效。氨基酸衍生物还可作为抗生素和抗菌增效剂～广泛用作活性剂和防腐剂,而且氨基酸衍生物也已广泛用作抗肿瘤药物～如苯丙氨酸芥子气～L-缬氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸与苯二胺氮芥共结合物等以氨基酸作为载体的抗肿瘤药物, N-磷酸乙酰-L-天门冬氨酸是一个天门冬氨酸转氨甲酚基酶的过渡状况抑制剂～利用这个抑制剂可中断嘧啶核苷酸的合成途径达到抗肿瘤目的。 然而～氨基酸药物具有它的局限性, 在体内稳定性差、吸收不佳、半衰期短等. 为解决氨基酸药物的缺陷～本实验了氨基酸/LDH纳米复合体, 可提高此类药物的生物利用度。 2 层状双氢氧化物LDH是由带正电荷的金属氢氧化物层和层间填充带负电荷的阴离子构成的层状化合物. LDH具有特殊的结构和性质,是一种在吸附、离子交换、催化和功能助剂等方面具有巨大潜力的新型无机功能材料。由于其具有独特的层状微孔结构和阴离子的可交换性, 且它在催化、吸附、医药等方面的应用, 故一直受到人们的关注. 特别是近年来, 以LDH为先躯体, 使用同多或杂多含氧阴离子与其交换而嵌入层间, 可获得大层间距的高活性、高选择性的新型层柱状催化材料, 这一研究已成为催化领域的热门课题.近年来,更深层次的研究主要集中在层间插入特定的无机、有机离子或聚合物而制备具有优良性能夹层纳米复合材料.如研究发现,,,类生物分子能稳定存在于聚合物/,, ,, ,,,,,纳米复合材料中,而制成基因的贮存3 库。在医药方面对于纳米材料的研究～目前主要研究方向在于设计特殊的药物递送系统～以期增加药物对于标的细胞的专一性～并减少药物本身所引起的副作用。 Choy等(2004)利用层状双氢氧化物(layered double hydroxides, LDH)作为载体～递送抗癌药物methotrexate至人类骨肉瘤细胞(SaOS-2)中～可明显观察到药物所引发的细胞凋亡(apoptosis)现象 由于LDH对细胞无毒害作用～本实验利用它做为一种无机生物纳米载体～用以包埋功能性生物分子——氨基酸～从而得到一种新型药物剂型～使氨基酸的生物功能可以更加充分的发挥～克服普通氨基酸药物的易降解转化、所需剂量大、成本高等问题。 目前国内该方面的研究还并不充分～本实验的研究方法在一定程 3 度上开拓了提高药物作用效用的研究思路～具有一定的创新性～特别是对于聚合物氨基酸/LDH纳米复合体的研究与应用～前景非常广阔。 该新型药物剂型研究成熟～成为一种临床药物后～不仅可以提高药效～节省资源～降低成本～取得高的收益～更可以拓宽相关研究思路～有利于相似相关类药物制剂的研究与开发～有助于更快更高效地缓解病痛～甚至可以通过纳米材料,如LDH,的保护～使一些本来因会被消化降解等原因而不能或微弱作用于靶细胞的高效药物制剂,如虫草素,得以发挥或增强其药效～从而提高很多疑难杂症,如肿瘤,的治愈几率～从这一意义上讲氨基酸/LDH纳米复合物也可作为制备其它高效药物制剂,如虫草素/LDH纳米复合体,的前驱体。 聚合物纳米颗粒用于药物传递是现代药剂学发展的重要方向之一～纳米颗粒制剂具有普通制剂无法比拟的优点:缓释药物～延长药物作用时间,靶向输送药物,减少给药剂量～减轻或避免不良反应,提高药物的稳定性,保护药物～防止被体内酶降解,辅助核苷酸转染细胞等,有利于患者吸收～减少药物在其他健康细胞上的毒副作用～提高药物的疗效～降低制药成本等～上述优点也正是现代药剂学的主要目的。同时～纳米颗粒也为体内局部给药、黏膜给药和多肽类药物的口服传递等奠定了基础。纳米颗粒是一类极具开发潜力的新型药物载体。因此纳米技术运用在药物的运载体系上是现在制药界十分热点的课题～如果能够取得重大成果～对整个制药行业是一个革命性突破。