灵芝生物富硒及富硒灵芝硒蛋白的分离纯化和抗氧化性研究（可编辑）

灵芝生物富硒及富硒灵芝硒蛋白的分离纯化和抗氧化性研究（可编辑） 灵芝生物富硒及富硒灵芝硒蛋白的分离纯化和抗氧化 性研究 中国农业大学博士学位论文 中文摘要 摘 要 灵芝是我国传统的药食珍品,硒则是人体的必需微量元素,以灵芝子实体进行生物富硒的研 究,国外未有报导,国内也较少见而且尚待深入。因此,本实验对填补基础领域研究的空白、探 索应用领域新的补硒资源和更有效的生物活性因子有着重要的意义。本论文的主要实验结果如 一下 培养基中硒的浓度为即吮时,可以获得产量及富硒量较为理想的富硒灵芝子实体 硒可以明显提高灵芝中多糖、蛋白质以及氨基酸的含量,但并不改变灵芝蛋白质的分布和蛋白质 中氨基酸的组成配比 矿质元素中硒有极明显的增加,铜、钥等有一定量的增加,而铁、钙、铭 等则有所下降。 在富硒灵芝子实体中, 以上的硒以有机硒形式存在,并主要以非 硒代蛋氨酸硒代半胧氨 酸 的形式与蛋白质结合,其中水溶性蛋白和碱溶性蛋白是灵芝结合硒的主要蛋白,合硒量 占蛋白硒的 以上 此外,应用 聚丙烯酞胺凝胶电泳 分离富硒灵芝子实体 中的含硒蛋白组分,并采用氢化物原子荧光法 测定蛋白或肤链条带中硒的含量,结果 明 在分辨出的 条蛋白条带中,分子量在的蛋白或肤链均结合了不同程度 的硒,但硒主要分布在分子量不超过 的蛋白或肤链中。 富硒灵芝碱溶性蛋白的等电点初步确定在 左右,抗氧化活性在?以下稳定。蛋白 先经过葡聚糖凝胶 分子筛层析,再进行强阴离子交换树脂离子交换层析后,所获得的富硒灵芝含硒蛋白结合的硒量最高,每克蛋白含硒可高达顺磁共振自旋捕集技术 和体系微弱发光法清除羚自由 基和超氧自由基 王? 的实验以及抗损伤作用的研究发现,富硒灵芝蛋白和富硒 灵芝多糖均具有较强地清除, 和 三?的活性,抗氧化作用强于对照一普通灵芝蛋白和普通灵芝 多糖 硒与灵芝蛋白之间具有抗氧化协同作用,但硒与灵芝多糖以及灵芝蛋白与灵芝多糖之间则 无此协同作用但却可以彼此增强抗氧化的活性 富硒灵芝蛋白为 兼型抗氧化剂,能明显抑制和延 迟的氧化损伤发光,而且蛋白浓度与延迟时间之间存在着显著的线性依赖关系。此外,大 鼠红细胞生物模型实验的结果表明,富硒灵芝蛋白能够剂量依赖性地抑制过氧化特丁烷 引起的大鼠红细胞溶血、减少红细胞过氧化脂质产物一丙二醛 的生成,以及抑制高铁血 红蛋白的产生和聚积,保护红细胞中的氧合血红蛋白免受氧化损伤。 综上所述,富硒灵芝子实体是一种理想的补硒资源,其中主要赋存硒的灵芝蛋白更是灵芝中 除多糖之外的另一种高生物活性因子,值得进一步深入研究和开发应用。 关键词 富硒灵芝子实体,硒蛋白, 顺磁共振自旋捕集技术,微弱发光,红细胞 中国农业大学博士学位论文中国农业大学博士学位论文 丁 组绝绝里旦旦旦旦旦旦旦旦旦旦竺里 妙独创, 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业大学或其它教 育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 瓜 褥 俨 研究生签名 时间 “年了月廖日 声 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即 学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分。 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 研究生签名 时间 ,,?、年了月 日 导师签名 时间 、年断月了日中国农业大学博士学位论文 第一章 文献综述及立题分析 第一章 文献综述及立题分析 灵芝生物学研究进展 灵芝,别名“石耳”,古称“瑞草”,俗称“仙草”、“还魂草”,在真菌分类中属于担子菌纲、多 孔菌目、多孔菌科、灵芝属。早在两千多年前的春秋战国时期,我国古代劳动人民和名医就认识 和利用了灵芝,将其作为上上品滋补药材用于治病保健,在“神农本草经”、“名医别录”、“新修 本草”、“日华子本草”、“开元本草”、“滇南本草’,、“本草纲目”等医学专著中,称其有“益心气,’ “益精气”、“安精魂”、“补肝益气”、“疗虚劳”、“坚筋骨”、“利关节’夕、“治耳聋”、“好颜色”等 功效,灵芝一直被视为可以“滋补强身”、“扶正固本”、“延年益寿”的珍品和我国中药及传统食 疗宝库中的瑰宝。在《美国草药药典》 和治疗纲要》 中对灵芝也有记载。 目前,已知灵芝属约有 多种,分布最广、药理价值最高的为赤芝和紫芝 的。由于灵芝独特的药用价值,有关灵芝的栽培技术、有效成分的提取、分离、纯化以及 其生物学活性和药理价值的研究己引起了国际上的关注,尤其在日本、韩国、美国等国家。至今, 对灵芝的研究已深入到分子生物学水平,研究、专著和灵芝的相关产品已陆续问世陆文良 等, 赵继鼎等,王杰等, 主要生物活性成分 灵芝的生物活性成分十分丰富。目前已分离到的有 余种化合物,可分为多糖类、核昔类、 吠喃类、生物碱类、氨基酸蛋白质类、三菇类、油脂类、幽醇类、有机锗、矿质元素等 大类, 其中研究较为广泛的主要功效成分有下列几种。 灵芝多箱 灵芝多糖是灵芝的主要活性成分,也是灵芝研究中最深入广泛的一类化合物。 