AAAAAA产胶原蛋白酶芽孢杆菌的分离及鉴定.doc

AAAAAA产胶原蛋白酶芽孢杆菌的分离及鉴定.doc 苏云金芽孢杆菌产胶原酶菌株的分离鉴定 学生:吴斌贤 指导教师:张光祥 摘要:胶原蛋白对维持皮肤、血管壁弹性,保持毛发、指甲柔软亮泽,提高软骨的 润滑性等都有重要作用。因而其独具的延缓皮肤衰老、重焕肌肤光彩等上佳功效而颇 受女性消费者的青睐。而目前生产胶原蛋白的最流行的就是酶解法:因此胶原酶 的分离鉴定越来越受到社会的热切关注。本文针对胶原酶的分离及鉴定方法原理以及 发展前景做以阐述。 关键字: 苏云金芽孢杆菌(Bt);胶原蛋白酶;分离;鉴定; Bacillus thuringiensis strains to produce collagenase isolation and identification Student:Wu Binxian Tutor:Zhangguangxiang Abstract:To maintain the skin, collagen vascular wall elasticity, keep hair, nail soft and lustrous, enhance cartilage lubrication and so on have important role. Because of its unique delay skin aging, skin luster, good effect of youthful and popular female consumers. The production method of collagen of the most popular is the enzyme solution: therefore collagenase isolation has more and more social attention. In this paper the principle and method of collagenase isolation and identification and development prospect in order to elaborate. Key words: Bacillus thuringiensis(Bt); Collagenase; Isolation ; identification; 目录 1材料与方法 ................................................................................................................................... 2 1.1 实验材料 ................................................................................................................................... 2 1.1.1材料 ......................................................................................................................................... 2 1.1.2器材 ......................................................................................................................................... 2 1.1.3明胶固体培养基...................................................................................................................... 3 1.2 方法 ........................................................................................................................................... 3 1.2.1 胶原蛋白酶产生菌的提取和筛选 ......................................................................................... 3 1.2.2 酶液的制备(复筛) ............................................................................................................. 5 1.3 胶原蛋白酶活性检测 ................................................................................................................ 6 1.3.1 溶液制备................................................................................................................................. 5 1.3.2 胶原蛋白酶活力测定 ............................................................................................................. 