光滑念珠菌对氟康唑耐药机制的研究

光滑念珠菌对氟康唑耐药机制的研究 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师或指导小组的指导下,由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果,其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发 与学位论文主要相关的论文,第一署名单位为河北医科大学,试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则,承担相应的法律责任。 ’ 二级学院领导盖章: 研究生签名:旁【悉广导师签章 沙。年 一蔓舅 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果,除了 文中特别加以标注等内容外,文中不包含其他人己发表或撰写的研究 成果,指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写,文责自负。 研究生签名: 兰彤 导师签章:彩耄篇月岁日四幽嵝旧『『『『四四 岩芝;。 目 录 中文摘要??. 英文摘要??. 研究论文光滑念珠菌对氟康唑耐药机制的研究 引言??. 第一部分光滑念珠菌对氟康唑的敏感性分析 前言??. 日舌??. 材料与方法?. 结果?. 附表?. 讨论?. 小结?. 第二部分光滑念珠菌、、及基因与氟康唑耐 药关系的研究 前言日舌材料与方法?.. 结果?.. 附图?.. 附表?.. 讨论?.. 小结?. 结论?.。? 参考文献综述光滑念珠菌的流行现状及耐药机制的研究进展附录? 致谢?.. 个人简历??.中文摘要 光滑念珠菌对氟康唑耐药机制的研究 摘 要 目的:由于广谱抗生素的广泛使用、免疫缺陷人群的增多等,使得临 床真菌感染的发病率不断上升,念珠菌是医院感染的常见致病性真菌,近 年来光滑念珠菌引起的真菌感染明显增多,由于光滑念珠菌对临床常用的 三唑类抗真菌药物敏感性差,其耐药现象已成为临床治疗的难题。 本研究收集临床分离的光滑念珠菌,检测其对氟康唑的耐药性,并对 三唑类药物作用靶酶的编码基因和外排泵基因、也和 进行研究,以了解光滑念珠菌对氟康唑耐药的机制,为临床合理使 用抗真菌药物提供依据。 方法: 收集临床分离的光滑念珠菌株,用.纸片扩散法和微 量稀释法检测光滑念珠菌对氟康唑的敏感性,以了解光滑念珠菌的耐药状 况。 采用技术对光滑念珠菌的靶酶基因编码区进行扩增,并 对目的基因进行双向测序,测序结果与网上公布的序列比对,以研究 基因突变与耐药之间的关系。 采用半定量技术,检测氟康唑耐药株与敏感株靶酶基因 、外排泵基因、和的删斟表达情况,以研 究基因表达与耐药之间的关系。 结果: 株光滑念珠菌中,株对氟康唑耐药,耐药率为.%;剂量依赖 性敏感株株,所占比例为.%;敏感株株,所占比例为.%。 光滑念珠菌对两性霉素和.氟胞嘧啶敏感率均为%, 株耐药 株全部对伊曲康唑耐药,其中株对伏立康唑耐药。 对 基因的编码区进行测序,其结果与标准序列进行比对后发现 光滑念珠菌耐药株和敏感株的基因共有个点突变,分别为 、?、、、、、和 ,均为同义突变,不引起所编码氨基酸的改变,其中个点突变中文摘要 在敏感株和耐药株中均出现,分别为、、、 和,个点突变只出现在耐药株中,分别为和, 个点突变只出现在敏感株中,为。 将耐药株与敏感株的、、也和基因的 、和也基因砌斟 表达水平进行比对,比对中发现,沁 在耐药株中的表达均高于敏感株,基因武的表达在耐药株与 敏感株之间没有显著性差异。 结论: 研究表明光滑念珠菌对氟康唑的耐药率为.%,并且三唑类药物之 间存在交叉耐药现象,而对两性霉素和.氟胞嘧啶则有较好的敏感性。 研究未发现因基因突变导致所编码的氨基酸的改变,进而使光 滑念珠菌对氟康唑产生耐药的现象,基因突变的意义有待进一步 研究。 