年代对灵芝 多糖的研究主要集中在多糖和多糖组分的分离、制备及药理作用方面, 年代和 年代则主要 集中在灵芝多糖及多糖复合物的结构及其与功能的关系方面。 灵芝多糖的种类很多,有葡聚糖、杂聚糖、半乳糖、甘露糖、甘露岩藻半乳聚搪、阿拉伯糖、 阿拉伯木质葡聚糖等 多种。一般认为,灵芝多糖的主链越长,侧链频率越高,分子量越大,生 物学活性越高。灵芝多糖的分子量一般大于 才具有生物活性, 小于此值则活性很低或完全 没有生物学活性。灵芝多糖分为 型和型 两种, 型多糖没有活性,有活性的多糖均为 型结构,具有以 糖昔键相连的主链。糖昔 键连接毗喃葡萄糖残基,并在主链的第。 少数在。 碳原子处具有侧链,该结构为灵芝多 糖抗肿瘤活性的最小共同单位 ,中国农业大学博士学位论文 第一章 文献综述及立题分析 巴旦曰口口巴里曰目里旦烈里巴巴口 灵芝多糖的主要生物活性为 调节免疫 抑制肿瘤激胰岛素分泌,促进葡萄糖在外 周组织的利用,降低血糖 促进核酸、蛋白质的合成关洪昌等, 消炎 ,防护 射线辐射所致小鼠骨髓微核效应。 三菇类 灵芝三菇类化合物属于高度氧化的羊毛凿烷衍生物,按分子中所含碳原子数可分为和 。三大类,是灵芝的苦味成分,也是灵芝有效成分中极为重要的具有明显生理活性的一类化 合物,能抑制小鼠细胞组织胺的释放,抑制血管紧张肤转化酶的活性,降低血压 ,抑制大鼠肝细胞从一二氢羊毛街醇合成胆固醇,防止动脉粥样硬化 和心脏病,以及杀伤体外培养的肝癌细胞蛋白质、多肚、氨基酸 灵芝中含有 的粗蛋白,有的以糖蛋白的形式存在。张万庆等人 从灵芝属的一种 菌种 培养的菌丝体中提取了一种具有血凝活性的蛋白质组分,含糖量约为 ,分子量约为 并含有两种分子量接近的亚基张万庆等, 等从深层 发酵的灵芝菌丝体中首次分离到一种新的蛋白质,命名为采用氨基酸自动测序仪 测定,发现其分子形状 个残基与己提出的免疫球蛋白非常一致,其结构与免疫球蛋白重链的 可变区相似,完全水解后得到 种氨基酸。该蛋白能调节体液免疫,阻止过敏反应介质 的释放,在体外可促进小鼠脾细胞的有丝分裂,在体内通过减少抗原诱导型抗体的形成以及完全 阻止自发免疫性糖尿病小鼠的发病率而显示出免疫抑制作用等 此外,灵芝中还含有少量的多肚和氨基酸。 药理作用 延级衰老 灵芝能提高机体超氧化物歧化酶的活性,清除体内自由基,保护细胞膜、细胞器、核酸、酶 等不受自由基破坏。此外,灵芝还能促进肝脏和骨髓细胞合成蛋白质和 促进骨髓细胞合成关洪昌等。,增强机体的免疫能力,提高机体的 生命力。 关于灵芝延缓衰老的机制研究,目前在动物实验的水平上已证明,灵芝多糖可以恢复老年小 鼠脾细胞对 的敏感性,增加老年小鼠抗的 数目,在整体情况下明显恢复老年小 鼠多聚酶 的活性,继而促进细胞增殖分裂,导致 合成、分泌的增加雷林生等, 第一派 文献综述及立题分析 中国农业大学博士学位论文 镇痛、镇静、抗惊厥 灵芝有明显的镇静与镇痛作用,能抑制小鼠的自发性活动,加强巴比妥类药物的中枢抑制作 用时间,延长小鼠对疼痛反应的潜伏期,大剂量能使多数大鼠耐受电击,而不发生惊厥余尊详, 对心血管系统的作用 灵芝能增强心肌收缩力,扩张冠状动脉,增加心肌含量,改 肌缺氧状态,对抗垂体 后叶素引起的急性心肌缺血,降低血压,延缓并减轻动脉粥样硬化的形成,以及改善内脏微循环四川医学院药理教研组, 镇咳、祛痰 灵芝有明显的止咳、祛痰作用,对慢性支气管炎有治疗作用。灵芝发酵液能抑制致敏豚鼠肺 组织释放组织胺,对组织胺引起的离体气管平滑肌收缩有解痉挛作用,并有剂量反应关系。而且 还能完全拮抗乙酞胆碱和氛化钡引起的离体气管平滑肌收缩北 京医学院药理教研组, 调节血精 从赤芝提取的葡萄糖、杂多糖、肤聚搪等具有降血糖作用。赤芝葡聚糖能刺激胰岛素分泌, 促进葡萄糖在外周组织的利用,对高血糖小鼠有明显的降血糖作用 保肝解毒,促使肝细胞再生 灵芝多糖 可加速核酸和蛋白质的合成,调节细胞代谢,提高机体的防御功能。对四氯化 碳中毒小鼠血清谷丙转氨酶和肝脏甘油三酣含量的升高有明显的拮抗作用 能显著增加小鼠对洋 地黄毒贰和消炎痛毒性的耐受性,减少中毒引起的死亡 减轻乙硫氨酸引起的小鼠肝脏脂肪的蓄 积,提高小鼠肝脏代谢戊巴比妥钠的能力,促进肝脏部分切除小鼠的肝脏再生 增强免疫 灵芝能促使淋巴细胞增殖,增强巨噬细胞吞噬异物的能力,提高机体保卫细胞 细胞的活 性,提高激活状态下巨噬细胞产生白细胞介素 的能力,促进脾细胞产生白细胞介素 和肿瘤 坏死因子张罗修等, 中国农业大学博士学位论文 第一幸 文献综述及立分析 抑制肿瘤 灵芝提取物对多种恶性肿瘤,如 肉瘤、肺癌、结肠癌、小鼠艾氏腹水癌等的生 长有抑制或杀伤作用 杨玉秀等, 灵芝多糖是灵芝发挥抗肿瘤作用的重要活性成分,多糖的分子量、分子结构等直接影响着灵 芝的抗肿瘤活性。多糖的分子量时才显示出强的抑制肿瘤活性,而且活性的强弱与多糖 链分枝的程度及支链上轻基取代的数量相关。 灵芝多糖口服给药剂量 小鼠 ,足趾接种和腋皮下接种对 肺癌的 抑制率分别为和 对结肠癌的抑制率分别为 和阂三弟等, 。研究认为,灵芝多糖的抗癌机理可能通过抑制癌的合 成徐朝辉等, ,刺激宿主的非特异性抗体的产生殷勤燕, ,或者抑制细胞 的增殖并诱导 细胞的凋亡胡映辉等而达到抗癌的目的。 硒的生物化学及生理药理研究进展 硒的生物大分子化合物 在自然界中,硒主要以硒酸盐 亚硒酸盐 、单质硒以及生物体转化后的有 机硒等形式存在。