油茶乙酰CoA酰基转移酶基因cDNA克隆及序列特征分析

油茶乙酰CoA酰基转移酶基因cDNA克隆及序列特征分析 油茶乙酰CoA酰基转移酶基因cDNA克隆 及序列特征分析 第31卷第8期 2011年8月 中南林业科技大学 JournalofCentralSouthUniversityofForestry&Technology Vo1.31No.8 Aug.2011 油茶乙酰CoA酰基转移酶基因cDNA克隆 及序列特征分析 张琳,谭晓风,胡姣,姚小华,林萍 (i.中南林业科技大学经济林育种与栽培国家重点实验室,湖南长沙410004; 2.中国林业科学研究院亚热带林业研究所,浙江富阳311400) 摘要:在已知油茶乙酰COA酰基转移酶基因EST序列基础上,设计6条特异引物,以油茶优良无性系’湘林 1号’种仁总RNA为模板,通过反应体系和反应条件优化,最终扩增出一条700bp左右的目的片段,将该片段回 收,克隆,测序,获得718bp的cDNA序列,将该序列与油茶乙酰COA酰基转移酶基因进行序列拼接,确定了油茶 乙酰COA酰基转移酶基因的全长cDNA序列,将该序列提交至 GeneBank,登录号为GU594059.油茶乙酰COA 酰基转移酶基因全长cDNA序列为1495bp,含有一个1227bp的ORF, 编码408个氨基酸残基.在氨基酸序列 水平上,该基因与胡黄连(P.1eurrooa)的乙酰COA酰基转移酶基因的 相似性最高,为86,与稻瘟病菌(M grisea)的最低,为65%.通过在线预测,油茶乙酰COA酰基转移酶基因 编码蛋白的等电点pI为6.19,分子量 Mw为41628.6Da.本研究为揭示油茶油脂合成规律和油茶的分子育 种提供了理论依据和科学基础. 关键词:油茶;乙酰CoA酰基转移酶;快速扩增cDNA末端;生物信息 学分析 中图分类号:$794.4文献标志码:A文章编号:1673,923X(2011)08一 O1O8—05 CloningandsequencecharacterizationofcDNAencoding acetyl--CoAC--acetyltransferaseinCamelliaoleifera ZHANGLin,TANXiao-feng,HUJiao,YAOXiao-hua2,LINPin (1.TheKeyLabofNon-woodForestProductsofForestryMinistry,CentralSo uthUniversityofForestry Technology,Changsha410004,Hunan,China; 2.ResearchInstituteofSubtropicalForestry,CAF,Fuyang311400,Zhejinag, China) Abstract:Basedonsequenceinformationofacetyl—CoAC-acetyltransferas egene,sixpairsofprimersinconservedre— gionsofthisgeneweredesigned.TotalRNAofXianglinNo.1seedswasusedastemplate,onefragmentof718bp wassuccessfullyamplifiedby5’RACEstrategy.ThenthefullcDNAofacetyl—CoAC-acetyhransferasegenewas determinedbyassemblyingthe5’sequenceandknownESTsequencethathadbeenregisteredunderGenBank(No. GU594059).Theacetyl—CoAC-aeetyltransferasegeneofCamelliaoleiferawas1495bplong,including8comple— tedORFofl227bp.encoding408aminoacids.Ontheaminoacidsequencelevel,thisgeneshowedthehighest