研究发现 、和也基因】斟表达的上调是光滑念珠 菌耐药性形成的部分机制,而基因在耐药性形成中的作用有待加 大样本量进一步研究。 关键词:光滑念珠菌;耐药性;氟康唑;基因;基因; 也基因;基因英文摘要 : , ?酏,, .凡 如 , 玛 . , :. 舶 印 . , , , . . .,, 玛, ?,. ?, 曲甜 : . 如 一 . , 也 ? ’ ,也, , ?.触 , , 英文摘要 . . , ,氐觚 ? .. :, ,. , %,? .%. . %, , .?.叭, . .? 如, , , ’, , ,. ,. .“, ,? , .,. .星皿 也 ? 【 甜? 匕 钆, 仃 .,. ?,, 卜诅. 士 .劬 . . 咖. :砌时 咖 . 叩 , 时英文摘要..... .卜 ,. 如.. .:;; ;; ;匕; 研究论文 光滑念珠菌对氟康唑耐药机制的研究 引 言 近年来,由于广谱抗生素、激素及免疫抑制剂的使用增多,以及肿瘤、 器官移植等患者的增加,真菌感染的发病率不断增加,已成为医院感染的 重要菌群,而念珠菌是引起真菌感染尤其是深部真菌感染的主要致病菌 【】。在念珠菌属中,白色念珠菌是最常见的感染性真菌,但随着抗真菌药 物的使用,对临床常用的抗真菌药物尤其是三唑类抗真菌药物敏感性低的 光滑念珠菌的分离率不断增加,且耐药菌株不断出现【】,为此,光滑念珠 菌的耐药性问题已引起了人们的重视。 在国内外的研究中,对念珠菌耐药的机制主要包括以下几点:?药物 作用靶酶的改变【,三唑类药物的作用位点是细胞色素羊毛固醇 ..去甲基化酶.,其编码基因是基因,当基因发 生突变或过度表达时,就会引起靶酶结构或表达发生改变而引起耐药。? 有 药物外排的增强,与多药耐药蛋白 甜 关,包括结合转运蛋白 删 【 。在 和主要易化扩散载体超家族旬 中与药物外排有关的是 基因,目前 比较明确的与耐药产生有关是和【,在中,主要的研 究对象是基因【】。?细胞膜通透性的改变。?线粒体功能的缺失。 ?生物膜的形成。 以前对白色念珠菌的耐药机制研究的较多,而对光滑念珠菌的研究较 少。所以本课题从分子生物学的水平对光滑念珠菌耐药性的形成进行研 究,技术路线如下:?收集临床分离的光滑念珠菌,分析其对氟康唑的耐 技术扩 药状况;?采用聚合酶链式反应 增光滑念珠菌基因的编码区,然后对扩增产物进行双向测序,测 序结果与网上公布的标准序列进行比对,分析基因突变与光滑念 珠菌耐药之间的关系;?采用半定量反转录 技术比较光滑念珠菌对氟康唑耐药株和敏感株、、 和基因的】刚表达水平之间的差异,分析基因表达水平研究论文 的差异与光滑念珠菌耐药之间的关系。研究论文 第一部分 光滑念珠菌对氟康唑的敏感性分析 .?‘.鱼 菁 刖 近年来由于免疫受损人群的增多,人口老龄化问题日趋严峻,以及 免疫抑制剂和广谱抗生素的广泛使用,加之器官移植等新技术的发展,使 深部真菌感染的发病率日趋升高。其中念珠菌是引起深部真 菌感染的主要致病菌【】,临床分离的常见念珠菌主要包括白色念珠菌 、热带念珠菌 、光滑念珠菌 克柔念珠菌 ,虽然在念珠菌中白色念珠菌是引起念珠茵感染的主要致病菌,但 其他念珠菌所占的比例逐渐上升,其中光滑念珠菌已成为重要的条件致病 菌,在某些地区、某些疾病中的分离率快速升高【 】,由于其对常用抗真菌 药物敏感性差而受到人们重视。 临床常用的抗真菌药物主要是.氟胞嘧啶.舛、两性霉素 嘶 、氟康唑、伊曲康唑和伏立康 唑。其中氟康唑对念珠菌和新生隐球菌有很高的抗菌活性, 有高效、低毒、不良反应少等特点,因而广泛应用于临床。但随之耐药菌 株也不断出现,所以,抗真菌感染的治疗用药已是临床面临的重大问题, 为此,本部分内容对株光滑念珠菌的标本种类、病房来源进行统计分析, 并对氟康唑等种抗真菌药物的耐药状况进行研究,为临床合理用药提供 参考。研究论文 材料与方法 材料 .菌株来源 收集我院年月到年月临床送检标本中分离的光滑念珠 菌株,其中同一病人的标本不重复收集,存于.‘冰箱备用。 .质控菌株 试验所用的质控菌株为白色念珠菌和热带念珠菌 。