而在生物体中,硒则主要以含硒氨基酸的形式存在。迄今为止,人们从哺乳动 物和微生物中检测到的含硒氨基酸主要有两种 硒代半肤氨酸 和硒代蛋氨酸 。而在植物体内,硒的存在形式就比较复杂 除了上述两种常见的含硒氨基酸 外,硒还以含硒氨基酸衍生物的形式存在徐辉碧等, 全宗喜等, 由含硒氨基酸构成的硒蛋白是生物体内主要的含硒物质,其中许多被发现具有重要的生理功 能得到了广泛的研究。除此之外,硒还能与多糖和核酸结合,形成含硒多糖和含硒核酸,它们与 硒蛋白一起构成了生物体内主要的含硒生物大分子物质。 硒蛋白动物硒蛋白 在哺乳动物中,约有 的硒是以含硒代半胧氨酸的硒蛋白形式存在,而且已确定硒蛋 白中硒参入到蛋白质分子是通过硒 半肤氨酸一识别 中特异的密码子将硒代半 肤氨酸插入硒蛋白中 张在香等, 。目前已发现的硒蛋白有 种, 种 研究得比较清楚,其中 种是硒酶或具有硒酶的活性表 刘学诗, 谢忠忱等, 第一章 文献综述及立题分析 中国农业大学博士学位论文 表 哺乳动物主要硒蛋白及其生理功能英文全称 生理功能 硒蛋白 谷脱甘肤过氧化物酶 抗氧化 清除过氧化氢、脂及磷脂自由纂 保护膜结构蛋白、等生物大分子 调 节廿碳化合物合成,参与炎症调节。 脱碘酶催化 脱碘,合成并调节活性甲状腺素 水平。 硫 氧 还 蛋 白 还 原 酶 还原核普酸参与合成 再生抗氧化体系 维持细胞内氧化还原状态 在细胞生长和增殖中起关键作用 通过氧化还原修饰作用于 转录因子而调节表达。 硒磷 合成催化硒磷脂化合物合成,提供 硒供体,参 与硒蛋白合成。精子线粒体膜硒蛋白具有 样活性,防止精子发育过程中的氧化损伤,阻止成熟精子之间结构蛋白的聚合, 维持精子的稳定性和活力。 精子结合硒蛋白 有 样活性 存在于精子核内,可能对精 子的生成起作用。 前列腺上皮硒蛋白在前列腺分泌部上皮细胞中发现,具有与 相似的功能,有防止腺细胞癌变作用 硒蛋白存在于血浆,含有 或 个,与内皮细胞 结合,有保护内皮细胞抗氧化损伤活性。另有 认为其是血硒的贮运蛋白。 硒蛋白 主要存在于肌肉组织,对维护肌肉组织的正 常功能是必要的硒蛋白 在肾及大量组织中存在。是防止硒缺乏的一 种重要硒蛋白。 微生物硒蛋白 早在 年就发现,大肠杆菌中的甲酸脱氢酶的活性与硒有关,但直到 年甲酸 脱氢酶才被正式鉴定为硒酶。迄今为止,已经有七种细菌蛋白被鉴定为硒酶见表 。由于动物 和植物生产的局限性以及生物技术的蓬勃发展,微生物已成为硒蛋白的重要来源。富硒酵母、富 硒乳酸菌、富硒金针菇、富硒灵芝等目前都己得到了不同程度的研究与开发利用。中国农业大学博士学位论文 第一章 文献综述及立题分析 表 细菌硒蛋白种类 分子量来源 甲酸脱氢酶 甘氨酸还原酶 烟酸 化酶 黄嚓吟脱氢酶 曰 硫酶 几 含硒氢化酶气 、 含钨甲酸脱氢酶植物硒蛋白 土壤和大气是植物硒的主要来源。根据植物对硒积聚能力的不同,分为硒积聚植物和非积聚 植物。一般认为硒积聚植物硒结合蛋白很少,而非积聚植物硒则主要与蛋白质结合,而且主要以 硒代蛋氨酸 存在,也有硒代半肤氨酸 黄峙等,。此外硒还可以以 甲基硒代半肤氨酸、丙烯基硒代半肤氨酸、硒代高胧氨酸、 谷氨酞基一硒甲基硒代半肤氨 酸、硒代胧硫醚和硒甲基硒代蛋氨酸等含硒氨基酸衍生物形式存在硒多搪 硒多糖在自然界的存在已得到了证实,其中硒可能以两种形式存在 杨铭 年就从湖北恩施富硒大蒜中分离出一种大蒜含硒多糖,并通过 高效液相色谱、 纸上层析、红外光谱证明 大蒜含硒多糖是一种甘露聚糖,平均分子量约 ,其中硒 可能以硒酸酣形式存在 。陈春英用若叶多搪与硒化物反应得到硒酸酷多糖, 并通过对其生物活性的研究表明,筹叶硒多糖能有效地提高血液中的硒含量和的活性, 明显地增强免疫能力陈春英等, 。尚德静则从硒灵芝菌丝体中分离纯化出两种灵芝硒多 糖 和 ,确定了两者均是由。月塘昔键连接的毗喃多搪,并分析出 和两种单糖的组成分别为和尚德静, 。周志刚等从添加硒的三种螺旋藻中分离出胞 内多糖和胞外多糖,经测定多糖中结合有硒,推测硒与藻体表面多搪分子形成了硒酸醋,认为胞 外的氧化环境相比胞内的还原环境更有利于使多糖与金属离子和亚硒酸根离子形成配合物周志 刚等, 中国农业大学博士学位论文 第一章 文献综述及立皿分析 硒核酸 早在 年, 等就从大肠杆菌中发现 含硒 的存在 但直到 年,等才证实硒代半肤氨酸 能键合在一种特异的上。发现能 携带 并识别的是阐明硒蛋白合成的分子生物学机理最直接有力的证据。 指 认它为 ,并相继有人发现和一些异构体,它们的水平 与硒蛋白的表达及 活性是一致的黄峙等, 另外,在研究生物体对硒的代谢转化中,一些学者也发现了核酸中存在有硒 胡文军等研究 硒在金针菇体内的生物转化时,发现硒核糖核酸中硒的含量占总 有机硒含量的 胡文军等,姚敏研究富硒灵芝中硒含量分布和赋存形态时指出,核酸硒为样品总硒的 姚 敏, 。左银虎也论述了植物中除硒蛋白外,一部分有机硒是以结合态存在的,植物中 已发现的确切形式都是转移核糖核酸,结构为 甲胺基硒代尿啼淀左银虎, 这些结果说明了核酸中存在硒,但硒核酸的结合形式除较清楚的 外,还没有发现 或直接键合硒。 硒的生化功能和对人体的作用 硒缺乏对代谢的影响表现在 对某些氧化损伤的敏感性和甲状腺激素代谢的改变,对汞损伤 敏感性的增加,生物转化作用酶类活性的改免和血浆 浓度的增加。通常认为硒是通过硒蛋 白发挥作用的。