similarity(86)withacetyl—CoAeacetyltransferasegeneofP.kurrooa,andthelowest(65)withMgrisea. Inaddition.thepredictedpIandMwofCamelliaoleiferaacetyl—CoAC, acetyltransferasegenewas6.19,41628.6 Da,respectively. Keywords:Camelliaoleifera;aeetyl—CoAC—acety1transferasegene;rap idamplificationofcDNAends(RACE); bioinformaticsanalysis 收稿日期:Z011一O卜1O 基金项目:国家”十一五”油茶科技支撑计 2~j(2009BADB1B01,2009BADB11302);湖南省自然科学基金项目(1OJJ4O22);中南林业科技大 学青年基金项目(2009004A) 作者简介:张琳(1978一),男,河南渑池人,博士,副教授,主要从事经济 林栽培育种研究 第31卷中南林业科技大学109 油茶Camelliaoleifera是我国南方重要的木 本油料树种,也是世界四大木本油料树种之一.茶 油是优质的食用油,主要由油酸,亚油酸等不饱和 脂肪酸组成,其含量一般在90以上_1].但油茶产 油量低,种子中油脂的合成途径尚不清楚,因此克 隆油茶种子油脂合成过程中的相关基因,研究其功 能对通过分子生物学手段提高种子含油量具有重 要意义.本实验室于2003年以油茶优良无性系近 成熟种子为材料构建了国内外第一个油茶cDNA 文库嘲和EST文库[引,以研究油茶种子在油脂转化 高峰期的基因表达状况,已克隆了一些重要基因, 并对有关基因开展了比较深入的研究?4.在 EST文库中,笔者初步鉴定了油茶乙酰CoA酰基 转移酶基因的部分序列.该基因催化使2个分子 的乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA,催化蛋白质的 酰基化和去酰基化,而酰基化和去酰基化又是真核 生物蛋白质翻译后修饰中最普遍的方式,所以在某 种意义上讲,酰基转移酶又有调节蛋白质生物活 性,基因表达等多种功能.本研究拟通过RACE技 术克隆油茶乙酰CoA酰基转移酶基因的全长cD— NA序列,并通过生物信息学分析其序列特征,以预 测其在油脂合成中的功能,为揭示油茶油脂合成规 律和油茶的分子育种提供理论依据和科学基础. 1材料与方法 1.1实验材料 采用的油茶近成熟种子来自于株洲市马家河 乡中南林业科技大学重点实验室油茶种质资源库. 9月底至1O月初,采集油茶优良无性系’湘林1号’ 的近成熟油茶种子为实验材料,一70~C超低温冰箱 保存. 大肠杆菌DH5~(本实验室保存),pMD18一T质 粒载体购自TaKaRa公司.Invitrogen公司的To— talRNAPurificationSystem,Fermentas公司的反 转录试剂盒RevertAidTMFirstStrandcDNA SynthesisKit,Ambiogen公司的PuprepGelEx— tractionKit,Invitrogen公司的3’RACESystem forRapidAmplificationofcDNAEnds和5’RACE SystemforRapidAmplificationofcDNAEnds, 0.1‰DEPC,3H2O2,TAE缓冲液,无水乙醇, 75酒精,EB,超纯水,J3一巯基乙醇,100bpPlus DNALadder及其它常规实验药品;PCR仪,超低 温冰箱,冰柜,超净工作台,台式高速离心机,移液 器,水平电泳仪,空调,研钵,镊子,枪头等. 1.2研究方法 1.2.1油茶种子胚乳总RNA提取 油茶近成熟种子胚乳的总RNA提取参照In— vitrogen公司的TotalRNAPurificationSystem试 剂盒的方法进行.电泳检测总RNA提取结果,以 用于mRNA反转录及第一链cDNA的合成. 1.2.2油茶乙酰CoA酰基转移酶基因的5’RACE 采用Invitrogen的5’RACESystemRapid AmplificationofcDNAEnds试剂盒进行5’ RACE.根据已获得的油茶乙酰CoA酰基转移酶 基因的部分cDNA序列,设计扩增5,端完整序列的 的5’RACE引物,第一链cDNA的合成时需要设计 引物GSP1,此引物设计的位置离mRNA5’末端至 少3OObp.