由卫生部临床检验中心提供,质控菌株纸片扩散法参考范围见 表.。 .主要试剂酵母菌鉴定条法国生物梅里埃公司 科玛嘉念珠菌显色培养基郑州博赛生物技术有限公司 真菌药敏条法国生物梅里埃公司 琼脂英国 氟康唑纸片吲片英国 营养肉汤英国 沙氏葡萄糖琼脂培养基英国 .主要仪器 恒温培养箱日本三洋 .型立式灭菌器山东新华医疗器械有限公司 .型生物安全柜上海上净净化股份有限公司 型架盘天平天津市天马仪器厂 锄。移液器公司 比浊仪法国生物梅里埃公司 .冷藏箱青岛海尔公司 一次性无菌培养皿浙江拱东医用塑料厂 方法 .培养基的制备 ..沙氏葡萄糖琼脂培养基: 成份主要包括:琼脂/、葡萄糖 /、蛋白胨 /,方法:研究论文 将蒸馏水置于三角烧瓶中,加入 沙氏葡萄糖琼脂粉,?高压 灭菌,灭菌后取出冷却到?左右,倾注于的无菌培养皿中, 每皿约,冷却凝固后置于?冰箱保存。 ..科玛嘉念珠菌显色培养基: 成分包括:蛋白胨. /、氯霉素. /、琼脂 /、色素 /, 方法:取培养基粉. 溶于装有蒸馏水的三角烧瓶中,搅拌溶解后, 将混合好的培养基加热并不断搅拌,直到煮沸出现大量泡沫为止,然后冷 却至?左右,倾注于的无菌培养皿中,每皿约,冷却凝固后 置于?冰箱保存。 ..含%葡萄糖和./美蓝的琼脂培养基: 琼脂成分包括:水解酪蛋白. /、淀粉. /、琼脂 /、 牛肉浸粉 /,方法:在蒸馏水中加入琼脂,混匀后加入 葡萄糖和山美蓝贮存液.美蓝加入蒸馏水即为美蓝贮存液, ?高压灭菌,灭菌后取出冷却到?左右,倾注于的无菌 培养皿中,每皿约,冷却凝固后置于?冰箱保存。 ..营养肉汤: 成分包括:牛肉浸粉 /, /、蛋白胨 /、氯化钠‖、葡萄糖 方法:将蒸馏水置于三角烧瓶中,加入 营养肉汤粉,?高压 灭菌,灭菌后取出冷却到?左右即可使用。 .菌株的复苏和鉴定 将保存的菌株取出后,放置到室温,然后用营养肉汤溶解,再接种于 沙氏葡萄糖琼脂培养基上,?培养,如不生长可延长至。然后 将沙氏葡萄糖琼脂培养基上的菌落转种到科玛嘉念珠菌显色培养基上确 认鉴定结果,判定标准见表.。再用 酵母菌鉴定条确认复 核,操作步骤如下: .%的无菌生理 挑取沙氏葡萄糖琼脂培养基上的菌落至 盐水中制成菌悬液,调整浓度到个麦氏浊度。 中混匀。 用微量加样器吸取山菌悬液到酵母菌鉴定 将 中的菌悬液加入到 条中,每孔必须加满,大约,不能有气泡产生。 将试条放入?培养,如未见生长可延长至或。研究论文 根据 酵母菌鉴定试条结果判定说明对结果进行判读。 .菌株对五种抗真菌药物的敏感性试验 ..酵母菌纸片扩散法敏感性试验.法 参照美国临床实验室标准化协会规定的酵母菌纸片扩散法 .规定的方法进行,具体方法如下: 菌悬液的制备:挑取沙氏葡萄糖琼脂培养基上的菌落.个, 到 .%的无菌生理盐水中制成菌悬液,调整浓度到.个麦氏浊度。 接种平板:用无菌棉拭子在菌悬液中慢慢浸湿,挤干水分后均 匀的涂布于含%葡萄糖和.‖美蓝的琼脂培养基上,晾.分 钟后贴上氟康唑纸片。 孵育:将平板放入?培养箱中孵育.,量取抑菌圈直径, 如未见明显生长可延长至。 结果的判读:在约%的抑菌区判定为边界,抑菌圈边缘或内 部有极小菌落生长可忽略不计,判定标准见表.。 .. 微量稀释法药物敏感性试验法 依照的?规定的方法对药敏试验进行操作,具体操作如下: 菌悬液的制备:挑取沙氏葡萄糖琼脂培养基上的菌落到 .%的无菌生理盐水中制成菌悬液,调整浓度到个麦氏浊度。 培养基中混匀。 用微量加样器移取山到 用微量加样器将 培养基中的菌悬液加入到药敏 条中,每孔加入肚,盖好盖。 将药敏条放置于?培养箱中孵育后判定结果,对照孔生 长良好而药量稀释倍数最高的孔不生长为最小抑菌浓度,判定标 ‘ 准见表.。研究论文 结 果 菌株的标本来源,见表。 菌株的科室来源,见表.。 光滑念珠菌对种抗真菌药物的药敏试验结果,见表.。 光滑念珠菌对氟康唑的药敏试验结果 .纸片扩散法的药敏结果,见表.。 ‘ .微量稀释法的药敏结果,见表.。 