人体的低硒状态及硒的营养状况与关节炎 癌症、心血管病、白内障、胆汁郁积、克罗恩氏病 婴儿碎死综合症囊肿性纤维化 搪尿病、甲状腺肿 免疫缺陷 、大骨节病、克山病 、淋巴 细胞性贫血、肌肉萎缩症、中风 和溃疡 性结肠炎 等 余种疾病的发病率密切相关 克山病是一种地方性心肌病,主要影响我国某些严重缺硒地区的儿童和育龄期妇女 ,在这些人群中若干评价硒营养状况的指标降低,而且大规模的 干预实验肯定了补硒在 控制克山病中的效果。大骨节病则是在青少年期发生的一种地方性骨关节病, 也是在我国发现的另一种与低硒状态有关的疾病。此外,和 分别对急性粒细胞性白血病病人和儿童急淋患者的血硒研究发现,病人血硒含量 明显下降,病情好转时血硒含量则明显上升 ,硒缺乏与 白血病正相关,补硒可以明显提高白血病小鼠的生存期,每月给予 及 亚硒酸钠可相 应延长存活时间和 。而硒与癌症的关系研究则可以追溯到 年 和的研究报道, 和通过对美国一些城市和地区土壤和 谷物中的硒水平与人类癌症之间关系的考察,认为几种消化道癌症与膳食硒水平相关 年对 个国家和地区乳腺痛、子宫痛、直肠癌、前列腺癌和血癌第一章 文献综述及立题分析 中国农业大学博士学位论文 的发生率与膳食硒含量的关系进行研究,同样得出膳食硒水平与人类癌症之间存在负相关 。目前认为硒防癌、抗肿瘤的机制可能有以下几种 硒是癌基因表达的 调控因子 ,硒抑制蛋白激酶 的活性陈焕朝等,硒 能影响癌细胞的遗传物质 ,及硒抑制了癌细胞的能量代谢等于树玉等, 但归根结蒂,硒在防癌中的作用主要基于两个方面 一方面,硒是 多种抗氧化酶的必需构成成分 另一方面,硒的代谢产物本身具有抗癌的作用 人体硒的需要量 。年美国国家科学院食物营养委员会建议成人每日安全和适宜的膳食硒摄入量估计为,这是第一个膳食硒 年中国根据膳食调查 结果确定了硒的最低日需要量,即成年男女每日分别达到 和 以预防克山病 成 年中国营养学会推荐的每日膳食硒的供给量为 中国营养学会,年美国国家科学院食物营养学会以 作为硒的推荐膳食供给量 的基础年英国食物政策医学组的膳食参考值委员会采用 和 分别作为男、女成人硒的参考营养素摄入量〔 年中国营 养学会制定了中国居民膳食硒的参考摄入量 ,提出成人膳食硒平均需要量 为 ,推荐摄入量刊门 为 ,可耐受的最高摄入量 为,并制定了不同 年龄组、孕妇和乳母的膳食硒参考摄入量中国营养学会, 。实际上,在不同地区,正常 人群日摄入量的闽值是不同的,俄罗斯为、美国为、加拿大为、孟加 拉为规定为 黄峙,硒的缺乏、补充与富硒食品的研究现状 土壤缺硒是世界上广泛存在的问题,全世界有 多个国家和地区不同程度缺硒,其中新西 兰和芬兰最为严重。因为硒在地壳中的含量相当稀少和分散,其丰度约为地壳的。地球 土壤的自然含硒量一般也只有,平均为 。我国恰恰处在全球 的缺硒带,从东北到西南跨越了二十二个省市自治区,全国除湖北恩施、陕西紫阳两地是天然富 硒地区外,有 的地域为不同程度缺硒区。 目前,补硒剂主要有两类,一是无机硒如亚硒酸钠、硒酸钠,二是有机硒,包括有机硒制剂、 富硒地区出产的天然产物、以及人工生物转化的各种动、植物和微生物产品,如硒代蛋氨酸、富 硒鸡蛋、富硒茶叶、富硒水稻、富硒酵母、富硒灵芝、富硒螺旋藻等。 由于有机硒补剂特别是富含硒代氨基酸的产品在毒理安全性、生理活性和吸收率上的优越 性,因此这类产品的开发与研究一直广为关注。目前认为,人体内的硒存在于硒代蛋氨酸代谢库 和硒调节代谢库中。由于人不能在体内合成硒代蛋氨酸 ,因此,硒代蛋氨酸全部来自于 外源供应。当膳食硒供应不足时,人体会动用硒代蛋氨酸代谢库中的硒代蛋氨酸通过转硫途径降 解为硒代半胧氨酸,供人体合成硒蛋白。此外如同硒酸盐或亚硒酸盐一样,含硒氨基酸可为含硒 酶的合成提供硒。然而只有硒代蛋氨酸可直接参入到蛋白质中而贮存于机体内,并可通过正常的盘翌鉴型鉴鳖鳖坛一一一一一一一一 代谢过程可逆性地释放出来。在营养范围内增加硒的摄入量,组织的硒水平升高并最终维持于稳 定态,从而可防止硒在体内累积至中毒水平。补充硒代蛋氨酸的动物较补充亚硒酸钠的动物在停 比补充硒后,可在更长的时间内保持含硒酶的更高活性。对于乳母,硒代蛋氨酸或硒酵母可阻止 血浆硒和母乳硒的水平以及谷肤甘肚过氧化物酶 的活性下降,服用硒代蛋氨酸者乳 汁中的硒含量要明显高于服用亚硒酸盐者李以暖等, 牟维鹏,。此外在抗氧化作 用方而,虽然硒代蛋氨酸硒代半跳氨酸、亚硒酸钠 均可与过氧化氢反应,但 二级反应速率差异较大。一般而言,有机硒大于无机硒,从而表现出较高的抗炎活性基于有机硒补剂的优越性和天然有机硒资源的限制性,国内外学者对利用生物转化富集夕 性无机硒来生产有机硒补剂进行了大量的研究。在选用生物载体方面,目前人们己利用食用菌为 载体培育出富硒酵母、富硒灵芝、富硒螺旋藻、富硒金针菇、富硒平菇、富硒香菇和富硒猴头菌 等,利用作物为载体栽培出富硒水稻、富硒玉米、富硒麦芽、富硒茶叶、富硒草墓等,利用动物 为载体生产出富硒鸡蛋、虹蜕富硒蛋白等。富硒灵芝的研究进展 富硒灵芝的栽培 富硒灵芝的栽培分为以下两种方法 一是人工栽培富硒灵芝子实体,二是用液体发酵培养 富硒灵芝菌丝体。这两种方法均通过在培养基中添加亚硒酸钠,利用灵芝菌种自身的生长代谢过 程,从而将无机硒转化为有机硒,并自然地达到一定程度地生物富集。一般来说,栽培的富硒灵 芝子实体富硒水平低于液体发酵制备的富硒灵芝菌丝体。