根据拼接的序列及比对的结果,使用软 件PrimerPremier5.0在序列上设计多条引物进行 筛选.5’RACE的5’端引物(AAP)和巢式PCR5’ 端引物(AUAP)为试剂盒自带引物.各引物序列 如下: GSP1:5’一ATTGCCAGCAGTGACAGA一3’ GSP2:5’一CAGTCTCCTTGA乙酰COA酰基 转移酶CGGTCGG-3’ GSP3:5’一GTTGACGGTTTTCCTCTTC— CTC(,+3’ GSP4:5’一TCTTCCTCCAGA乙酰CoA酰基 转移酶TCAACC3’ GSP5:5’一GCATAATCATCCTGCTCT— TCT(,_3’ GSP6:5’一TTGATGCCC乙酰COA酰基转移 酶GGATACTCT一3’ AUAP:5’一GGCCACGCGTCGACTAGTA(> 3’ AAP:5’一GGCCACGCGTCGACTAG— TACGGGIIGGGIIGGGII(,r3’ 5’RACE的PCR反应体系按说明进行. 1.2.3DNA测序 电泳检测5’RACE的PCR结果,回收目的条 带,连接并转化感受态大肠杆菌DH5a,挑取单菌落 做PCR检测,阳性结果送至南京金思特公司测序. 110张琳,等:油茶乙酰CoA酰基转移酶基因cDNA克隆及序列特征 分析箜璺塑 1.2.4油茶乙酰CoA酰基转移酶基因的生物信 息学分析 通过生物信息学软件VectorNTI10.0,Chro— mas2,QuantityOne,Genedoc,Anthepro5.0对油 茶乙酰CoA酰基转移酶基因的EST序列和测序结 果进行分析和预测,并在NCBI网站上对核苷酸序 列和氨基酸序列进行了对比分析,运用一些在线分 析软件对其氨基酸序列做分析并预测其蛋白质的 特性. 2结果与分析 2.1油茶种子高质量RNA提取 用DEPC处理过的双蒸水配制的TAE缓冲液 快速电泳检测所提取的RNA,如图1,RNA样品 电泳谱带清晰,三条带完整,带型较好,28S的亮度 是18S的2倍左右,并且5.8S亮度较弱,说明该样 品完整性良好,未发生明显的降解,参照奥斯伯等 方法计算出OD2../OD2..=:=2.109,该值大于2.0,说 明样品受离子和小分子干扰较少,多糖的去除较为 干净,OD26o/OD280一1.918,该值在1.8,2.0之间, 说明没有蛋白质或酚类污染,产量为61.2/,g/g,得 率较大,多方面分析得之所提取的油茶种子总 RNA质量较高,非常适合进行后续的5’RACE 实验. 图1总RNA电泳图 Fig.1Electrophoresisoft0talRNA 2.2油茶乙酰CoA酰基转移酶基因5’端cDNA 序列扩增 本实验中,在逆转录获得单链cDNA过程中使 用了引物GSP1,随后经过多次反复PCR条件摸 索,获得一条大小为700bp左右的条带(图2),且 非常特异,根据引物所在位置大小推断,该条带应 该是目的条带,对其回收克隆至pMD18一T中,进行 菌液培养.随机挑取5个阳性克隆的菌液,使用通 用引物M13—47/Rv—M进行检测,所得PCR产物大 小为800bp左右,除去通用引物自身100bp大小, 与5’RACE产物的700bp大小吻合,故确认5’ RACE产物已经成功连接到pMD18一T载体上,并 且筛选到了阳性克隆,可以进行测序. 图25’RACE电泳图 Fig.2Electrophoresisfigureof5’RACEproduct 2.3.3油茶乙酰CoA酰基转移酶基因全长cDNA 的克隆 对油茶种子所提取总RNA进行逆转录,以逆 转录产物为模板,使用乙酰COA酰基转移酶F和 乙酰CoA酰基转移酶R作引物进行扩增,获得大 小约为1300bp左右的片段(图3),该大小与得到 的片段大小与理论上5’RACE,EST序列拼接后大 小接近,推测为油茶乙酰COA酰基转移酶基因的 全长序列,TA克隆后通过阳性检测,测序获得长度 为1227bp的序列,包含全部序列,编码408个氨 基酸. I500bp 图3全长CDNAPCR电泳检测 Fig.3ResultofamplifiedCDS 1300bp 箜鲞中南林业科技大学111 2.3.4油茶乙酰CoA酰基转移酶基因的序列特 征分析 2.3.4.1核苷酸序列分析 本研究通过一系列实验,得到了油茶乙酰COA 酰基转移酶全长eDNA.