经过纸片扩散法和微量稀释法的最后确认,株光滑念珠菌中,耐 药株株,剂量依赖性敏感株株,敏感株株。纸片扩散法和微量稀 释法不相符,可能是在读取抑菌圈直径时,对抑菌圈的边界判读有人为误 差。研究论文 附 表 曲如 垒曼璺坚 垒皇竺塑垒篁三墨 翌望璺璺垒三主 。 . . 、 ? ’ 一 巧研究论文 亿 一 墨里望皇 墨垒望 里皇堡皇坐垒皇墅 . 劬【. . . . . . .印 研究论文 ? 印 如 印时 % 曲印妙 % 研究论文 讨 论 随着广谱抗生素、免疫抑制剂、激素以及静脉导管、导尿管等插入装 置的使用,致使真菌感染发生率不断上升。其中念珠菌作为临床上常见的 深部感染菌分离率亦不断升高,且对临床常用抗真菌药物的敏感率不断下 降。某些地区光滑念珠菌的分离率已经成为仅次于白色念珠菌的常见感染 性念珠菌【。因此有必要对光滑念珠菌的感染率和耐药率进行统计,以此 ‘ 来指导临床合理用药。 表.结果显示,临床上所分离的光滑念珠菌大部分来自于痰标本, 占.%,说明感染部位多以呼吸道为主,由于呼吸道黏膜的温度、适 度和酸碱度均适宜念珠菌的生长。其次,光滑念珠菌还可以定植于泌尿道 和肠道中,引起尿路感染和腹泻,所以从尿液和粪便中分离的光滑念珠菌 也常见。 表.结果显示,呼吸内科、血液科、和肿瘤内科送检的标本检 出的居多,分析原因为我院以肿瘤病人为主,激素、免疫抑制剂、放化疗、 呼吸机和导管插管应用的比较广泛,上述科室患者住院时间相对较长,治 疗过程中易造成念珠菌感染。 自从氟康唑广泛用于临床治疗念珠菌感染以来,念珠茵的感染菌种发 生了变迁,白色念珠菌所占的比重不断下降,而光滑念珠菌的分离率不断 增加,对氟康唑的敏感性不断下降。表.结果显示分离自临床上的 株光滑念珠菌中,有株耐药,株为剂量依赖性敏感,分别占总数的 .%和. %,敏感株为.%,结果与国内外报道的资料大致相符, 【】年统计,在年到年年间对收集的光滑念珠 菌进行监测,发现氟康唑的敏感率仅为%。【】在对全球多国家多 实验室多年的调查后发现,光滑念珠菌对氟康唑的耐药率为.%,而敏 】, 感率为.%。在不同地区之间耐药率也存在差异,美国为%.嘣 欧洲为.%%【 。卫生部北京医院检验科张秀珍【】对株光滑念珠 菌研究后发现对氟康唑的耐药率为.%。在国内其他多个检验中心的报 道中,光滑念珠菌对氟康唑的耐药率相差比较大,究其原因可能是光滑念 珠菌在不同地区之间的耐药性存在差异,也可能是试验菌株比较少的原 因。研究论文 本研究采用 微量稀释法对.氟胞嘧啶、两性霉素、 氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑种抗真菌药物进行药敏试验时,发现 株光滑念珠菌对两性霉素均敏感,所以两性霉素是临床治疗念珠菌 深部感染的有效药物。 株光滑念珠菌对.氟胞嘧啶也均敏感,有资料显示【】,该药虽在 体外药敏试验中有抗菌活性,但治疗过程中可原发或继发耐药,所以临床 应注意.氟胞嘧啶单独使用易使光滑念珠菌产生耐药的问题。 株剂量依赖性敏感的菌株对伊曲康唑和伏立康唑均敏感,而在 株对氟康唑耐药的菌株中,全部对伊曲康唑耐药,株对伏立康唑耐药。 ..甜一】研究表明%的耐氟康唑光滑念珠菌同时也对伊曲康唑 耐药;而等【】研究来自于接受过氟康唑治疗的骨髓移植患者其 光滑念珠菌一旦对氟康唑耐药,则对其他三唑类药物的敏感性也下降,说 明光滑念珠菌对三唑类药物存在交叉耐药现象。 小 结 本研究结果显示,光滑念珠菌对三唑类抗真菌药物已经存在不同程度 的耐药,对由光滑念珠菌引起的感染治疗时,建议氟康唑不作为首选。 年美国感染病学会重新规定了念珠菌病处理的临床实践指割,对光滑念 珠菌的治疗推荐使用棘白霉素类和两性霉素含脂的制剂,对于已经接受 氟康唑治疗的患者,如果临床症状改善,并且随访期间的培养也是阴性, 则可继续使用氟康唑等三唑类药物直至治疗结束,如未见改善,则改用棘 白霉素类和两性霉素含脂的制剂。研究论文 第二部分 光滑念珠菌 、、及基因 与氟康唑耐药关系的研究 ?上。 