姚敏、康中云、浙江金华晓明真菌研究 所人工培育的富硒灵芝的硒含量分别达到 和 姚敏, 康中云等, ,基本在几十至一百多”吮的水平。而石玉娥、王关林、邓百万和中德联合研究所液体培 养的灵芝菌丝体硒含量分别达到 和 石玉娥等, 王关林等, 邓百万等, 涂秀英等,。一般均在几百至几千 的水平。由于液 体发酵要求的设备和发酵技术水平较高,而且不能获得完整形态的灵芝子实体包括抱子粉,因此 在一定程度上影响了灵芝产品的开发与推广应用。 无论是人工栽培还是液体发酵,在研究中均证明,灵芝对硒有一定的耐受性。而且富集的硒 的浓度在一定范围内,随培养基中的亚硒酸钠浓度增加而增加, 但获得的产量却一定程度的有所 降低。如姚敏实验显示,当培养基中硒浓度低于 时,灵芝子实体中富集硒的水平与培养 基中硒的浓度线性相关 但只有培养基中硒浓度低于回 时,灵芝的产量才没有明显受到影 响〔姚敏,。邓百万则证明液体发酵云芝灵芝的另一品种,培养基中最佳的硒浓度为创匕 因为得到的菌丝体数量随着培养基中硒浓度的增加而减少邓百万等, 石玉娥的实验也 显示当培养基中的亚硒酸钠浓度超过 时,灵芝菌丝体已死亡。但在 以下时,菌丝体中硒 的浓度则随着培养基中硒浓度的增加而显著增加石玉娥等, 因此,在灵芝富硒的过程中,应综合考虑产量、富硒水平、人体的每日需要量和产品的最终 定位等方面的因素,以求硒的转化更经济有效中国农业大学博士学位论文 第一派 文献综述及立睡分析性质研究 可以说这方面的研究并不够深入,目前可见的报道较少。如姚敏通过持续透析及分析灵芝主 要生化组成中硒的含量,确定硒灵芝子实体中的硒为有机态,其中蛋白硒占 核酸硒占 ,多糖硒占。此外他还将蛋白质进一步分组为水溶 性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白和碱溶性蛋白 并测定出碱溶 性蛋白结合硒量最多占总蛋白硒 的 ,但硒在硒蛋白中存在的具体形式并未确定姚敏等, 。尚德静则从硒灵芝 菌丝体中分离纯化出两种灵芝硒多糖 和 ,并经过 气相层析、 薄层 层析和红外光谱确定两者均是由“糖昔键连接的毗喃多糖。由 种单糖组成, 由 种单糖组成,但并未明确硒与多糖的结合形式尚德静等,。因此,该领域还有很大的研 究空间。 功效学研究 在功效学实验研究方面,王关林以正常对照组、无机硒组、普通灵芝粉组和富硒灵芝粉组进 行了抗氧化能力小鼠实验,结果表明 富硒灵芝比普通灵芝表现出更好的生物效应,而且无论富 硒灵芝还是普通灵芝均比无机硒组,更显著地增加了小鼠和 的活性,而无机硒组 并不能增加 活性,推测富硒灵芝内的有机硒与灵芝的主要营养成分一灵芝多糖间存在协同 作用王关林等,。张宏莲采用硒云芝多糖与云芝多糖进行对比,进行巨噬细 胞一氧化氮的影响实验,也证明硒云芝多糖在预防动脉粥样硬化 时,可能是更好的选择,并推测 这可能与硒保护巨噬细胞免受氧化 的损害相关张宏莲,。王鑫国、石玉娥则选用富 硒灵芝与普通灵芝为对照,分别进行了富硒灵芝对大鼠不全脑缺血再灌损伤和富硒灵芝对实验性 大鼠脑梗塞引起损伤的影响实验。结果表明 富硒灵芝能降低鼠脑含水量、钙离子及 含量, 提高 活性,对大鼠不全脑缺血再灌损伤有一定保护作用以及富硒灵芝能减轻大鼠大脑局部 缺血所致脑组织损伤,缩小梗塞体积,改善神经损伤症状,并可抑制大鼠体内的血小板凝集及体 外血栓形成,从而保护实验性大鼠的脑损伤。但普通灵芝均未表现出上述两种保护作用王鑫国 等, 石玉娥等, 。此外涂秀英证明了硒灵芝菌丝体对动物具有很强的抗氧化作用, 可有效降低小鼠体内过氧化脂质,提高、改善学习记忆能力及明显增强机体抗疲劳能力涂秀英, 立题分析 年我国完成的总膳食调查发现,每天硒的摄入量是推荐供给量的 葛可佑等, ,平均为,比 年膳食调查结果的日硒平均摄入量 有所提高,但北方二 区和南方二区的日硒平均摄入量水平仍旧较低。分别为 和 曲 宁等, 距离中国农业大学博士学位论文 第一章 文献综述及立题分析 巴里巨旦里口里巴里巴口巴口旦旦旦 中国营养学会制定的参考摄入量中的推荐摄入量仍有一定距离。而且,迄 今为止,不少研究认为在把硒当作免疫刺激剂和抗癌剂时,硒日常摄入量需提高到 。因此,选优并科学合理地补硒是关系到人类健康及我国国民体质的重要问题。 而灵芝作为我国中药和传统食疗宝库中的珍品,食补、药用的历史渊远流长、深入人心。灵 芝不仅具有抑制肿瘤防治癌症的确切功效,而且已在临床上被作为癌症患者进行放疗、化疗和手 术治疗时并用的“生物反应修饰剂”或“免疫调节剂” ,但灵芝 本身却缺乏 年 月被美国食品药品管理局认可的抑癌剂一硒,普通栽培或野生的 灵芝的硒含量很低,一般在 水平以下。因此利用灵芝进行生物富硒,一方面可以提升灵芝本 身已有的药理价值和营养价值,开拓我国传统中草药和食疗品种研究的思路,填补目前国内外在 灵芝生物富硒领域研究的空白和不足,弘扬我国传统的药食珍品,另一方面也是对新的补硒资源 和更有效的生物活性因子的探索。 