HPLC测定元胡止痛软胶囊中没食子酸含量

HPLC测定元胡止痛软胶囊中没食子酸含量 摘要:目的 建立元胡止痛软胶囊中没食子酸含量的高效液相色谱测定方法。方法 色谱柱:Unitary C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇-0.5%磷酸(5?95);流速:1.0 mL/min;柱温:30 ?，波长:254 nm。结果 没食子酸在0.024 8,0.496 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 9，日内精密度、重复性、稳定性的RSD分别为0.27%、0.21%、1.40%，平均加样回收率为99.81%，RSD=0.72%。结论 本方法精确可靠，可作为元胡止痛软胶囊中没食子酸含量测定的方法。 关键词:元胡止痛软胶囊;没食子酸;高效液相色谱法 中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1005-5304(2014)04-0080-02 元胡止痛软胶囊为2010年版《中华人民共和国药典》收载品种，由延胡索(醋制)、白芷等药组成，具有理气、活血、止痛的功效，用于气滞血瘀的胃痛、胁痛、头痛及痛经[1]。其中含有鞣质类成分，此类成分可与蛋白质类物质(如明胶)反应生成不溶于水的沉淀物，造成软胶囊质量不合格。本研究采用高效液相色谱法(HPLC)，建立鞣质水解产物没食子酸的含量测定方法，为元胡止痛软胶囊的精制工艺及质量控制提供依据。 1 仪器与试药 Waters高效液相色谱仪，2487双通道紫外检测器，1515等度HPLC泵，717 Plus自动进样器;十万分之一天平，美国赛多利斯公司;KQ3200E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。 醋延胡索、白芷，北京仟草中药饮片有限公司;没食子酸对照品，上海源叶生物科技 有限公司，批号20130329。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 色谱柱:Unitary C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相:甲醇-0.5%磷酸(5?95);流速:1.0 mL/min， 柱温:30 ?，检测波长:254 nm。 2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品适量，置25 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，放冷，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成24.8 μg/mL的溶液，即得。 2.2.2 供试品溶液的制备 称取醋延胡索400 g、白芷200 g，用6倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h，过滤，滤液回收乙醇浓缩至无醇味，水浴蒸干，真空干燥，即得元胡止痛软胶囊提取物[5]。精密称取1 g元胡止痛软胶囊提取物，置于100 mL锥形瓶中，精密移入100 mL 40%甲醇，称定质量，超声处理(功率150 W，频率40 kHz)30 min，滤过，定容于100 mL量瓶中，过0.22 μm微孔滤膜，即得。 2.2.3 阴性对照溶液的制备 称取醋白芷200 g，用6倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h，过滤，滤液回收乙醇浓缩至无醇味，水浴蒸干，真空干燥，即得延胡索阴性样品。精密称取延胡索阴性样品适量(相当于1 g元胡止痛软胶囊提取物中白芷原药材量)，置于100 mL锥形瓶中，精密移入100 mL 40%甲醇，称定质量，超声处理30 min，滤过，定容于100 mL量瓶中，过0.22 μm微孔滤膜，即得。 2.3 空白试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定。色谱图见图1。 2.4 标准曲线绘制 精密吸取上述对照品溶液适量，过0.45 μm微孔滤膜，分别进样1、2、5、10、15、20 μL。以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。 得回归方程Y=73 726X+44.61 (r=0.999 9)。结果明，没食子酸进样量在0.024 8,0.496 μg范围内线性关系良好[2-4]。 2.5 精密度试验 2.5.1 日内精密度 将供试品溶液于同日内连续进样6次，测定峰面积，经计算，没食子酸RSD=0.27%，表明仪器的精密度良好。 2.5.2 日间精密度 将供试品溶液于3 d内每日分别连续进样3次，测定峰面积，经计算，没食子酸的RSD=0.35%，表明仪器的精密度良好。 2.6 重复性试验 取6份供试品溶液，分别进样，测定指标成分含量。经计算，没食子酸RSD=0.21%。表明方法的重复性良好。 2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在样品制备后0、2、4、8、12、24、48 h进样，测定峰面积。经计算，没食子酸RSD=1.40%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。 2.8 加样回收率试验 精密吸取已知含量的6份供试品溶液各1 mL(相当于1.24 mg元胡止痛软胶囊提取物)，按供试品?对照品=1?1的比例准确加入对照品溶液，混合均匀，测定没食子酸含量。经计算，没食子酸平均加样回收率为99.81%，RSD=0.72%，表明方法的准确度良好。见表1。 2.9 样品含量测定 精密称取元胡止痛软胶囊提取物，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，测定样品中没食 。 子酸含量及RSD。见表2 3 讨论 没食子酸有广泛的溶解性，既溶于水又溶于醇，随着醇浓度的升高其溶解度变小。本试验考察了元胡止痛软胶囊提取物中的没食子酸在水、40%甲醇、70%甲醇及纯甲醇的溶解情况分别为0.014 4、0.012 5、0.075 5 mg/mL。由于水提液中杂质较多，综合考虑，选择40%甲醇作为溶媒进行提取，获得了较为理想的结果。 测定鞣质类成分常用的方法是干酪素法[6-9]，可以测定样品中总鞣质的含量，但专属性不强。本研究采用HPLC测定鞣质类水解成分没食子酸的含量，选择甲醇-0.5%磷酸为流动相，获得了理想的分离条件。在该条件下对元胡止痛软胶囊3批提取物中没食子酸的含量进行了测定，结果良好。本方法可以作为元胡止痛软胶囊中精制工艺及质量控制过程中没食子酸的含量测定方法。 参考文献: [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京:中国医药科技出版社，2010:525. [2] 王初，胡晓炜，宋旭峰，等.反相高效液相色谱法测定柿蒂中没食子酸酸的含量[J].医药导报，2005，24(8):728-729. [3] 王克英.石榴皮中没食子酸定性定量方法研究[J].中国中药杂志， 2005，30(15):1171-1172. [4] 颜玉贞，唐琬清.HPLC法测定忧克龙胶囊中没食子酸的含量[J].中药新药与临床药理，2000，11(3):167-173. [5] 杜茂波，刘淑芝，刘树扬，等.元胡止痛软胶囊中延胡索提取工艺优选[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(9):50-52. [6] 杨铮，秦丽娟，高建萍，等.干酪素法测定诃子中鞣质的含量[J].内蒙古中医药，2005，24(6):31-32. [7] 朱慧瑜，金哲雄.干酪素法测定榛叶中鞣质类成分的研究[J].黑龙江中医药，2006，19(6):440-441. [8] 许沛虎，毛培，张雪琼，等.解毒保肝片中总黄酮与总鞣质的含量测定[J].医药导报，2009，28(3):362-364. [9] 沈洁，徐金钟，胡济宏，等.磷钼钨酸-干酪素法测定丹参药材中鞣质的含量[J].分析化学研究简报，2008，36(4):553-555. (收稿日期:2013-09-03，编辑:陈静)