刖 青 虽然光滑念珠菌为机体的非致病性共生菌,只是偶尔引起机会性感 染,但随着抗真菌药的广泛使用,真菌感染的菌种发生了变迁,由光滑念 珠菌引起的感染逐渐增加。在美国和欧洲各国的报道中,光滑念珠菌已经 是临床常见的非白念珠菌【。。且对三唑类抗真菌药物敏感性低,还存在 交叉耐药现象,本论文第一部分的研究证实了这一点。光滑念珠菌的耐药 率逐年上升【】,对光滑念珠菌耐药性形成原因的研究已成为重点。 目前国内外对念珠菌的耐药机制研究的一个方面是药物作用靶酶的 改变【】,三唑类药物的作用位点是细胞色素.羊毛固醇..去甲基 化酶.,其编码基因为基因,研究已证实白色念珠菌的 基因突变是对三唑类药物耐药性形成的一个机制【,另外研究发 现念珠菌对氟康唑耐药的另一个机制与基因的过度表达有关【。 但对光滑念珠菌的研究较少,耐药性的产生是否与基因有关尚不 清楚,本试验旨在对光滑念珠菌的基因进行研究,以期研究 基因与光滑念珠菌耐药性产生之间的关系。 念珠菌对氟康唑产生耐药的一个重要机制是细胞内药物外排的增强, 与药物外排功能有关的是多药耐药蛋白,包括结合转 运蛋白和主要易化扩散载体超家族【 。在中与 药物外排有关的是 基因,目前比较明确的 与耐药产生有关是和【,在中主要研究的对象是 基因人们在对白色念珠菌的研究中发现,、和基 因】刚的过度表达与念珠菌的耐药形成有关【‘,但对光滑念珠菌的 研究相对较少,本研究旨在比对光滑念珠菌、和基因 的的表达在耐药株与敏感株之间的差异,探讨其在耐药形成中的 作用。研究论文 材料与方法 材料 .试验菌株 光滑念珠菌来源于第一部分收集到的部分菌株,共株,其中耐药 株株编号为、、、 、、、、,敏感株株编号 为、、、、、、、。 .主要试剂 植物基因组提取试剂盒北京天根生物技术公司 植物总提取试剂盒北京天根生物技术公司 试剂盒 美国公司 反转录试剂盒美国公司 沙氏葡萄糖琼脂培养基英国 无水乙醇上海化学试剂公司 氯仿上海化学试剂公司 .巯基乙醇上海化学试剂公司 .主要仪器 恒温培养箱日本三洋 .型立式灭菌器山东新华医疗器械有限公司 .型生物安全柜上海上净净化股份有限公司 型架盘天平天津市天马仪器厂 移液器 美国公司 .冷藏箱青岛海尔公司 一次性无菌培养皿 浙江拱东医用塑料厂 型低温高速离心机 日本公司 型扩增仪 美国公司 稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂 电热恒温水浴箱天津泰斯特仪器公司 型凝胶成像仪 美国公司 微量核酸蛋白检测仪美国公司’ 研究论文 方法 .光滑念珠菌的培养和分离 将光滑念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上复苏,保证其纯度和活性。 .光滑念珠菌的提取 菌株选择为耐药株株编号为、、、、、、、, 敏感株株编号为、、、、、,具体操作如下: 挑取.个菌落到离心管.的管中,加入“预 先在?水浴箱中预热的缓冲液实验前在缓冲液中加入. 巯基乙醇,使.巯基乙醇的浓度为.%,迅速颠倒混匀,将离心管置于 ?水浴箱中水浴,水浴过程中颠倒离心管数次。 在离心管中加入山氯仿,充分混匀,离心。 小心将上一步离心所得的上层水相转移到一个新的离心管,加 入缓冲液,充分混匀。 将混匀的液体转入吸附柱中,吸附柱放入收集管中, 离心,弃掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。由 于吸附柱的容积大约是“,所以可分次离心。 向吸附柱中加入山缓冲液使用前在缓冲液 中加入无水乙醇,印离心,弃掉收集管中的废液,将 吸附柱放回收集管中。 向吸附柱中加入山漂洗液使用前在漂洗液 中加入无水乙醇,平离心,弃掉收集管中的废液,将 吸附柱放回收集管中。 向吸附柱中加入山漂洗液,印离心, 弃掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。 印离心,弃掉废液,将吸附柱置于室温放置 数分钟,以彻底晾干吸附材料中的残留漂洗液。 