实验内容和设计 本论文以灵芝子实体为实验原料,通过分析生物富硒对灵芝产量及主要营养成分的影响,初 步考察灵芝富硒的实践意义,再研究硒在灵芝子实体中的赋存形态,从而锁定一种结合硒量最多 的营养成分进一步分离纯化,最后从化学体系到生物体系应用不同的方法探讨富硒灵芝子实体的 抗氧化作用,从机理上阐明灵芝子实体生物富硒的理论价值和应用前景,具体实验设计如下 灵芝富集硒对其产量及其主要营养成分的影响 硒对灵芝子实体产量和硒富集能力的影响硒对灵芝多糖和灵芝蛋白含量的影响硒对灵芝蛋白和灵芝多糖结合硒能力的影响硒对灵芝蛋白分布的影响硒对灵芝蛋白中氨基酸构成的影响 硒对灵萝矿物质如成的影响 硒在富硒灵芝中的分布 富硒灵芝中硒的有机化程度富硒灵芝中有机硒的分布富硒灵芝中蛋白硒的分布富硒灵芝中含硒蛋白的分子量分布富硒灵芝蛋白中硒代氨基酸的分布中国农业大学博士学位论文 第一录 文献综述及立顺分析 富硒灵芝碱溶性含硒蛋白的分离纯化 富硒灵芝蛋白等电点的初步确定富硒灵芝含硒蛋白的分离纯化 强阴离子交换树脂和弱阴离子交换树脂分离纯化富硒灵芝蛋白效果的比较 凝胶层析分离纯化富硒灵芝蛋白 离子交换层析联合 纤维素离子交换层析 离子交换层析与凝胶层析顺序对蛋白分离效果的影响 富硒灵芝含硒蛋白清除自由基活性的热稳定性研究 富硒灵芝抗氧化作用及机理的研究邻二氮菲氧化法检测 产生的轻自由基微弱发光法抗损伤作用研究顺磁共振自旋捕集技术 清除和 ?作用研究富硒灵芝蛋白对过氧化特丁烷引起的红细胞脂质过氧化损伤的抑制作用中国农业大学博士学位论文 第二幸 灵芝富集硒对其产 及其主要营养成分的影响 第二章 灵芝富集硒对其产量及其主要营养成分的影响前言 中国不仅是世界上认识、利用灵芝最早的国家, 同时也是全世界灵芝最大的生产国,年产人 工栽培灵芝 吨以上 。因此, 如何发挥我国的传统优势,并结合现代生物 技术的手段,深入挖掘传统药食两用品种的功效潜力 ,是不少学者孜孜以求的研究课题。 姚敏利用棉籽壳做培养基,通过添加亚硒酸钠和菌种驯化,获得了含硒昨的富 硒灵芝子实体,并发现 当培养基中硒浓度低于 时,灵芝富集的硒量与培养基中硒的浓 度线性相关 ,而且只有当培养基中硒浓度低于 时,灵芝的产量才没 有明显受到影响 姚敏, 。石玉娥、邓百万在用液体发酵分别培 育富硒灵芝和富 硒云芝菌丝体中也同样发现,灵芝或云芝菌丝体对硒的吸收与浓度成正相关,但菌丝体的产量却 随着培养基硒浓度的增加而下降,指出培育富硒灵芝、富硒云芝菌丝体时,培养基中亚硒酸钠的 最佳浓度分别为吮和 石玉娥等, 邓百万等, 在富硒对灵芝营养成分的影响方面,王关林通过对富硒灵芝子实体和普通灵芝子实体的成分 测定中发现 灵芝子实体富硒后,脂肪、灵芝多糖、总糖含量比普通灵芝稍高,而蛋白质含量则 显著增加,并且除肤氨酸 、苯丙氨酸、酪氨酸 外,其余氨基酸均有不同程 度的提高王关林等,。牛丽颖则在对富硒灵芝菌丝体中微量元素及氨基酸的测定中也发 现 富硒灵芝菌丝体中锌、铜、钙的含量低于普通灵芝菌丝体,但铁、镁含量却明显提高,而且 氦基酸的总量富硒灵芝菌丝体 显著高于普通灵芝菌丝体 牛丽颖等, 有趣的是 在硒对土豆含氮成分的影响研究中也同样发现,加硒与未加硒组对比,蛋 白质含量显著增加、游离氨基酸减少,苏氨酸、缴氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、和苯丙氨酸的含量 明显提高,但进一步提高硒肥中的含硒量时,蛋白质的总量不会进一步增加 相比于胡文军、吴永尧、周志刚分别对金针菇,水稻,螺旋藻富集硒的影响研究胡文军, 吴永尧, 周志刚, ,目前对灵芝子实体这方面的研究非常有限 尚不明确培 养基硒浓度与灵芝中主要有效成分多搪、蛋白质 含量变化的相关性,因而也无法确定综合产 量、功效成分含量的最佳培养基硒浓度。 本部分实验的研究就是想通过考察硒对灵芝子实体产量、富集硒能力、多搪含量、蛋白质含 量、蛋白质构成、氨基酸分布、及特定氨基酸含量的影响,建立富硒灵芝栽培的最佳培育条件, 为生产实践提供可靠的指导依据并初步考察灵芝富硒的意义。第二章 灵芝富集硒对其产且及其主要营养成分的影响 中国农业大学博士学位论文材料与方法 仪器和试剂凯氏定氮仪日本 公司 双道原子荧光分光光度计北京海光 仪器公司 冷冻干燥机北京松源华兴科技发展有限公司 紫外阿见分光光 度计上海精密科学仪器有限公司 冷冻离心机上海安亭科学仪器厂 型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂型氨基酸分析仪德国公司 全谱直读 发射光谱仪美国 公司 亚硒酸钠、硫酸镁、氢氧化钠、 一疏基乙醇、澳酚蓝等均为国产分析纯, 来自 公司,葡萄搪标样购自 公司。 富硒灵芝子实体样品的来源及处理 供试菌种 由西北农林科技大学秦巴山区研究中心提供,菌种编号为南韩, 培养基 母种采用 培养基 原种培养基为 玉米粒 ,木屑 鼓皮 ,生石膏 ,食用 糖 栽培种培养基为 木屑 鼓皮 生石青 食用糖栽培方法 在普通灵芝栽培料中,按单因子试验设计,添加不同量的无机硒盐,通过灵芝菌在生长过程中 对无机硒的吸收、富集,然后转化为含有机态硒的生物富硒灵芝子实体。无机硒盐的添加水平,见 表 表 试验编号及水平表试验编号硒盐添加水平 栽培料 栽培料 试验重复数采用规格 的聚丙烯塑料袋栽培,每袋装风干料‘每个试验的 重复数如表 所示,采用高压灭菌、定量接种、随机堆放、定期翻堆,发菌期的温度控制为中国农业大学博士学位论文 第二章 灵芝富集硒对其产且及其主要营养成分的影响 厄里里里里旦旦旦巴巴里里里里里里 湿度 ,定期通风,保持 发菌室空气新鲜,进行避光培养 出芝期的温度控制为 ,人工喷水,保持环境湿度达到 当菌盖周边白色生长点消失,开始散发抱子 粉时采收。 