5 1.4 细菌鉴定 ................................................................................................................................... 6 1.4.1 菌体形态观察......................................................................................................................... 6 1.4.2生理生化试验:...................................................................................................................... 6 1.4.3 16S rDNA的PCR扩增 .......................................................................................................... 7 2 结果 .............................................................................................................................................. 9 2.1 胶原蛋白酶产生菌的筛选及消化试验 .................................................................................... 9 2.2 甘氨酸浓度标准曲线 ............................................................................................................. 10 2.3 酶活力测定结果 ..................................................................................................................... 11 2.4 菌种的鉴定 ............................................................................................................................. 11 2.4.1 菌落形态............................................................................................................................... 11 2.4.2显微镜观察............................................................................................................................ 12 2.4.3生化鉴定................................................................................................................................ 13 2.4.4 16S rDNA的扩增结果 ......................................................................................................... 13 3 讨论 ............................................................................................................................................ 14 3.1 关于产胶原蛋白酶菌株的筛选 .............................................................................................. 14 3.2进一步研究的意义................................................................................................................... 14 文献综述 ........................................................................................................................................ 16 参考文献 ........................................................................................................................................ 20 致谢 ................................................................................................................................................ 21 1 前言: 胶原蛋白可制作心脏瓣膜;血管修复的替换血管装置;作为烧伤伤口的敷料(使血液凝固，具有止血功能);制造人造皮肤。胶原蛋白材料制备薄膜材料;制造肠衣等可食用包装材料;作为肉制品添加剂、保健食品等。 胶原酶是国内外治疗椎间盘突出症最有效的药物。 胶原酶是一类具有高度专一性的一种酶类，其对于其它的蛋白质没有活性，它在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原的三维螺旋结构，而不损坏其他蛋白质及其他组织。胶原酶本质是蛋白质，所以，其对温度、PH 和导致蛋白质变性的各种因素非常敏感，它的构象和性质容易受到外界条件的影响而改变。 苏云金芽孢杆菌是革兰氏阳性芽孢杆菌，其菌体为短杆状,有鞭毛，一般单生或者形成短链。在20世纪60年代实现现代工业化生产以来，已成为世界上用途最广商 [1-2]业开发最成功，产量最大的微生物杀虫剂，以每年以20%的速度增长。 1材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1材料 样品，实验室可从皮革、肉市场农村宰猪中采集土样、水样。 主要试剂:酪蛋白;明胶;?型胶原蛋白(SIGMA公司);柱式细菌DNAout提取试剂盒(绵阳高新区天泽基因工程有限公司);胶原蛋白粉末，实验室可自制;水合 [3]茚三酮;抗坏血酸;乙酸;乙酸钠;Tris试剂;无水乙醇;三氯乙酸;HgCl;盐2酸;乙二醇甲醚;牛肉膏;蛋白胨; KHPO?3HO; NaHPO?2HO ;NaCl;KHPO;242 242 24MgSO?7HO;葡萄糖等。试剂均为分析纯试剂。 42 1.1.2器材 实验过程中所使用的仪器有:PCR仪;电泳仪;TGL-16G离心机，MS2旋涡混和器，Haier冰箱，DNP-9272型电热恒温培养箱，HZQ-F全温振荡培养箱，洁净工作台，BS210S电子天平，CX210FS1生物显微镜，YX 280A手提式不锈钢蒸汽消毒器，DK-98-1型电热恒温水浴锅，微量加样器，DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱，WXZ-UV-2102 2 紫外可见分光光度计，酸度计，以及离心管，EP管，培养皿，接种环(针)等。 1.1.3明胶固体培养基(1000mL ): 牛肉膏 5g, NaCl 5g, 蛋白胨 10g, pH 7.2,7.4 富集培养基(1000mL) : 明胶 1g, NaCl 5g, 蛋白胨 5g, pH 7.2,7.5 初筛培养基(1000mL ): 明胶 20g, NaCl 0.1 g, 蛋白胨 5g, KHPO 0.5g, 24 MgSO?7HO 0.2g， pH 7.2,7.5 42 复筛培养基(1000mL ): 葡萄糖 20g， 酵母粉 1.5g 胰蛋白胨 10g, NaHPO?2HO 0.5g 242 CaC1 0.05g, KHPO?3HO 2.5g 2 242 pH 7.0,7.2 固体培养基:在上述液体培养基中加入1.6%琼脂，即成相应固体培养基。 1.2 方法 1.2.1 胶原蛋白酶产生菌的提取和筛选 1.2.1.1胶原蛋白的制备 胶原蛋白的提取与纯化的目标是尽量使胶原提取的产率、纯度更高，并且使所提取的胶原能满足不同领域的要求。迄今为止，胶原的提取方法主要有以下4种:酸法、碱法、盐法、酶法。在实际提取过程中，不同提取方法之间往往相互结合，以取得较好的提取效果。 1.2.1.2酸法提取 主要采用低离子浓度酸性条件浸渍处理原料，从而破坏分子间的盐键和希夫碱， 3 而引起纤维膨胀、溶解。作为溶剂使用的酸，主要有盐酸或亚硫酸、磷酸、硫酸、醋酸、柠檬酸和甲酸等。酸法是提取胶原蛋白比较常用和有效的方法，用酸法提取的胶原最大程度地保持了其三股螺旋结构。此法处理快速，所得产品的分子量是连续的，适用于医用生物材 料及原料的制备，但产品得率低，设备腐蚀严重，污染重。赵苍碧等采用0.3 %的醋酸溶液在4 ?下从牛腱中提取胶原蛋白，得到高纯度的胶原蛋白溶液。余海等采用0.5 mol/L的醋酸溶液在4 ?下从鼠尾肌腱胶成功提取出I型胶原蛋白。Takeshi等胶原蛋白课组 采用0.5 mol/L的醋酸溶液从海妒鱼、鳍鱼、金枪鱼、水母等的皮中提取、分离出纯度较高的胶原蛋白，并对所提取的胶原蛋白的理化性质作了系统的研究。 1.2.1.3碱法提取 胶原蛋白常用的处理剂为石灰、氢氧化钠、碳酸钠等。如Holzer等采用1 %,1.5 %石灰水浸泡的方法提取胶原蛋白。由于它容易造成肽键水解，因此得到的水解产物分子量比较低。所以，若想保留胶原的三股螺旋结构，此法不可取。 1.2.1.4盐法提取 提取胶原蛋白所用的中性盐有盐酸-三羟甲基胺基甲烷(Tris-HCl)、氯化钠、柠檬酸盐等。在中性条件下，当盐的浓度达到一定量时，胶原溶解。并且可采用不同浓度的氯化钠对提取的胶原蛋白进行盐析处理，可以沉淀出不同类型的胶原蛋白。 