随着纳米技术的飞速发展～纳米颗粒技术已经成功应用到临床疾病的诊断和治疗中～如利用肿瘤、炎症或感染部位的特殊病理特点及某些 4 组织的生理特点～可以用纳米颗粒诊断剂对多种疾病进行前期诊断和治疗。 实验试剂及仪器: 1、试剂: 硝酸镁Mg(NO).6HO 硝酸铝Al(NO).9HO 硝酸钠Na NO 氨水3223323NH.HO,含量为25-28%, 32 缬氨酸 组氨酸 2、仪器: (1) D/max-r AX型X-射线衍射仪,日本理学, (2) Nicolet 50X型红外光谱仪,美国Nicolet公司, (3) TEM-100?型透射电子显微镜,日本Jeol, (4) Perkin-Elmer DC/2C型差热分析仪,美国Perkin-Elmer公司, (5) SHZ-3型循环水真空泵,河南省巩义市英峪仪器厂, (6) MP 200A型电子天平,上海第二天平仪器厂, (7) 电热恒温鼓风干燥箱,湖北黄石市医疗器械厂, (8) JJ-1精密增力电动搅拌器,江苏金坛市江南仪器厂, QXJ超声分散仪,沈阳龙腾电子称量仪器有限公司, 实验方法: 1复合体的制备 ,1, Mg-Al-LDH的制备 a. 稳态法 5 将去离子水煮沸30分钟～N保护下冷却到室温～作为实验用水。 2 将32g Mg(NO).6HO,0.125mol,和23g Al(NO).9HO,0.0625mol,322332溶于125ml煮沸后的去离子水中～得到溶液a。将12g NaOH,0.30mol,和17g NaNO,0.20mol,溶于145ml煮沸后的去离子水中～得到溶液b。3 将b溶液臵于500ml的锥形瓶中～在N保护下搅拌15分钟～在N保护22和搅拌下～将溶液a滴加到溶液b中～在滴加过程中～不时检测混合液的pH值～并用2mol/L的NaOH溶液调节混合液～使pH值始终等于10～1小时滴加完～然后继续搅拌3小时～80?老化三天。 b. 非稳态法 将去离子水煮沸30分钟～N保护下冷却到室温～作为实验用水。 2 将30.77g Mg(NO).6HO,0.12mol,和22.51g Al(NO).9HO322332,0.06mol,溶于360ml煮沸后的去离子水中～配成混合盐溶液。再加入17g NaNO,0.20mol,～混匀。在N保护和搅拌下～滴加共沉淀剂6%32 的氨水至pH值为10。搅拌均匀后老化1h～抽滤～用5L煮沸后的去离子水洗涤。将抽滤好的胶在80?下进行胶溶8h。 由于非稳态法操作简单～本实验选择了非稳态法来制备Mg-Al-LDH。 6 图1 制备的LDH 图2 制备的LDH ,2,氨基酸插层 选择离子交换法将氨基酸插层到LDH中。 测得制备好的Mg-Al-LDH溶胶的固含量为8.5%。取溶胶1.475g～加水至25g～得到0.5%的分散体系～然后超声5分钟～使溶液混匀。分别将0.921gHis和0.937gVal加入到上述25g胶溶液中～使得生物分子的摩尔浓度为胶的1.5倍。溶解后～再超声5分钟～使溶液混匀。60?下放臵4天。 4天后～将溶液在9000r/min下离心10分钟～倒掉上清液～下层用蒸馏水洗涤两次。60?下烘干～得到氨基酸/LDH纳米复合体。 7 图3 制备的L-Val-LDH复合物 2.脱层 将氨基酸插层的LDH粉末溶解在100ml的25mmol/l的NaCO水溶23液中～放臵4天。4天后～将溶液在9000r/min下离心10分钟～倒掉上清液～下层用蒸馏水洗涤一次。60?下烘干～得到脱层后的LDH。 3.表征 测量LDH、氨基酸插层复合物及脱层后的LDH的粉末X射线衍射,XRD,图,测量LDH及氨基酸插层复合物的红外光谱,IR,图,做LDH及氨基酸插层复合物的热重分析,DTA/TG,图,做LDH及氨基酸插层复合物的透射电镜,TEM,分析。 实验结果及讨论: 1. XRD分析 8 图2. a). LDH; b). His-LDH; c). Val/LDH; d). Val/LDH脱层 的XRD图。 