灵芝样品及处理 采集自行栽培的含硒量分别为 和琳眺的富硒灵芝子实体以 及对照一普通灵芝子实体,用自来水洗净,双重蒸馏水冲淋,切片,冷冻千燥粉碎制成试验样品, 分别编号为 、 、 和 冷藏备用 硒的测定 氢化物原子荧光法 徐新春等, 多糖及多糖硒测定 灵芝样品 加 溶液?水浴中提取 抽滤,滤渣加 溶液 ,反复提取两次,合并滤液于淑娟等,。用 法除去蛋 白,再用 的乙醇沉淀多糖, 静置过夜, 冷冻离心 ,沉淀真空干燥,采用苯酚 硫酸法测定多糖含量张维杰,法测定多糖中硒的含量。 蛋白硒的提取与测定 灵芝样品 加 溶液,?水浴提取,抽滤,滤渣同法重提一次, 合并滤液,加入至 饱和度, 静置 冷冻离心 得蛋白质沉淀, 沉淀以 缓冲液溶解,同样缓冲液?下透析 后,所得蛋白质溶液真空冷冻干 燥测定其中硒含量杜琪珍等,总蛋白质的侧定 凯氏定氮法氨基酸分析 溶液,?水解氨基酸分析仪测定 矿质元素分析等离子偶合原子发射光谱法 〔徐新春等,电泳样品的制备 分别称取 普通灵芝子实体和富硒灵芝子实体试样,加入 的蒸馏水润湿,再加 样品缓冲液 甘油 基乙醇酚蓝 悬浮,沸水中保温 离心 上清液转入离心管,沉淀再依上法重提一次, 合并上清液, 离心 ,即为电泳样品中国农业大学博士学位论文 第二草 灵芝畜集硒对其产最及其主要营养成分的影响 电泳 胶板大小为,胶厚为 。分离胶 分离胶缓冲液 浓缩胶浓缩胶缓冲液, 每孔点样 ,在恒流 下进行电泳。电泳结束后在 考马斯亮 蓝 溶液中染色过夜,然后用脱色液 甲醇乙酸水二在摇床脱色至背景清晰。结果与讨论 硒对灵芝子实体产量和硒富集能力的影响 在培养基中分别添加。、、和眺的硒,人工栽培相应获得普通灵 芝子实体对照 、及富硒灵芝子实体 、和 ,通过称量干 重及分析其中硒的含量,结果发现 在培养基中硒的浓度低于眺时,富硒灵芝子实体的产量大体上随着培养基中硒的浓度 增加而增加,但当继续提高硒的添加量时,富硒灵芝子实体的产量急剧降低,降低的幅度远大于 培养基中硒的浓度由。提高到 时产量增加的幅度,而且当添加的 硒量达到即吮时, 富硒灵芝子实体的产量己降低到普通灵芝子实体的产量以下见 图,而且菌柄变长、菌盖己不 再是典型的肾形,说明灵芝菌种对环境中微量元素硒的变化敏感, 高硒会引起菌种中毒影响其正 常的生长发育。 ( 。 , 芭 } 召 怡 尝 留 益 留 ) , 卫 知 训 长引】 试样 图 硒对员芝子实体产 的影响盆‘一一一一一一 硒量的 倍 镁的含量显著降低钙、铁、锰、钡、铭和铬元素的含量极显著下降 ,可见灵芝在生物富硒过程中对矿质营养元素的影响没有呈现明显的规律,但证明灵 芝子实体能有效的吸收和富集硒,这一结论与王关林和牛丽颖在富硒灵芝菌丝体中的研究结果一 致王关林等, 牛丽颖等, 表 硒对灵芝矿物质组成的影响 矿质元素 富硒灵芝 普通灵芝 士 士 士士 士 结论 当培养基中硒的浓度为 时,每 培养料可获得 以上的干灵芝子实体,富硒 水平达到吮。 灵芝子实体生物富硒后可以显著提高其多糖的含量,硒促进了灵芝多糖的合成。而硒对蛋白 质的影响则有着双重的机制,即一定量的硒可以促进蛋白质的合成,但继续提高硒的添加量, 硒会抑制蛋白质的进一步合成和子实体蛋白质含量的提高,但硒并不改变灵芝中蛋白质的分 布。 灵芝蛋白和灵芝多糖中结合的硒量随着培养基中硒浓度的增加而增加,而且灵芝蛋白中硒含 量增加的速度快于灵芝多糖,硒与蛋白质结合的趋势强于与多糖的结合,硒更倾向于在蛋白 质中积累。 施硒能增加灵芝氨基酸的总量,而且除胧氨酸外,硒并不影响其它灵芝蛋白氨基酸的分布, 富硒灵芝氨基酸含量 与普通灵芝氨基酸含量 间遵从介联关系式。 富硒灵芝子实体与普通灵芝子实体相比,锌的含量显著增加、钠、铜、铝和硒的含量极显著 增加,其中富硒灵芝子实体含硒量是普通灵芝子实体的 倍,而钙、铁、锰、钡、银和铬 元素的含量极显著下降。 上述结果表明,灵芝子实体生物富硒后其主要营养功能成分全面明显的增加,从物质基础上 提高了灵芝本身的药理与保健价值。中国农业大学博士学位论文 第三章 硒在富硒灵芝中的分布 第三章 硒在富硒灵芝中的分布前言 硒在微生物体内的代谢 一、硒一硫竟争与取代 由于硒和硫属于同一主族,性质相似,它们的氧化数都是一和 。两者的键能、 电离能、化学性质的相似在生物学中有相应的表现。但硒的金属性要比硫活泼,所以在大多数的 情况下,硒在微生物或植物中的代谢基本上是着硫代谢的途径进行,即涉及相同的酶系。一般 认为 硒往往是取代含硫氨墓酸中的硫生成硒代氨基酸,然后再被结合于蛋白质中。但硒对硫的 取代只能是部分的,仅当硫也少量存在时,细胞才能利用硒,而且硒仅能取代正常硫需要量的 。在硒酸盐介质中微生物是线性增长而不是正常情况下的指数增长,而且增长效率也较 硫酸盐低徐辉碧等, 二、还原与氧化 微生物从环境中摄取的氧化数为 的硒在体内代谢中被还原的倾向远比被氧化大,有的细 菌能将亚硒酸盐还原为单质硒氧化数为 ,而另一些细菌还可进一步将单质硒还原为硒化物氧 化数为一 。有人认为这种还原过程可能是一种解毒机制,即将毒性的硒还原为不溶性的单质 硒 或挥发性的硒化物而排出体外。可以说,硒在生物体中的代谢过程应为一种代谢还原机理, 螺旋藻富硒培养中的红硒现象,在一定程度上证实了这种还原代谢途径。 