将吸附柱放入一个新的离心管中,向吸附柱中间悬空滴加 .? 洗脱缓冲液,室温放置.,印离心,离心 管中所得到的液体即为溶液,保存在.?中备用。为了增加基因 组的得到率,可重复将离心管的溶液再加入到吸附柱中,室温 放置,印离心,洗脱液的体积不应少于山,体积研究论文 过小影响回收率,也不能过大。过大影响产物的浓度,本试验加入 量为山。 将得到的基因组进行浓度和纯度的测定,纯度 /的比值在...为宜,浓度应在‖山以上,否则会影响 以后的反应。 .光滑念珠菌总的提取 菌株选择为耐药株株编号为、、、、、、、, 敏感株株编号为、、、、、、、,具体操作如下: 挑取.个菌落到离心管中.的管,加入山使 用前加入.巯基乙醇,使.巯基乙醇的浓度为%,然后涡旋剧烈震荡 混匀。 将所有的溶液转移到过滤柱上,过滤柱放到收集管中, 印离心.,小心吸取收集管中的上清液到?.骶的分离管中, 吸头避免碰到管底的沉淀。 缓慢加入.倍上清体积的无水乙醇约山,混匀,然后将溶 液一并转入到吸附柱中,将吸附柱放入收集管中, 离心 .,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。 向吸附柱中加入?的去蛋白液, 离心 .,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。 工作液,室温放置 向吸附柱中央加入山的 工作液的配置:将 。 干粉约溶解在“ 的?.舶 中,轻柔混匀,即 存储液,然后取山 ?溶液,轻柔混匀,即为 存储液到?.舶离心管中,加入 工作液。. 离心 向吸附柱中加入“的去蛋白液, .,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。 向吸附柱中加入漂洗液使用前加入无水 乙醇,室温放置,印离心.,倒掉收集管中的废液, 将吸附柱妈放回收集管中。 重复步骤。 印离心,倒掉收集管中的废液,将吸附柱室研究论文 温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中的残留漂洗液。 将吸附柱放入一个新的.能离心管中,向吸附柱 .舶 中间悬空滴加一 ,室温放置,印离 心,得到的即为淤溶液,.?储存。洗脱缓冲液的体积不应少 于,体积过小影响回收率,也不能过大,过大则影响的浓度, 本试验加入量为山。 浓度和纯度的测定: 纯度/的比值应该在.?.之间为宜,浓度应该在 ‖山以 上,否则会影响后续的反应。 . 基因的扩增 ..引物的 根据上公布的光滑念珠菌沁基因基因登录号 的序列设计引物,引物是针对基因的整个编码区设计的, 编码区位于基因的第.位,全长,引物由上海 公司合成,合成如下: ’一’: ’’: 注::哪砌 : .. 扩增 用上步所得的基因组作为模板,按以下反应体系进行,反应体 积为斗。 组分 体积“ × 计】? 盯 引物州 引物州 模板 ’酶/肛 , 研究论文 加样时需要在冰上操作,加样完成后瞬时离心,使样品沉积到管底部, 扩增条件是:先?预变性,然后?,?,?, 个循环,最后?延伸,?保存。 . 、、和基因半定量 ..总的反转录 反转录按照以下反应体系进行,反应体积为“。 组分 体积“ ×伍胃 “/ ?, / /肛 ‘ 模板 先将模板在?预热,加样时在冰上操作,加样完成后 瞬时离心使样品沉于管底,反应总体积为山,反应条件为:?, ?,?,?。 .. 扩增 ...引物的合成 根据上公布的光滑念珠菌基因登录号、 基因登录号、也基因登录号、 基因登录号的序列设计引物,内参基因为基 因登录号,引物由上海公司合成,合成如下:研究论文 引物 值? 产物大小 引物序列’.’ : .: . : 订 .: . 匕: 口 . ‘ . 匕:: . : .: . : . 注:: : ... 扩增 用上一步所得的作为模板,按以下反应体系进行,反应体积 为。 组分 体积 ×虢 什训? 