内源性超氧阴离子自由基对食管癌Eca—109细胞癌基因表达？…

内源性超氧阴离子自由基对食管癌Eca—109细胞癌基因达？… 内源性超氧阴离子自由基对食管癌Eca— 109细胞癌基因表达,… 食时起千碍蠡勘恼爱秀相伺芝 盟璺垩匡堂堂塑』!!i盟iv塑!!,365 j一;67? 研究原着 内源性超氧阴离子自由基对食管癌Eca一109细胞癌基因表达的影响 ?R.7' jsLayw.obe1ey磊.医大学基础部geneexpress?.nsuperoxidedismutase 生物化学与分子生物学教研室,化学教研室西安 710033.RadiationResearchLaboratory.Universityof Iowa.USA) 美键词超氧阴南子白由基癌基因基因表选超氧 化耪歧化酶 中圈号Q26 摘要目的:观察内源性超氧阴离子自由基对癌基因表达 的影响方法:构建正,反义人MnSOD(soD2)真棱表达载 体+转^食管癌细胞Eca一109;通过升高或降低细胞内SOD2 的水平来增加或减少细胞内O一的清除从而改变细胞内 O一的水平;以RNA斑点杂交和免疫细胞化学方法检测癌 基因表达的变化.以流式细胞仪检测细胞周期变化.结果: 基因转^细胞井表达.转染SOD2基因细胞内s0D2水平 升高,Cu,Zn—SODISOD1)水平束变,细胞内Oi水平下降 49以上;kf2表达下调,p53,cHa—m表达轻度上调;流 式细胞仪检测S期细胞减少.转染反义SOD2细胞S0D2 水平降低.但SOD1活力水平却升高,因而总SOD水平增 加t细胞内O一水平也降低32以上}bcl一2,p53,vats表达 均上调.s期细胞数变化不明显.结论;?通过转SOD2基因 改变细胞内O水平的方法是可行的.但仍需改进}?细胞 内O水平的变化可影响癌基因的表达,而且由转染SoD2 基因引起细胞内O水平降低对Eca一109食管癌细胞的增 殖表现出抑制作用. Effectsofintracellularsuperoxideanionradicalon theexpressionofbcl一2,p53andc-Ha-rasinEca一 109esophagealcarcinomacells LIFH—Yangl,HUII-Iong—Xiang1?WANGCheng一 -,,A?GDuo—Ning.,odian.,LIdi口n— Jian,LarryW.Oberley DepartmentofBiochemistryandMolecularBiolo— gY?.DepartmentofChemistry,FacultyofPreclini— caIMedicine.FourthMilitaryMedica1University. Xi'an710033RadiationResearchLaboratory.U— niversityofIowa,USA 国家自然科学基金资助项目No39370191 李福洋,男.1969一O1—04生,江苏省徐州市^汉族.1997年7月第四 军医大学硕士毕业,硕士导师王戚济.现攻读生物化学分子生物学 寺业博士,电话(029)32zl616—75267 AbstractAim:ToinvestigatetheeffectsofintracellMarsu— peroxideanionfreeradicalontheexpressionofoncogene bcl一2,P53andc—Haras.Methods!Mammalianvectorsexf pressingsenseandanti—sensehumanM13_一SOD(SOD2)were constructedandtransfectedintoEca—lO9esophagealcarol— notrlacellsinordertochangeintracellularOi—levelspecifi callybyincreasingordecreasingtheintracellularSOD2Icy— e1.TheexpressionofoncogenewasdetectedviaRNAdot blottingandimmunohistochemicalmethod.andthealter— ationofcellcyclewasobservedviaflowcytometry.Results: Thegeneexpressionvectorsweretransfectedintocellsand expressed.InSOD2transfectedceils.intracellularSoD2 activityincreased5foldswhileSOD1keptunchangeable; intracellularowasdecreasedover49Itheexpression