与还原相比,有关微生物对硒的氧化研究要少得多 据报道,黑曲霉能 将亚硒酸盐氧化为硒酸盐。此外,也有将单质硒氧化为硒酸盐的研究报道〔徐辉碧等, 三、硒代氨基酸 某些微生物在利用生长介质中的硫酸盐合成蛋氨酸时,若介质中有硒存在,也能同时合成硒 代蛋氨酸,即蛋氨酸中的硫部分地被硒取代。若培养介质中有硒代蛋氨酸,它似乎能通过与蛋氨 酸相同的酶促反应结合入微生物的蛋白质中 。除硒代蛋氨酸外,硒代 半胧氨酸及硒的非氨基酸形式也存在于微生物蛋白质中细菌的蛋氮酸 裂解酶可催化 , 及 , 消去反应, 一及 置换反应,是一种多功能 酶催化剂,以下反应可了解硒原子进入硒代氨基酸的机制。比 。 丫消去 气中国农业大学博士学位论文 第三章 硒在富硒灵芝中的分布, 消去 日 , 一置换尹把蛋氨酸 裂解酶为催化剂的硒代氨基酸和含硫氨基酸的反应速度常数值比较所得,除个 别反应外,硒代氨基酸和含硫氨基酸几乎表现出相同的反应性,可以认为这样的酶反应,对硒的 毒性有重要作用 高浓度硒化合物,由于硫化合物代谢酶的代谢作角,蛋白质、核酸、多糖中的 硫原子无序地被硒原子置换,不能发挥正常的功能,含硫化合物的代谢被拮抗性地抑制而发生毒 性徐辉碧等,四、挥发性甲基化合物的形成 某些微生物能将无机硒化合物或硫化物转变为甲基化产物,但存在着物种上的差异。污水泥 浆和土圾中的微生物能将硒化合物转变为二甲基硒化物、二甲基二硒化物和二甲基硒代枫等挥发 性的甲基化产物 。有人认为,对于在高硒浓度下生存的微生物,甲基 化过程可能是其排毒的一个重要步骤,通过它可将有毒的硒排放到大气中。也有人认为,微生物 甲基化现象可能是硒在地质一生物循环中向大气迁移的途径之一。 硒代谢为甲基硒化物的机理包括交替进行的甲基化和还原,经和 修正后的机 理如下图。,或 奋一 还原 了 基 甲 二 妞往 硒 代 枫 ‘, 二二二刁‘ 和或 还原 或甲基亚硒酸甲脂二甲基二硒二甲基硒中国农业大学博士学位论文 第三章 硒在富硒灵芝中的分布 硒在富硒生物体中的赋存形态 大量实验证实,植物、微生物吸收硒后。在体内硒主要与蛋白质结合。如植物中 富硒茶里 与蛋白质结合的硒占到总硒的 以上蛋白硒分别占茶树根茎叶中总硒的和 杜琪珍等, ,而且随着施加的硒浓度的增加,半肤氨酸和蛋氨酸 在茶叶蛋白中的含量也相应增加富硒大豆中与蛋白质结合的硒占总硒的 以上〔 彭振坤等,,清蛋白的富硒量分别是大豆蛋白的 主要存在形式 球蛋白和 球蛋白的 和 倍 、且 球蛋白对硒的 亲和性大于 球蛋白富硒玉米中硒高度富集于白蛋白和球蛋白〔田继兵 等, 富硒麦芽中 的硒存在于蛋白质中《徐瑞兴等, 富硒水稻、富硒大蒜中硒都以 硒代蛋氨酸和硒代半肤氨酸两种形式与蛋白质结合吴永尧, 王 卫真等,,而且在施用 硒肥的土壤上生长的谷物中,硒代蛋氨酸是主要的含硒氨基酸 ,如富硒米 中的硒 以上为有机硒 以上的有机硒为硒代蛋氨酸浙容甫等, 在藻体中,硒含量的分布按下列顺序排列 蛋白质卜 类月争多糖 可溶性化合物 蛋白质结合的硒占藻体总硒的 藻体蛋白与藻蓝蛋白可结合硒有明显差异,分离纯化的藻 蓝蛋白有较高的含硒量黄峙等, 在微生物中,金针菇吸收无机硒后,转化成的有机硒在 以上,其中 分布在硒蛋白 中, 分布在硒多糖中胡文军等, 酵母、乳酸菌也能将无机硒有效转化成有机硒, 但在酵母中硒代耽氨酸是其含硒蛋白中基本的有机硒成分刘曼西等, ,而乳酸菌中硒则通过取代半耽氨酸中的硫生成硒代半肤氨酸非特异性地与蛋白质结合 。富硒蘑菇中 的硒以小分子量的有机硒及无机硒化合物存在,而 与脂、脂蛋白、核酸、蛋白质、几丁质和多糖结合的硒相对较少 硒 代胧氨酸和氧化数为 的硒是硒的主要存在形式。富硒灵芝子实体中有机 化程度的硒高达 以上,其中 的硒与蛋白质结合, 的硒与核酸 结合,的硒与多糖结合,而且硒的分布按结合硒量的大小依次为蛋白硒 核酸硒 多糖硒姚 敏, 目前关于硒以何种方式与灵芝蛋白结合,以及含硒蛋白的分子量分布情况在国内外尚无报 道,而且关于硒在灵芝子实体中的赋存形态的其他一些荃础数据也仅有姚敏的实验结果。因此, 本部分实验拟以较大规模培养的富硒灵芝子实体为样本,一方面验证己有的结论,另一方面更有 意义的则是进行新的探索,揭示该领域基础研究的奥秘。 内 材料与方法 气 么 , 孟 材料及处理 同 , 气 ‘ 仪器和试剂星 一一一一 双道原子荧光分光光度计北京海光仪器公司 冷冻干燥机北京松源 华兴科技发展有限公司冷冻离心机上海安亭科学仪器厂 型稳压稳 流电泳仪北京六一仪器厂 吸 高压液相色谱仪美国 公司 型台式酸度计美国奥立龙公司 硫酸钱、卜疏基乙醇、浪酚蓝等均为国产分 析纯, 为分子生物学纯度购自美国 公司, 来自 公司, 硒 代蛋氨酸标样和 衍生剂分别购自 公司和 公司。 实验方法 灵芝子实体中硒的有机化程度分析 采用持续透析法,将 灵芝子实体冻干样装入透析袋中,?超纯水中透 析 每隔 换一次水,测定透析后灵芝样中的硒含量为有机硒含量刘曼西等,核酸硒的提取与侧定 采用浓盐法提取 称取灵芝子实体样品,加 溶液,用?水浴提取 ,抽滤,滤渣同法重提一次,合并上清液, 法去蛋白后,用 调节 至 ?静置 冷冻离心 ,得沉淀,将沉淀用 乙醉淋洗 次,真空冷冻干 燥, 定硒含量 多糖硒的提取与侧定 同蛋白硒的提取与侧定 同 水溶性硒蛋白的制备及其硒含量的测定 在 灵芝子实体样中,