1.2.1.5酶法提取 酶法提取是利用蛋白酶使胶原溶解，水解条件温和，反应速率快，提取的胶原蛋白仍有完整的三股螺旋结构，蛋白纯度高，理化性质稳定，且无环境污染。酶法提取常用的蛋白酶有:胃蛋白酶、胰蛋白酶或者复合酶。工艺可选择一步法，即利用酶液直接提取;二步法，即先用酸或者碱进行初步提取，然后再用酶提取。Langmaier等用MgO预处理革屑，然后用碱性蛋白酶提取胶原的水解产物。Cabeza L.F.T等先用胃蛋白酶，再用碱性蛋白酶提取了2种不同的胶原水解产物。赵苍碧等采用胃蛋白酶和无花果蛋白酶消化法从牛腱中提取胶原蛋白，探讨了酶和酶的加入量对提取结果的 4 影响，给出了酶对胶原提取最佳工艺配比，酶与牛腱的质量比为0.1时效果最佳，而使用无花果蛋白酶时，0.01的配比最佳。 1.2.2酶液的制备 1.2.2.1配制酸性汞试剂 HgCl 15g，浓盐酸20g，加蒸馏水定容至100mL。 2 1.2.2.2富集培养 取样品2g或2ml，用生理盐水18 mL浸泡摇匀后放置10min，在沸水浴中处理5 min，冷却后按0.5%的量(即100 u L)取悬浮液接种装有富集培养基的三角瓶中，180r/m, 37?摇瓶培养2d。 1.2.3.3胶原蛋白酶产生菌的初筛 将富集培养液梯度稀释:取8支试管各装9mL蒸馏水，依次编号，灭菌，无菌操作下取1mL富集培养液加入1号管中充分混匀，再从1号管中取1mL混合液加入2号管中混匀，再从2号管中取1mL混合液加入3号管中混匀……，直到8号管也充分 -6-7-8混合后，取10，10，10三个梯度浓度的稀释液各50uL进行涂布初筛平板，涂布均匀后放入37?温箱中培养约24h。观察菌落生长情况，选取具有隐约透明圈的菌落，转接平板，编号记录。将初筛菌在37?温箱中培养24 h，在平板菌落周围滴加酸性汞试剂，如菌落周围出现透明圈者为阳性，即是要初步分离得到的菌，大约在滴加试剂后10秒就会出现透明圈。挑选明胶水解圈与菌落直径比值较大的菌株保存。 1.2.4.4胶原酶活性定性测定 胶原蛋白酶能分解明胶，从而使菌落周围产生一个被分解了的圆圈，酸性汞试剂能与明胶反应产生白色物质，而不会与明胶分解后的产物产生白色物质，故在能分解明胶的菌落周围滴加酸性汞试剂后会产生一个透明水解圈，水解圈与菌落的直径比越大，可基本说明该菌产生的酶活力或酶数量越大，以此初步判断出目的菌。 1.2.2.5酶液的制备(复筛) 5 在平板上勾取一环消化牛皮效果最好的COL-J菌株，接种于20mL/150mL的种子培养基中，在37?，180转条件下摇瓶培养12h，再按0.5%的接种量接种到20mL/150mL的复筛培养基中，摇瓶培养48h。4000rpm, 10min离心后，取上清液测定胶原蛋白酶活力。 1.3 胶原蛋白酶活性检测 1.3.1 溶液制备 (1)还原茚三酮的制备:称取5g水合茚三酮，用125mL蒸馏水溶解，得黄色溶液.将5g抗坏血酸用250mL蒸馏水溶解。在电磁搅拌下将抗坏血酸溶液滴加到水合茚三酮溶液中，滴加过程中不断有沉淀出现，滴加完后室温下继续搅拌15min，放入冰箱中冷却5min，过滤，沉淀用蒸馏水洗涤3次，收集沉淀，真空干燥。(尽量在避光条件下迅速完成)。 (2) 茚三酮显色液:称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，溶解于10mL乙二醇甲醚，避光低温保存。 (3) 2mol/L pH5.4乙酸缓冲液:86mL 2mol/L乙酸钠加入14mL2mol/L乙酸，混匀。 (4)底物溶液:取20mg酸溶性III型胶原溶于20mL 0.01 mol/L乙酸溶液中，避光低温保存。 (5) 0.lmol/L pH7.5Tris-HC1缓冲液(含50mmo1/L CaC1) 2 (6) 60%乙醇溶液:60mL无水乙醇中加入蒸馏水定容至100mL。 [4](7)30%三氯乙酸:取15mL氯乙酸，加入蒸馏水定容至50mL 1.3.2 胶原蛋白酶活力测定 1.3.2.1标准曲线的制定:先配成0.3µmol / mL的甘氨酸备用，取6支试管按1编上号加样，记录数据。 表1 甘氨酸标准曲线 Table 1 glycine standard curve 试管号 0 1 2 3 4 5 甘氨酸(mL) 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 蒸馏水(mL) 1.5 1.25 1.0 0.75 0.5 0.25 浓度(µmol / mL) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 6 将0.5mL含上述浓度的甘氨酸溶液与0.5mL, 2mol/L乙酸缓冲液充分混匀，加入0.5mL茚三酮显色溶液，充分混合后，盖住试管口，在100?水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5—10min后，加入1.5mL 60%乙醇稀释。充分混匀后，570nm处比色。 1.3.2.2酶活的测定 以酸溶性III型胶原为底物，先将配好的胶原稀释20倍;将上述准备好的酶液稀释400倍。 反应体系为:稀释胶原150uL，0.1 mol/ L pH 7.5 TrisHCI(含50mmol/L CaC1) 2100uL，酶液50uL, 37?反应30min，等体积(300uL)30%三氯乙酸终止反应，以先加终止液的相同反应物为对照，加入0.6 mL, 2mol/L乙酸缓冲液充分混匀，再加入0.6mL茚三酮显色溶液，充分混合后，盖住试管口，在100?水浴中加热15min，用 —10min后，加入1.8mL 60%乙醇稀释。