ofbcl一2wasdown-regulatedwhiletheexpressionofp53and c-Ha—raswertup—regulatedFlowcytometryassayshowed thehumherofS—phaseceilswasreduced.Inanti—sense soD2transfectedcells.intracellularSOD2activitywasal— mostreducedtozerowhilesoD1increased,whichresulted inincreaseofintracellulartotalsoDacti?itandtheintra— cellularOlevelwasdecreasedover32;theexpression of一2,p53andHawereallu口一regulated.andthe alterationofS—phaseceilsnumberwasnotobvious.Conclu- sion:?T0changeintracellularO一levelviatransfecting SOD2geneintocellisfeasible.but;tstillneedsfurtheri?_ provement.@A[terationofintracellularocanaffectthe expressionofbcl一2,p53andc-Ha—ra$inEca一109eel1.and thedecreaseofintracellularO—causedbySOD2gene translectiondisplaysinhibitoryeffectontheproliferationof Eta一109esophagealcarcinomaceils. 0引育 氧自由基是细胞需氧代谢的正常中间产物.有 许多生物学效应,与机体诸多病理,生理过程密切相 关_1].癌基因是细胞生长分化和凋亡等细胞生命活 动中一类重要基因,其表达变化参与对上述过程的 调节.为深入研究氧自由基生物学作用的分子机 理,我们观察内源性O一对6d一2,p53和c—H口一r口5 表达的影响.但是目前研究自由基生物学效应的方 法普遍采用化学刺激,上述方法的局限性在于:?较 多研究外源性自由基的作用;?化学药物的非特异 性作用,给结果的分析带来困难.SOD2(Mn—SOD) 是细胞内特异的0清除酶,定位于线粒体,而线 粒体消耗着细胞8O%以上的0,是氧自由基的重要 来源.本实验通过调节细胞SOD2水平,特异地调 节0水平,避免了化学方法的局限性.为自由基 366 生物学的深人研究开辟了新的方法和思路 1材料和方法 1.1材料pcDNA3一hSOD2,pcDNA3-neo由美国 爱荷华大学LarryW.Oberley教授和李健健博士 提供.PUC一19和HB101由本室保存.X—gal, IPTG,限制性内切酶DNA相对分子质量标准, DNA缺口标记盒,MTT均购自华美公司.Lipofec— tamine,G418及RNA体外转录试剂盒均购自东方 生物制剂公司.RPMI一1640由Gibco生产}小牛血 清(FBS)由四季青生物制品公司生产;f~t--32P—dATP 及a一P—UTP购自北京亚辉公司.SOD活力测定 试剂盒由南京建成生物制剂所提供.Eca一109食管 癌细胞株由本校唐都医院姜涛博士提供. 1.2方法 1.2.1SOD2正,反义表达载体的构建和鉴定正 义表达载体由Oberley教授和李健健博士构建,命 名为peD-LhS,反义表达载体构建参见文献[1],命 名为pcD-LAS. 1.2.2细胞培养食管癌细胞Eca一109以RPMI一 1640—100mL/LFBS进行常规培养,2d换1次液. 1.2.3细胞转基因采用脂质体法,细胞分4 组:I组对照;I组转空质粒;?组转反义载体;IV组 转正义载体.72h后将细胞以2.5g/L胰蛋白酶消 化重铺,同时加入G418至300mg/L.2d后换液, 将G418增加至400mg/L,1wk后换液,将G4l8 增加至600mg/L,持续4d,细胞已大部分死亡,将 G418浓度降至500mg/L,持续1wk后,有小克隆 出现,待克隆细胞长至一定面积后,消化重铺,扩大 第四军医盘学(JFourthMilitMedUniv)1998I19(4) 培养.在连续4mo的培养中,间断地取出部分细胞 在含G418600mg/L~800mg/L的培养液中培养, 未转基因细胞4d,5d全部死亡,而转基因细胞却 能继续存活且生长. 1.2.4细胞原位杂交细胞爬片,冷丙酮固定.以 ?为探针,采用地高辛标记的Nick—translation标 记系统标记探针,杂交方法参照文献Es]. 