引物州 引物山 模板 酶“山加样时需要在冰上操作,加样完成后瞬时离心,使样品沉积到管底部, 反应条件如下:研究论文 预变性 个循环 延伸 保存 变性 退火 延伸 :? :? 也:? ? ? :? ? ? ?:?.琼脂糖凝胶电泳 ...%琼脂糖凝胶的制备 秤取琼脂糖,放入锥形瓶中,加入蒸馏水,摇匀后在微波 炉上加热到琼脂糖全部融化,放置室温冷却,当冷却到.?时,加入 鹇溴化乙锭使其终浓度为.‖,混匀后备用。 ..凝胶板的制备 将凝胶槽两侧紧密封住,置于水平位置,插上样品梳,注意样品梳齿 下缘与凝胶槽底部保持左右的空隙,将融化好的琼脂糖凝胶慢慢倒 入凝胶槽中,直到胶布满凝胶槽的底部为止,制板时温度不能太低,否则 凝固不均匀,倒胶时不能太快,以避免气泡产生。待其完全凝固后取出样 品梳,注意不要损坏胶板。 .. ×电泳缓冲液的制备 先制备×的缓冲液,如下配置: 组分 含量 嘶碱 硼酸 . ./, . 补足至 取×的缓冲液,加 至,即为×的缓冲液。 ..电泳 将制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽,加入×的缓冲液直 至液面恰好没过凝胶板表面。研究论文 用微量加样器小心在样品槽中加入扩增后的样品,第一孔 加入 破,然后依次加入标本样品,样品体积不得超过样品槽的 容积,样品加入量为山。 接通电源,控制电压为、电流为左右,当溴酚蓝条带 移动到距离凝胶板前缘大约时,切断电源。 在紫外凝胶成像仪下拍摄电泳图。 . 沁基因的测序: 测序由上海公司完成,为了保证测序的准确性,本研究采 用双向测序,测序结果与网上公布的标准序列比对。 .半定量.的统计学分析 、、和基因电泳结束后用紫外凝胶成像仪 拍摄图片,然后用 .软件检测电泳条带的灰度值,灰度 值代表目的基因的表达量,目的基因的相对表达量目的基因的灰度值/ 内参基因的灰度值。应用两样本比较的秩和检验的方法对得到 的目的基因相对表达量进行处理和分析,当郢.时认为差异具有统计 学意义。研究论文 结 果 光滑念珠菌基因的电泳结果,见图.。 株光滑念珠菌经扩增,琼脂糖凝胶电泳后,在处均 能看到目的条带。 伙的条带标记为、、、、 、。 光滑念珠菌基因的突变结果 将株光滑念珠菌基因的序列与网上公布的标准序列进行比 对,比对结果见表.。比对结果发现,光滑念珠菌耐药株与敏感株的 基因共有个点突变,分别为、、、、 、、、,但都是同义突变,不引起所编 码的氨基酸的改变,其中个点突变在敏感株和耐药株中均出现,分别为 、、、和,个点突变只出现 在耐药株中,分别为和,个点突变只出现在敏感株中, 为。 光滑念珠菌、、、和基因的扩增结果 见图.、.、.、.、.。 的条带标记为、、 、、、。 光滑念珠菌、、、基因相对表达水 平见表.。 光滑念珠菌、、、基因训?相对表达水 平的统计结果见表.,结果显示,耐药株基因表达量高 于敏感株.,耐药株基因表达量高于敏感株 .,耐药株也基因】?表达量高于敏感株.,耐 药株基因?表达量和敏感株之间并无差异.。所以, 当光滑念珠菌对氟康唑耐药时 、、基因】州表达量 均升高。 研究论文 附 图 .一 锄: . 锄 :,,, ,.,,,, ,,, ,,. . : 锄 :,, , ,,,,, ,,,, ,,,..: :,,,,,,,, ,,,, ,,,.研究论文. 也 :? :,, , ,,,,, ,,,, ,,,. . . : 曲:,, , ,,,,, ,,,, ,,,. .? : :,,,,,,,, ,,,, ,,,.研究论文 附 表 ? 锄研究论文 ? , ,研究论文 ? ? , , 呈望垒 墅竺旦 垦皇型?皇塑堡旦望 墨塾璺垒里兰 .士. . ? .士. ? .士. . .士. 也 .士. . .士. .士. . ? .士. ? 研究论文 讨 论 由于广谱抗生素的广泛使用及免疫缺陷患者和肿瘤患者的增加,致使 深部真菌的感染率不断升高】,临床最常见的深部感染性真菌是念珠菌, 但随着抗真菌药物尤其是三唑类药物的应用,念珠菌的耐药性也迅速出 现,并出现了耐药菌种的变迁,光滑念珠菌已经成为继白色念珠菌之后第 二位常见的感染性念珠菌【】。 