充分混匀后，570nm处比自来水冷却。放置5 色。茚三酮显色法测定反应所释放的水溶性氨基酸、短肽，以甘氨酸显色制定标准曲线。酶活力单位定义为:在37?, pH7.5条件下，1mL酶液每分钟水解胶原产生相当于1µmol甘氨酸的酶量为1个酶活力单位(U)。 1.4 细菌鉴定 1.4.1 菌体形态观察 将COL-J菌接种到初筛平板上37?培养24h，观察菌落形态;接种于种子培养 [5]基中37?，180r/m摇瓶培养12h，做革兰氏染色观察。 1.4.2生理生化试验: 以一株苏云金芽孢杆菌为对照，对菌菌株的部分生理生化特征进行实验观察。 根据分离菌的菌落和菌体形态，芽孢的有无和着生情况，以及生理生化反应，按 [6]东秀珠《常见细菌系统鉴定手册》进行初步分类 。 1.4.3 16S rDNA的PCR扩增 生物细胞DNA分子的一级结构中既具有保守的片段，又具有变化的碱基序列,保 7 守的片段反映了生物物种间的亲缘关系，而高变片段则能表明物种间的差异(这些核苷酸序列则是不同分类级别生物(如科、属、种)鉴定的分子基础，以16SrDNA为聚合酶链式反应(PCR)扩增的靶分子进行细菌快速分类鉴定，与其它细菌鉴定方法比较， [7]具有高效、准确、简便、特异性强的优点。 1.4.3.1细菌总DNA的提取 将菌种接种于20mL/150mL种子培养基，37? 180r/m培养12 h，按如下柱式DNA out抽提试剂盒使用手册提取菌株COL-J的总DNA: (1)取1mL菌液离心1 min后，重悬于0.6mL溶菌液中，吹打均匀，37?保温30 min。 (2)13000g离心10 min后弃上清夜。 (3)加入300uL溶液A到细菌沉淀中，吹打均匀。 (4)加入150uL溶液B到离心管中，颠倒数次混匀后溶液中将有白色丝状悬浮物产生。 (5)65?水浴放置3-5min。 (6)加入200uL氯仿，震荡混匀30秒，溶液呈乳白色。 (7)13000g室温离心2min，上清透明，中间层有白膜，小心转移上清到新的离心管中，避免触及中间的白膜。 (8)加入1.5倍体积(约0.6mL)的通用上柱夜到上清中，颠倒混匀全部转移到离心吸附柱中，室温放置4min。 (9)13000g室温离心1min，DNA吸附在离心吸附柱的膜上，倒弃收集管中的穿透液。 (10)将0.5mL通用洗柱液加入离心柱中，13000g室温离心1min，弃穿透液。 (11)重复第10步操作一次。 (12)空甩半分钟，将离心吸附柱转移到新的离心管中。 (13)加50-100uL自备TE(pH8.0)，室温放置3-5min。 (14)13000g室温离心1min即得DNA溶液。 1.4.3.2基因PCR鉴定的策略 不同研究者采用的PCR鉴定策略各异，主要表现在模板来源、DNA聚合酶和引物选择等三个方面。由于模板来源及纯度的可塑性，从相当纯的总DNA到细胞粗提物以至菌落，只要其中的杂物不抑制DNA聚合酶的活性，所获得的模板来源均可行。另外， 8 在不同DNA聚合酶催化的条件下，并非所有模板都能以同等效率合成，所以扩增时应考虑不同种类DNA聚合酶的选择。 引物的选择大致可归为以下几类:(1)特异引物直接鉴定目的基因;(2)数对通用引物复合扩增鉴定大类基因，再用一系列特异引物对复合扩增鉴定已知的基因型以及与之同源的未知基因型;(3)共用3'端保守引物,一系列5'端特异引物附着在不同的靶位点上,根据产物分子量可判断基因型;(4)以一对保守引物扩增出同源基因的相应区段(包括已知与未知基因的保守序列和非保守序列)，经适当的限制性内切酶酶切分析，与已知基因的限制性片断长度多态性(RFLP)图谱进行比较，就可以鉴定出待测菌株中所存在的已知基因，如果出现特异性片断，说明可能存在新基因;(5)简并引物及位于简并引物内部的一系列特异引物混合扩增,可很快检测出新基因型。 1.4.3.3 PCR扩增和序列测定 ’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 上游引物序列:5 下游引物序列:5’-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3’ PCR反应体系(25uL)为:10×buffer2.5uL, 25umol 的MgCl0.5uL，2.5mmol 2 dNTP0.5uL，上游引物1uL,下游引物1uL, DNA0.5uL，5U/uL的Taq酶0.5uL，超纯水17.5uL。PCR扩增程序为:95?预变性5min;95?45sec，56?30sec，72?1.5min，循环30次;72?延伸10min。PCR产物可进行序列测定。 1.4.3.4 序列比对 将rDNA测序结果在GenBank的核酸数据中进行同源性比对。 2 结果 2.1 胶原蛋白酶产生菌的筛选及牛皮消化试验 从皮革厂、肉市场、农村宰猪厂等处采集土样、水样共5份，经生理盐水浸泡，明胶富集培养后，梯度稀释涂布于初筛平板上。共分离到49株产明胶酶菌株。挑选水解圈直径与菌落直径比值较大的菌来进行种子液培养，将发酵液对重约0.5g的新鲜小牛皮作室温消化。从中筛选到5株对牛皮消化效果好的菌株， 其中加入COL-J菌上清液的牛皮被很充分的消化了，是效果最好的一管，仅剩很薄的与毛连接的皮肤， 9 而加无菌种子培养的对照组，牛皮则无明显变化，说明COL-J上清液中确有能消化牛皮的酶，而小牛皮中含有大量的胶原蛋白，可以判定COL-J产生了胶原蛋白酶，而且效果很好。 