通过生物软件Vector NTI10.0分析得出,此eDNA长1495bp,包括5’ 非编码区65bp和3E编码区203bp,以及一个长1 227bp的编码区,起始密码子为ATG,终止密码子 为TAA,编码408个氨基酸残基.在3’非编码区, 距离终止密码子TAA下游182bp处有一个长21 bp的polyA尾巴,所以此eDNA序列为乙酰COA 酰基转移酶基因的全长cDNA.通过在线transla— tedblast,结果显示此序列编码408个氨基酸,与软 件分析的结果一致. 将油茶的乙酰CoA酰基转移酶全长eDNA序 列在NCBI网站上进行blastn,结果见表1,其中分 值和相似性越高,表示目的片断与此基因的同源性 越高;而期望值越低,也表示目的片断与此基因的 相似性越高.从表中可以看出,油茶的乙酰CoA 酰基转移酶基因全长eDNA与橡胶的乙酰COA酰 基转移酶基因相似性最高,相似性达到了86. 表1油茶乙酰COA酰基转移酶全长eDNA序列的blastn结果 Table1BlastnResultoffull-lengtheDNAofacetyl—CoAC-aeet3ltransferas egenefromCamelliaoleifera 2.3.4.2蛋白质序列分析 油茶乙酰COA酰基转移酶基因ORF编码408 个氨基酸,蛋白分子量为41628.6Da,等电点为 6.19,其中负电荷氨基酸残基数目(Asp+Glu)为 37,正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)的数目为24;分 子式为C1R27H2963N5ogOI66S16;280nm光吸收值为 0.560;该蛋白若在大肠杆菌中,其半衰期大于10 h;不稳定系数为25.73,属于稳定蛋白质.其疏水 指数从一2.489到3.000.其中大约在140位,180 位以及380位氨基酸表现出亲水性,整个蛋白质基 本上表现出疏水性.该蛋白有两个比较明显的由 内向外的跨膜区:一个是18--44位氨基酸,另一个 是388—408位氨基酸;而位于83—106位氨基酸 则是由外向内的跨膜区.该蛋白是一个非分泌性 蛋白,油茶乙酰CoA酰基转移酶基因蛋白中存在 信号肽的几率极小,仅有O.103.乙酰CoA酰基转 移酶蛋白分为两个结构域,15—278位为氨基酸是 硫解酶N端结构域,期望值为4.00e一131;279— 408位为氨基酸是硫解酶C端结构域,期望值为 3.70e,61 3结论与讨论 本实验室前期成功构建了油茶近成熟种子的 eDNA文库,从eDNA文库中随机抽取2327条克 隆进行3’端单向测序,获得了1979条大于200bp 的序列.从这些序列中,作者通过序列分析,初步 确定了一条油茶乙酰COA酰基转移酶基因,通过 T3,T7引物扩增,将获得的产物进行测序,获得了 1414bp的eDNA序列,blastp分析表明,该eDNA 与其它物种的同种蛋白质的相比5’端缺失了约14 个氨基酸残基,其3’端是完整的.为获得5’端完 整序列,因而开展了本研究的5’RACE.由于真核 基因的特征,获得某一基因的5’端序列难度较大, 本研究中,作者设计了6条正向引物,并分别与试 剂盒自带的反向引物进行配对,最终成功获得了油 茶乙酰CoA酰基转移酶基因的5’端序列和全长 eDNA序列.并进一步通过生物信息学方法分别 从核苷酸和蛋白质序列水平上,分析了该基因的特 征,为预测该基因在油茶油脂合成过程中的功能提 供了指导,也为揭示油茶油脂合成规律和油茶的分 子育种提供了理论依据和科学基础. 112张琳,等:油茶乙酰CoA酰基转移酶基因cDNA克隆及序列特征分析箜塑 参考文献: 陈永忠,肖志红,彭邵锋,等.油茶果实生长特性和油脂含量 变化的研究FJ].林业科学研究,2006,19(1):9—14. 胡芳名,谭晓风,石明旺,等.油茶种子cDNA文库构建_J]. 中南林学院报,2004,24(5):1—4. 谭晓风,胡芳名,谢禄山,等.油茶种子EST文库构建及主 要表达基因的分析[J].林业科学,2006,42(1):43—48. 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