Fig.2 XRD patterns for a). LDH; b). His/LDH; c). Val/LDH; d). deintercalation of Val/LDH. LDH、LDH与His 和Val的反应物以及Val/LDH脱层的XRD分析见图2。由图可以看出～ Val插层进入了LDH层间～使得LDH层间距由0.83nm增加到1.22nm～增加了0.39nm。而His没有插层到LDH层间～LDH层间距没有发生变化。Val/LDH用Na CO脱层后～LDH层间距又从23 1.22nm变为0.83nm～说明Na CO能将Val从Val/LDH复合体中洗脱下23 来。 2. 红外分析 9 图3 a). Val; b). Val/LDH; c) His; d). His/LDH的红外图。 Fig.3 IR spectra of a). Val; b). Val/LDH; c) His; d). His/LDH. Val、Val/LDH、His及His/LDH的红外图谱见图3。Val的红外图 ,1,1谱中～在2949和2877cm处有C-H伸缩振动峰～在1564cm处为水的 ,1振动峰～在1506 cm处为C-O伸缩振动峰,图3a,。Val/LDH的红外 ,1,1图谱中～在3471 cm处为-OH的振动峰, 在2970 cm处为C-H振动 ,1,1峰～在1587 cm处为水的振动峰～在1509 cm处为C-O伸缩振动峰, ,1在1359 cm处为C-N伸缩振动峰～与Val的红外图谱有相对应的峰,图3b,～表明氨基酸已经插层到了LDH中～这与XRD结论相一致。His的 ,1,1红外图谱中～在3014和2867cm处有C-N伸缩振动峰～在1630cm ,1,1处为杂环振动峰～在1587 cm处为水的振动峰～在1498 cm处为C-O ,1伸缩振动峰,图3c,。His/LDH的红外图谱中～在3468 cm处为-OH 10 ,1,1-的振动峰,在1636 cm处为水的振动峰～而1365 cm 处为NO的伸缩3振动峰～与His的红外图谱没有相对应的峰～与纯LDH图完全相同～说明氨基酸没有插层进入LDH层间。 3. 热重分析 His 和Val与LDH插层纳米复合体TG/DTA曲线见图4。当插入氨基酸后～吸热峰向低温度移动～表明所得插层物的热稳定性降低。对于Val/LDH纳米复合体～其DTA曲线中出现3个吸热峰～相应热重曲线也出现三个失重台阶。第一个失重台阶在200~220?附近～是由LDH层片物理吸附水的去除而引起的。第二个失重台阶在240~260?左右～是LDH分子中脱羟基及氨基酸的降解过程～第三个失重台阶在310~400?附近～LDH分子中的剩余羟基的脱除过程(图4a)。对于His/LDH～其DTA曲线中出现2个吸热峰～相应热重曲线也出现两个失重台阶。第一个失重台阶在200~220?附近～是由LDH层片物理吸附水的去除而引起的～但降解率远小于Val/LDH。第二个失重台阶在240~260?附近～是LDH分子中脱羟基的过程(图4b)。Val/LDH的热重曲线中～三个失重台阶的总失重为46%～而在His/LDH的热重曲线中～两个失重台阶的总失重为37.8%～比Val/LDH少8.2%。这是因为Val/LDH中有氨基酸插入～而His/LDH中没有氨基酸插层。 11 图4 a). Val-LDH; b) His-LDH的热重分析图。 Fig.4 TGA data for a). Val/LDH; b) His/LDH. 4. 透射电镜分析 Val/LDH的透射电镜图如图5所示。LDH纳米粒子是边长为100-120nm的正六边形～Val与LDH作用后～层间距增大表明发生了插层反应～所得纳米粒子为不规则球体～球径在200~350 nm。