1.2.5RNA打点杂交以?,反义SOD2RNA 和正义SOD2RNA为探针,分别检测载体的转染, 正义SOD2的表达及反义SOD2的转录情况., 探针采用缺口平移法进行同位素标记;RNA探针 采用体外转录进行制备和标记.RNA的提取,定 量,变性,点膜,杂交,洗膜及放射自显影等过程均参 照文献[43. 1.2.6细胞SOD活力测定采用羟胺法,方法参 照文献E5]. 1.2.7细胞内O.水平的检测采用MTT还原 法,在96孔板上进行.将200mL4×10/L细胞悬 液(含50mL/LFBS)加入96孔板孔中,加0.2mg MTT,37?,50mL/LCO条件下孵育3h;其中 每组再各设一组参照,加10IUSOD.方法参照文 献[6]. 2结果 2.1原位杂交蛄果以neo基因作探针,检测载 体标志基因~'leo的表达,转染基因细胞胞浆显示较 强杂交信号,而对照细胞显示阴性,说明基因确实转 入细胞(Fig1). 圈l原位杂交检测载体转染情况 Fts1Inhybridizationofvectortransfectedcellwithn?probe A:Eea一109eel[a9conlTo|IB;Vectortransfecte~Eca一199cd1. 第四军医大学(JFourthMilitMedUniv)l998}l9(4) 2.2以正义SOD单链RNA为探针,斑点杂交检 测反义SOD2的转录转反义表达载体pcD—LAS 细胞呈现较强杂交信号而其他细胞只有很弱的背景 信号,说明转入的反义表达载体转录出反义SOD2 mRNA(Fig2). 图2RNA斑点杂交分析各细胞内反义501)2mRNA的转 录 Fig2Ana]ysisofantisenseSoD2transcriptionwithRNA dotblotting 1.Control{ICeilstrRnflfectedwithpcD—Neov~torl-.Cells tra~1ectedwkhpcD-LASexpressionv~torl?.Cellstramfected withpcD-LhSexpressionvector. 2.3以反义SOD单链RNA为探针,斑点杂交检 测SOD2的转录情况转正义表达载体pcD—LhS 的细胞呈现较强杂交信号而其他细胞信号较弱,说 明转入的正义表达载体转录出SOD2mRNA,也说 明载体转入细胞后转录出SOD2mRNA(Fig3). 图3RNA斑点杂交分析各细胞内SOD2基因mRNA的转 录情况 Fig3AnalysisofSOD2mRNAtranscriptionwithRNA dotblotting 1.Control;I.Ceilstran~fectedwjthpcD-Neowector}II.Cells trar~eetedwithpcD-LASexpressionvect.r'.Cel[stransfected withpcD-LhSexpressionvttctor. 2.4转染基因细胞内s0D活力测定转染SOD2 细胞SOD2水平升高约5倍,SOD1无变化}转染反 义SOD2基因细胞SOD2水平降低,但SOD1水平 升高.统计分析有显着差异(P<O.05,Tab1). 2.5细胞内O水平的捡测结果转染正义 SOD2表达载体细胞内O;.水平降低约49(P< 0.01),转染反义SOD2细胞内O水平也降低约 32(P<O.01),这2种细胞内O'水平也有显着 性差异(P<O.05,Tab2) 表1不同处理细胞内的SOD括力 TablRelativeactivityotintracellularSOD 367 在土,rt一6) 'P<0.05wgroup1,I,I--tIV.Thesl~nle;ssFig2. 表2不同处理细胞内的Oi水平 Tab2ThelevelofintracellularOi(j土,一10) P<0.05wgroupI.【tl,I-,.Thes&meBsFig2. 2.6RNA斑点杂交检测癌基因特录水平转染空 质粒细胞与对照细胞无明显区4,转正义s0D2细 胞bcl一2mRNA水平轻微降低,p53和c—Hn—ra$ mRNA水平轻微升高}转反义s0D2细胞bcl一2, p53和c—Ha—ra$mRNA水平都明显升高(Fig4). .i 图4癌基因mRNA水平变化直方图 Fig4Theexpressionofbcl一2.p53andc—Ha—Yasindiffer— entgenetransfectedcells 2.7免疫细胞化学结果转反义sOD2细胞Bc1. 2,P53表达都增强,转染正义SOD2细胞Bcl一2表达 减弱,P53表达轻微增强(Fig5,6). 368 图5 Fig5 四军医大学(JFourthMilitMealUniv)1998l19(4 Bcl一2抗体的免疫组化结果 I.CellsofEea一109ascontr01 圈6 Fig6 【?