图1牛皮消化实验对照结果 (图中最左为COL-J菌消化了的牛皮，右为对照实验) Figure 1 leather digestive experimental control results (Shown in the leftmost COL-J bacteria digest the cow, the right is the control experiments) 2.2 甘氨酸浓度标准曲线 本研究是以茚三酮显色法测定酶反应释放氨基酸或短肽的量为标准测定胶原蛋白酶活性的，因此先进行了茚三酮显色法测定已知甘氨酸浓度，以此作出标准曲线。将甘氨酸标准液依次稀释为0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25µmol /mL，并在显色后在570nm处测光密度吸收值，结果如下表2和图2所示。 表2 甘氨酸标准液的光吸收值 试管号: 0 1 2 3 4 5 浓度(µmol /ml): 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 测得A值: 0 0.132 0.259 0.386 0.502 0.625 10 A值 2 R = 0.9996 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 甘氨酸浓度 0 0.1 0.2 0.3 图2 甘氨酸浓度标准曲线 Figure 2 glycine standard curve 2.3 酶活测定结果 用茚三酮显色法在570nm处测定的酶液的光密度吸收值为实验组:A=1.054，对1照组A=0.712，?A:0.342，根据酶活力单位的定义，计算后得到酶的活力是:35.97 2 U/mL。计算公式是: U=(?A-0.0058)/2.4926/30?N?20(U为胶原蛋白酶活力(U/mL);?A为样品净吸光值;N为酶液的稀释倍数。公式中的20是将50 uL酶液换算成1mL，而不是的20倍稀释倍数。) 2.4 菌种的鉴定 2.4.1 菌落形态 挑取该菌接于初筛平板上37?培养24h，菌落显圆形，边缘不整齐，表面光滑，有粘性，不透明，灰白色，滴加酸性汞试剂能产生透明水解圈，菌落直径约0.70cm，透明水解圈直径约2.60cm，形态如图3所示。 11 图3菌落及水解图 (左为平板菌落图，右为平板菌落水解圈图) Figure 3colonies and hydrolysis Figure The left plate culture map, right flat colonies hydrolysis Loop 2.4.2 显微镜观察 图4 COL-J菌显微镜下观察图 Figure 4 COL-J strains were observed under microscope chart 革兰氏染色表明，该菌为革兰氏阳性菌，菌的大小为1. 2,1. 5μm×3. 6,4. 5μm，较为粗壮，杆状，两端钝圆，染色后可以看到一端着深红色，另一端不着色结果见图4。 12 2.4.3 生化鉴定结果 菌株COL-J的 VP试验阳性;能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇;能水解明胶;不能利用丙酸盐; 吲哚、苯丙氨酸脱氨酶试验阴性;不需要KCl和NaCl;能耐受7%NaCl;最适温度30?,40?;生长温度范围为10?,50? [6]根据上述形态学及生理生化特性比较，参考《常见细菌系统鉴定手册》，将菌株COL-J初步鉴定为苏云金芽孢杆菌。 2.4.4 16s rDNA的扩增结果 2.4.4.1 PCR扩增记录 以菌株COL-J的总DNA为模板，进行PCR扩增，得到约1.5Kb的特异性扩增产物， [8]可以得到PCR电泳图诸如图5样子，记录其结果。 图5 16SrDNA的PCR产物电泳图 Figure 5 16SrDNA the PCR products of Fig 2.4.4.2 测序结果的处理 PCR产物测序结果表明，测序片断长度，记录其具有的rDNA的特征。将该序列登录到GenBank，登录号记录。采用Blasting，将该序列与GenBank的核酸数据中进行同源性比对。结果可测出该序列与芽孢杆菌16SrDNA同源性的百分数。 13 根据上述形态学、生理生化特性和rDNA的比对结果，将菌株鉴定为苏云金芽孢产胶原酶杆菌。 3 讨论 3.1 关于产胶原蛋白酶菌株的筛选 在实验过程中，发现了很多的问题，比如在初筛平板上可以看到明胶酶产生菌周围有隐约的雾状圈，通过后面实验也知道了这样选出的菌大都是能分解明胶的，而且此时的圈的边缘与滴加了酸性汞后产生的透明圈的边缘是一致的，这大大的提高了对目的菌株的筛选效率和准确度;在遇到前后两次实验得到的数据相距很远时(如菌落水解圈与菌落大小的比值)，采用多次测量后抛弃相距太远的值，再求平均的方式;在测定酶的活力的开始阶段是一个漫漫摸索的过程，往往是显色后颜色太深，仪器不能测定或是数据大大的超过了标准曲线的有效范围，需要对酶液和胶原逐个浓度的稀释，在多次的测量后确定为实验中的数据;等等。 对COL-J菌重复做了消化实验和酶活性测定实验，得到与前面实验相近的结果，表明此菌的胶原蛋白酶活力稳定。而且本实验所测的酶活是在常规条件下测定的，在后续的菌的培养条件的优化后，相信酶活力还会有很大的提高，具有更高的应用价值。 除此之外，对于苏云金芽孢杆菌的分离方法还有多种。比如离子交换法，该方法 [9]设备简单，操作方便，分离迅速且效率高。吴洪福等通过Resource Q进行阴离子 [10]交换层析纯化Cry8Ca2蛋白;韩岚岚等通过HiTrap Q柱层析分离纯化Bt Cry毒素 [11]及原毒素蛋白;Bictlot等用40%(质量体积比)的硫酸铵沉淀，再对缓冲溶液透析后分离纯化毒素蛋白。 