说明Val插层到了LDH层间～修饰了LDH片层～但所得复合物仍保持片层结构。His与LDH作用后～纳米粒子的形状没有发生改变～仍是正六边形～说明His没有插层到LDH层间。 12 图5 Val/LDH的透射电镜图。 Fig.5 TEM photographs for Val/LDH. 5. 层间结构讨论 LDH、Val/LDH及Val脱层的层间结构图见图6。Val插层后～LDH的层间距增大到1.22nm～而LDH层片的宽度为0.48nm～所以Val在LDH层间的宽度为0.74nm。已知C-C键的长度为0.17nm～而Val的长度大约为4个C-C键的长度～约为0.68nm。由此可以认为Val在LDH层间是垂直排列的,图6b,。 (b) (a) -NO 1.22nm 0.83nm 3 13 - CO3 (c) 0.83nm OO--OOO OOSOOOOO3SO3 .96nmM 图6 a). LDH; b). Val/LDH; c) Val脱层的层间结构图。 Fig.6 schematic illustration of a). LDH; b). Val/LDH; c) deintercalation of Val/LDH. 实验结论: 在实验中～我们选用了缬氨酸,Val,和组氨酸,His,两种氨基酸～利用离子交换法将其插入到LDH中～并对得到的复合体进行了进一步的表征。X射线衍射结果表明～LDH层间距由0.83nm增加到1.22nm～增加了0.39nm～说明Val插层进入了LDH层间～且是竖直排列的。而 14 His没有插层到LDH层间～LDH层间距没有发生变化。Val/LDH的红外图谱与Val的红外图谱有相对应的峰～表明氨基酸已经插层到了LDH中～His/LDH的红外图谱与His的红外图谱没有相对应的峰～与纯LDH图完全相同～说明氨基酸没有插层进入LDH层间～这与XRD结论相一致。Val/LDH的热重曲线～三个失重台阶的总失重为46%～而在His/LDH的热重曲线～两个失重台阶的总失重为37.8%～比Val/LDH少8.2%。这是说明Val/LDH中有氨基酸插入～而His/LDH中没有氨基酸插层。电镜结果表明～Val与LDH作用后～层间距增大～所得纳米粒子由正六边形变为不规则球体～球径在200~350 nm～说明Val插层到了LDH层间～修饰了LDH片层～但所得复合物仍保持片层结构。His与LDH作用后～纳米粒子的形状没有发生改变～仍是正六边形～说明His没有插层到LDH层间。实验结果表明～Val能插入到LDH中～而His则无法插入～因此～我们可以将Val/LDH复合体作为制备其它氨基酸/LDH纳米复合体等以及其它纳米复合体药物的前驱体。同时～利用Val和His不同的插层能力, 可利用此方法将Val和His这两种氨基酸进行分离～从而得到了一种新的氨基酸分离方法。 讨论: 利用纳米科技可将生物降解性和生物相容性的聚合物与药物一起制成纳米药物～作为靶向药物制剂～直接导入病灶部位的器官、组织甚至细胞～达到提高药物疗效～降低毒性的作用,将纳米材料作为药物载体～可增加某些药物的胃肠吸收～提高其生物利用度,将纳米材料作为载体～可用于基因的输送和治疗,纳米材料作为组织修复、人 15 造器官等生物材料的应用也有很好的前景,另外～纳米材料在疾病的诊断和监测上也有广泛的用途。在上述领域中～纳米材料的研究进展很快～有的纳米材料已经成为产品～进入实际应用阶段,有的纳米材料已进入临床研究阶段,有更多的纳米材料正处于不同的实验研究阶段,不久的将来纳米材料会给人类带来惊喜。虽然跨越探索性研究与实际应用,尤其是静脉注射的靶向给药系统,之间的鸿沟仍然是纳米颗粒药物传递系统研究所面临的严峻挑战～但这一领域中每一个令人兴奋的进展都会鼓舞人们投入更多的精力。随着纳米科技和纳米生物材料的不断出现和完善～将给生物学领域带来新的变革和快速的发展。 16