临床上常用的抗念珠菌药物是三唑类抗真菌药,三唑类药物的作用位 点是菌体细胞膜上的麦角固醇合成通路上的细胞色素.羊毛固醇 ..去甲基化酶.,从而影响麦角固醇的合成继而影响细胞膜的 合成达到抑菌效果,而不是杀菌效果,所以在长期利用过程中易产生耐药 性【】。光滑念珠菌产生耐药的一个可能的原因就是编码.的 基因发生突变,使.的空间结构发生改变,就有可能致使三 唑类药物作用位点对三唑类药物的亲和力降低,药物不能发挥作用而产生 耐药性【。 光滑念珠菌基因全长,本研究针对其编码区. 进行测序,以检测其突变情况。本试验检测出个点突变,分 、、、 另为、、、 和,突变前碱基所在的密码子分别为、、、、 、、和,所编码的氨基酸分别为苏氨酸、天冬酰胺、 异亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、甘氨酸和赖氨酸,个点突 变均为同义突变,不引起编码氨基酸的改变。其中转换有、 、、、和;颠换有和, 、、、和在敏感株和耐药株中 均出现,而和只出现在耐药株中, 只出现在敏 感株中,而这些突变的具体意义有待进一步研究。 在国内外的研究中,法国学者【】等对由线粒体缺失所致的呼吸 缺陷型光滑念珠菌的耐药机制进行分析后发现了个点突变,分别为 、、 、、 和,但均为同义突 变,不引起编码的氨基酸的改变。意大利甜【】也发现了耐氟康唑 的光滑念珠菌存在多个同义突变,未发现错义突变。国内学者沈银忠【】研 究论文 等在研究耐药性光滑念珠菌时也发现了个点突变,但也为同义突变, 突变部位多发生在.之间。虽然这些研究尚未发现由 基因发生突变引起编码氨基酸的改变而导致光滑念珠菌发生耐药的现象, 可能与标本量少有关,还有待加大样本量进一步研究。 研究显示光滑念珠菌在接触氟康唑不久即可产生耐药性【删,耐药产生 的一个机制是药物外排的增加,而目前对此机制研究主要集中在、 也、‘基因的训斟过度表达上。另一个机制是药物作用靶位的 改变,与之相关的是基因,为此研究针对光滑念珠菌、 、也和基因的训泔在耐药株和敏感株之间的表达水平 进行比较,以了解各基因在不同菌株之间的表达差异。 本研究结果显示,耐药光滑念珠菌中、和的 的表达均高于敏感株,说明、和的训?表 达上调与光滑念珠菌的耐药形成有关。未发现基因的】?表达 在耐药株和敏感株之间存在差异。 本研究未发现基因突变与氟康唑耐药的关系,但有资料显示 口】基因过度表达可引起.发生改变,高表达量预示着要有更 高的药物浓度才能发挥阻断靶酶合成的作用。撕【】发现光滑念珠菌 耐药株基因删?表达上调了倍。等【】研究也发现光滑 念珠菌接触氟康唑后,.的表达量明显上升。这些研究表明光滑念 珠菌可以上调基因的】刚产生耐药。本研究显示耐药株 基因比敏感株上调了.倍,可能与标本量少有关,还有待加大样本量进 一步研究。 有资料显利,与基因与光滑念珠菌的耐药形成有关, 但二者表达上调的程度不同,的表达上调要高于。等【】 研究发现耐药的光滑念珠菌的上调了.倍,而仅上调了 .倍。“】研究发现在耐药株和敏感株中和的表达均 上调,同时细胞内氟康唑的浓度降低。也有研究和也所编 码的蛋白分别为和,在氨基酸序列上有%的同源性,所 转运的底物也相似,但的药物外排能力更强,所以在耐药形成中 的作用较大。本研究结果显示耐药的光滑念珠菌中和 的】?的表达均高于敏感株,但分别上调了.倍和.倍,可研究论文 能与标本量少有关,还有待加大样本量进一步研究。 对于基因,在光滑念珠菌中的研究较少,耐药形成中的作用 也不明确,掣】对一株耐氟康唑的白色念珠菌研究中发现,敲 除基因,耐药株转换为敏感株,从而认定基因的过度表达 与耐药的形成有关,本研究未发现?基因在光滑念珠菌耐药株中表 达上调。 小 结 本研究未发现由基因发生突变引起编码氨基酸的改变而导致 光滑念珠菌发生耐药的现象,发现光滑念珠菌的耐药形成与、 和也的?表达上调有关。未发现耐药形成与基因 之间的关系,需加大样本量进一步研究。