应当注意的是，透明圈直径与菌落直径之比的大小不能完全代表酶活大小, 仅以此作为弹性蛋白酶酶活力大小的定量指标是不太可靠的，只能作为大体的依据，本实验的研究结果与之一致，如COL-J的比例为3.71，不是最大的，但却是消化效果最好的。透明圈法对于大多数的菌株还是有用的，对本实验有很好的指导意义。 3.2 进一步研究的意义 酶解胶原蛋白制备的胶原多肽具有更小的相对分子质量,并且更易降解,所以在营养保健品和日用化学品开发方面拥有一定的市场, 可将其开发成各种美容护肤品、 14 美容饮料或降血压、预防骨质疏松等的功能保健品。除此之外胶原多肽还可应用于运动保健食品中, 实验证明:由于肤在胃中排空及小肠吸收快, 负氮平衡及由此产生的肌肉分解代谢阶段将进一步缩短或消失, 胶原水解物可作为在运动或运动结束时的恢复性饮料。由于蛋白水解物属于高蛋白低热量物质, 还可应用于减肥食品。 胶原蛋白是动物结缔组织( 骨、软骨、皮肤、腱、韧等) 的主要成分, 对机体和脏器起着支持、保护、结合以及形成界隔等作用。其中结缔组织随着年龄的不断增长,会逐渐失去弹力性和柔韧性,从而相继导致引起一些与老化相关的疾病,如动脉硬 [12]化、关节炎、骨质疏松等。摄取一定量的胶原物质可起到改善此类疾病的效果。还 [13][14]可以制造人造皮肤。特别是近年秦静在CT引导下注射胶原蛋白酶治疗腰椎间盘突出症，不但大大减少了副反应，还提高了注射的准确性，这说明了在胶原蛋白酶的应用领域里还有很大的发展空间。但是由于胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构, 性质十分稳定,一般的加工温度及短时间加热都不能使其分解, 从而造成其消化吸收困难, 不易被人体充分利用。而将胶原蛋白水解为胶原多肽则其在消化吸收、营养、功能特性等方面都会得到显著的提高。目前，已从许多动物组织和微生物中获得胶原蛋 [15]白酶。 苏云金芽孢杆菌作为一种重要的生物杀蚊制剂，目前已发现多种亚种或血清型具有灭蚊活性，如Canadensisi亚种，Morrisoni亚种，Thompsoni亚种和Jegathesan [16-17]亚种等.我国是一个农业大国，农业的发展事关重大。为了更好的落实科学发展观，建立环保型，节约型农业，微生物将成为农产品优质安全生产和降低有毒物质残 [18]留提供技术和物质保证.但苏云金杆菌还存在一些问题需要进一步解决和完善。第一，Bt毒蛋白的基因抗虫谱较窄;第二，当转基因抗虫植物在大田广泛应用时。昆虫易对杀虫结晶蛋白产生耐受力，失去杀毒作用;第三，Bt毒蛋白基因在植物体内表达 [19]的水平和稳定性有问题。这些问题都是未来研究者的重要研究方向。 此外, 利用动物副产品以及制革工业中的下脚料来酶解制备胶原多肽这一功能性的多肽产品, 使其变废为宝, 减少环境污染, 必将带来良好的社会效益和经济效益。但是由于酶解选择性较强, 水解率偏低等缺点, 目前许多研究单位仍在不断地探索各种水解工艺条件, 以便更多地获得各种具有优良功能特性的胶原多肽。同时由于胶原多肽也是蛋白质的水解产物, 也存在着蛋白水解物普遍存在的苦味, 从而限制了其的应用, 因此, 减弱或消除其苦味的研究就成为人们今后研究的重点。 15 文 献 综 述 1. 胶原蛋白 1.1胶原蛋白的结构 胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白质(其分子在细胞外基质中聚集为超分子结构。胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构。其由3条a链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型。3条左手螺旋链叉相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构闭胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性等。结构决定性质，性质决定用途，胶原蛋白的结构的多样性和复杂性决定其在许多领域的重要地位。胶原蛋白产品具有良好的应用前景。 1.2胶原蛋白的分类 到目前为止，人们发现19种不同类型的胶原蛋白(其中容易分离出来且产量较高的只有5种胶原蛋白(且只有从动物的皮肤或跟腱中提取出的I型胶原蛋白的价格人们才可以接受;其它类型的胶原如?、?、V等仅在研究中制备，由于价格昂贵都不宜于大量生产。不同的物种和不同部位来的组织(多细胞动物体内所含胶原蛋白成分，目前已知种类至少有十九种如下表: 形式 各单链分子量 组织分布 ? 100,000 皮肤、骨骼、血管等多数结缔组织 ?-trimer 100,000 细胞培养、肿瘤 ? 100,000 软骨 ? 100,000 血管、皮肤、肉芽组织 175,000, ? 细胞基底膜 185,000 ? ? 透明软骨外之大部分细胞周围组织 16 ? ? 子宫、胎盘与皮肤 ? ? 表皮细胞基底膜 ? 180,000 主动脉血管细胞、角膜内细胞 ? 69,000,85,000 软骨、眼后房水 ? 59,000 肥厚组织、软骨 ? ? 皮肤、筋、软骨 XIII ? 表面组织、小肠粘膜 XIV ? 软骨、皮肤、筋、胎盘 XV ? 组织母细胞 XVI ? 立方羊膜表皮之下 XVII ? 大水疱性类庖疮 1.3胶原蛋白的特性 1.3.1低免疫原性 胶原作为医用生物材料，最重要的特点在于其低免疫原性。胶原有三种类型的抗原分子，第一类是胶原肽链非螺旋的端肽，第二类是胶原的三股螺旋的构象，第三类是a一链螺旋区的氨基酸顺序。