_ 2.8 assayoftheexpressionofBcl一2×400 I?pcD-NeotransfectedceltsIIp~D—LAStransfectedcelts;.pcD~IhStrat~fectedcelts P53抗体的免疫组化结果 assayoftheexpressionofP53×400 I??.ThesameasF5. 细胞周期检测结果转正义SOD2细胞S期细胞数明显减少(户<O.01),转染反义SOD2细胞S 第四军医大学(JFourthMmtMedUniv)1998;19(4 期细胞数变化不明显(Tab3) 表3不同处理细胞的细胞周期变化 Tab3Resultofcellcycledetectionbyflowcytometry 临士s,一3) P<0…01groupI.1tI,I,?.Theme?F2 3讨论 本实验构建了人sOD2正,反义真核表达载体, 用脂质体法成功地将载体转入细胞,且稳定表达. 正义载体的表达,导致细胞内S0D2水平的升高,活 力增加,而SOD1的水平基本未变,细胞内的O水 平降低49以上}反义表达载体的表达,引起细胞 内SOD2水平降低至几乎检测不到,但SOD1的活 力却升高,使细胞内O.水平降低32以上.此现象 可能是由于SOD2水平降低引起o一水平升高,而 细胞为了维持内环境的稳定与平衡,反馈性升高 sOD1作为补偿,这也提示,单独阻断sOD2基因的 表达不能稳定地使细胞内O一水平升高,如果结合 阻断SOD1的表达,可能会获得更满意的结果.这 也将是我们下一步的尝试. 转染正义SOD2基因细胞内O一水平降低,bcl一 2,p53表达下调,c—Ha—ms表达轻度上调;流式细胞 仪检测S期细胞减少.转染反义SOD2细胞内O一 水平也降低,但bd一2,p53,ms表达均上调,S期细 369 胞数变化不明显.转正义和反义SOD2都使细胞内 O一水平降低,但对食管癌细胞癌基因表达和细胞 周期的影响却显着不同,据推测可能与2种转染基 因细胞内O'水平的分布差异有关.转SOD2基因 可通过清除细胞线粒体内O.来降低细胞内总O. 水平,而转染反义sOD基因可减少线粒体内O.的 清除,SOD1的反馈性升高使胞浆内02"一水平降低, 细胞总O.水平也降低,这样虽然2种细胞内O.总 水平都降低,但在线粒体和胞浆的分布却有可能不 同.以上推测有待于进一步证实. 实验结果表明,通过转s0D2基因改变细胞内 O一水平的方法是可行的,但仍需改进;细胞内o. 水平的变化可影响癌基因的表达,而且由转染 SOD2基因引起细胞内O.水平降低对Eca一1O9食 管癌细胞的增殖表现出抑制作用. 参考文献 1事槽洋t毫宏襄t莫倚eta1.反义SOD2基因真攘裹选t体的构 建.第四军医大学.1997|18(2):178—179 2FellerPL,GadekTR,HolmM.Lipfectbon;Aheff~ient lipid—mediatedDNA—transfectionprocedure.ProcNaaAcadSci USA,1987{84(11){7413--7417 3卢圣栋主编.现代分子生旖学实验技术北京高等教青出版社, 1993:229—238 4盘冬雁,黎孟枫犏译.分于克隆实验指南.第2牍.北京:北京科 学出版社,1992:343—391 5季建平.超氧化暂歧化爵超赣量快速测定法.南京饿道都医学院 ,1991I10(1):27—30 8MelinnMtMcLaughlinH.Nitr~bluetetrazoliumreductionin ]yhmphocytes.JLeukocyteB/o/,1987}41(1):325—329 收藉199707-04謦回1997—09—17编辑王雪荐 ? 文擅?大鼠急性脑掼伤后脑局部代谢磁共振波谱分析 [村卫平.秀声禹.幸期a1.中华神经外科杂志,1998~14(1):23—25] 目的一车实验研究鼠急性颅脑损伤局部脑组织代谢的情况,以找出颅脑损伤与恢复过程中局部脑组织各种代谢成分变化的 规律.方法采用自由落体致鼠脑损伤模型,伤后30min.3,24,168h取材.用棱磁共振波谱法分析颅脑损伤局部脑组织代谢的 变化.各组同采用检验.翁暴t颅脑损伤后伤区脑组织乳酸吉量于伤后3h已显着增高(P<O.01),伤后24h仍嚣明显高于正 1I.胆碱于伤后3h已有明显升高?24h达高峰(P<O.01).N一乙酰门冬氨酸吉量自伤后8h明显降低,伤后24h,188h仍然显 着低于正常(P<0.O1).答氨酸白伤后30min开始明显降低.8h降到最低水平(P<0.01).翁论:实验表明颅脑损伤后8h伤区 脑组织巳显着呈缺血性改变,伤后24h达高峰.(王雪萍)