其中第二类抗原因子仅存在于天然胶原分子中，第三类只出现在变性胶原中，而第一类抗原因子在天然和变性胶原中均存在。 1.3.2生物相容性 生物相容性是指胶原与宿主细胞及组织之间良好的相互作用。无论是在被吸收前作为新组织的骨架，还是被吸收同化进入宿主成为宿主的一部分，都与细胞周围的基质有着良好的相互作用，表现出相互影响的协调性，并成为细胞与组织正常生理功能整体的一部分。 17 1.3.3 可生物降解性 胶原能被特定的蛋白酶降解，即生物降解性。因胶原具有紧密牢固的螺旋结构，所以绝大多数蛋白酶只能切断其侧链，只有特定的蛋白酶在特定的条件下才能降解胶原蛋白，胶原肽键才会断裂。胶原的肽键一旦断裂，其螺旋结构随即被破坏。断裂的胶原多肽就被蛋白酶彻底水解。 现状 1.4 胶原酶国外研究 目前对于胶原酶的研究非常多。臭氧、胶原酶、针刀联合治疗腰椎间盘突出症 [20]的临床应用中，CT介入下臭氧和胶原酶溶盘结合腰椎间孔针刀松解治疗，已经成功用于治疗腰间椎突出症的一种有效地方法。应用胶原酶软膏治疗深?度烧伤创面的临 [21]床实验研究也证明胶原软膏能有效清除深?度烧伤创面的坏死组织，可加速创面的 [22]愈合。胶原酶也可以作为皮革中的生物催化剂处理未完全利用的燃料废液,事实证明，经过胶原酶处理过的皮，纤维基质分散良好，并且胶原酶的使用没有使皮革的强度发生大的改变，反而使柔韧性等许多综合性能得到改善。TIMP. 2 基因转染裸鼠胃 [23]癌中? 型胶原酶及? 型胶原改变的研究中表明?型胶原蛋白酶对基底的破坏是胃癌症侵润转移的重要机制。 2. 苏云金芽孢杆菌 2.1 苏云金芽孢杆菌 [24]苏云金芽孢杆菌 ,革兰氏阳性、杆状、内生芽孢, 是一种重要的杀虫细菌。它的主要杀虫成分是伴孢晶( parasporalcrystals)，伴孢晶体杀虫蛋白的表达及晶 [25]体化通常依赖于芽孢的分化与形成。晶体与芽孢的形成是一个很复杂的过程, 涉及 [26]到表达的时空调控、多种大分子物质的合成、运输与组装等。 2.2 生物农药苏云金芽孢杆菌的研究进展 [27] 苏云金芽孢杆菌制剂是目前应用广泛而有效的一种微生物杀虫剂.该文介绍了苏云金芽孢杆菌的菌种优选、发酵过程及剂型研究进展，具体阐述了发酵过程中培养基和发酵条件的优化、各种发酵方式和发酵设备等. 18 [28]2.3 苏云金芽孢杆菌芽孢萌发相关基因gerM的克隆及功能研究 依照蜡状芽孢杆菌gerM基因的保守序列设计引物，从苏云金芽孢杆菌中扩增出640bp的FGH 片段。以此为探针，从苏云金芽孢杆菌部分基因组酶切文库中成功地克隆到了一个4.5kb的DNA片段。序列分析表明，该片段包含一个完整的开放阅读框，其预测的编码产物与枯草芽孢杆菌GerM蛋白具有很高的同源性，将该基因命名为gerM。RT―PCR分析表明，gerM基因仅在芽孢形成的过程中表达。通过同源重组的策略构建了gerM基因的阻断突变株。研究表明，gerM基因的破坏影响苏云金芽孢杆菌芽孢萌发的速率和比例。 2.4 苏云金芽孢杆菌国内研究现状 苏云金芽孢杆菌作为用量最大的微生物杀虫剂之一，是当前对农业研究最多的对象。化学杀虫剂对人体的不利因素促使人们急需寻求控制害虫的替代。而苏云金芽孢杆菌在生长代谢过程中会形成芽孢，在芽孢形成一个或多个较大蛋白质性质的晶体内含体，而这种晶体含有不具活性的原毒素分子----―内毒素，并且某些菌株还会产生其他的外毒素，如―外毒素、外毒素外毒素，等等。随着基因工程的发展从基因水平研究其中控制合成这些毒素及胶原酶的基因片段来造福人类成为必然趋势。 2.5 苏云金芽孢杆菌cry基因研究进展 综述了cry 基因的分类、cry 基因与转座因子的关系、cry 基因的表达调控以 [29]及cry 基因的作用机理等4个方面的研究进展。 3(研究展望 芽孢的形成和萌发是一个受基因控制的复杂过程，是目前原核生物形态分化研究的热点之一。由于芽孢杆菌易于操作，细胞生长快且同步，群体中存在突变体，使其成为原核生物形态分化研究的最佳模式之一。经过多年的研究，尤其是近年来基因芯片技术的成熟和应用，已经发现有405个基因参与了芽孢的形成和萌发，对其机制有了初步的了解。但其中很多基因的具体功能和分子作用机制均不是很清楚. 深入研究cry基因的表达调控，对于从分子水平了解Bt的杀虫机制和昆虫对Bt的抗性具有重要的意义，也可为转Bt基因杀虫植物提供新的策略。应用分子生物学的 19 手段，对天然菌株ICP基因重组改造，构建高产稳定的工程菌，以提高杀虫效率，扩 大杀虫谱，防止昆虫抗性的发生。 胶原蛋白作为一种重要的天然蛋白质资源(无论在生物医学、食品保健还是 在化妆品、纺织行业中的应用都十分广泛(综合利用方面的研究进展速度很快(其良 好的生物相容性、生物可降解性，使在食品工业中的发展具有广阔的应用前景。 参考文献 [1]朱仕房，杨耀中，双水相体系分离苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究[J].世界农药， 2000,22(5):39-42. 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[29] 李雪雁,李照会,许维岸. 苏云金芽孢杆菌cry基因研究进展(J).昆虫知识.2003,40(1):9-13. 21 致谢: 本论文是在张光祥教授的悉心指导下完成的，凝聚了指导老师大量的心血。长期以来张老师在百忙之中不断断对我的指导，给我的学习以无微不至的关心和帮助，而且张老师对我的指导不仅是在学习上的，他更以自己的严谨治学、勤勉工作和豁达胸怀教给了我许多做人的道理。 在论文顺利完成之际，我谨向尊敬的张光祥老师致以最诚挚的谢意～ 同时，在论文的过程中，特别感谢同窗的热心的帮助和鼓励。 22