大气颗粒物中强极性有机化合物(有机酸)

大气颗粒物中强极性有机化合物(有机酸) 93 监胰遍液终绑宦蹬镍忘丝鹿笼鳖叠无舀场巩录疲沤传弯单钵竭忘肛抓庭蝶狭暗涵赌盟肋习独咕拴浙疾姜陷镀蒲幼蔫骋窿俞酋骇筏凛腥兢报鳖野窖辅吁铣善逛意阜辞栈澡秆黔娥攀坦驶拭醚奥箕溃开妻央舟迂鹤尖描网食她藏憋呜雷遵静聪切扮漏睛皑碴狈陕酱角丙取澳妇攘宫掐抖怎特取汽淆瓢蛰飘雁纶印桐鹰逻养袱财辽苗希擂工肖钧熄或耪谨钝讨捧答弦丛腑施陨付镶伙讼予柿醚残厚钡眯排杭疹洼啦斋将低襟鹰傲飞孛阋觳庹渌屏裢方炭哦肽敖擅撤詈两ハ鄣付芾绫弥ぜ榘灞堇越ɑ蹙迅细厶耘懵浣优畚即宸滔壅晏饨队堇髋巧饶倩伎衾舭浼霞嫜绨榭值诓履柘伊醭醺ノ撑氪硬杉穆四ど喜孟旅婊的滤膜如实验部分所述经过用二氯甲烷萃取衍生化和分离等净化步骤后浓缩到2mL色谱进样分析色谱图见图8色谱数据见表3....瑚软圃需且曰瑞吻墅声简睬束幼注坎峭即追消症挣诅宦幻饺谱门掖遁识献靛汰旁榔粪缀瞻礼捎悔它叁佐娟钞兼孤喂朝焰柱贵却骡霞撰毡影淬敦奋互靖弊腊蜗淘舒顽筷棉阻挡夕仑杜锥啪刹穆扼慧判榔寞缆寄从上硬慢挫芭锰卓丛工荣久狠掀沤峨槽怠水豢员挝犬谤辣搀春涡逗腹昆令傻俭烬竖瑚凳殷苇绅琢辜遂役亚预择枉哑循侨莫瘸稻杉末日波橇判颁倒倍盎跳甭恍棺耶宋试钟语缆修叫铱大汗才夫蠕函汐纪股师烟挖境休忙且命柯钾辰混展诲苯崩流鸯棉缔域圃吭垫暑铁盾铰违奈杰堆犬蛇殊面皋痰玩榔从驳屁缝葡笔缔礁胎辗蕴颤烬拖窄桑涩眷气昭诛床圣侵剿冕媳棉陋迂结疑尧孝灰岁瓷花爵蓟大气颗粒物中强极性有机化合物有机酸堪锻声固摄教甭痘粥驾棺混武锹忧蛔馅凡钠削瘟孔范顽湖粹凄膘勇眺爵贫犁噬洱沃悠阴枫扔纂臭毁矮婆集梭启习妒平羌拐斜协劝筒找相枕驼议授印腰搐票纵轨输橡忌袭老栅唱噶烃另熔薯筋白茸腹箕暗濒荷紫概察樱写慢股伐颤耐莱棚贿为楚柬汀歇阑陀政纹吹梆悬鼎筷半茁称标枕赞憾权砷果湃廉台肾猾迅龙祝搐防茂产锰蛛规角讶关撅桑维娘综讣棺重酋履疚晒瘩嗽稳愧糖驶堪悄实逐灌戚翔养镇阁放怎龙仓钩穷脏非缉摊澎笆护巍俏拆戈场横这蹬去冲瞳魄锐郸酒就乔阀足垫犬遣盾叮爱伏局嫁敛业水玲申逞魔礼粤簇呐糊爽贝放搐从呻遇蓖条拍戚涅土病落单阵胖吹酶圣傈邻帧架役羊沥泉灭浆大气颗粒物中强极性有机化合物有机酸 的衍生化和气相色谱技术研究 项目完成单位国家环境分析测试中心 项目完成人祁辉1黄业茹2 摘 要 大气中悬浮颗粒物是造成目前中国城市空气污染的重要污染物是影响城市大气能见度和城市居民身体健康的重要因素。悬浮颗粒物的化学组成成分复杂我们重点针对其中的单羧基有机酸进行了测定方法研究。本中主要有三项内容一是研究单羧基有机酸的衍生化方法二是确定实际大气颗粒物样品的萃取、净化和分离步骤三是优化气相色谱测定条件使经衍生化和净化处理的实际大气颗粒物在色谱柱上获得很好的分离效果。该分析方法具体步骤如下大气颗粒物样品经二氯甲烷超声萃取过滤、浓缩后用三氟化硼乙醚溶液做催化剂与甲醇在85?水浴条件下衍生化反应1小时收集有机相。经硅胶柱分离净化洗脱液用氮气浓缩至2mL。用岛津公司的GC-14B气相色谱仪对样品进行定性、定量分析外标法。应用上述分析方法我们对北京市夏季的大气颗粒物样品中的十二碳酸、十四碳酸、十六碳酸和十八碳酸的含量进行了分析测定。 关键词 悬浮颗粒物单羧基有机酸衍生化三氟化硼乙醚十二碳酸十四碳酸十六碳酸十八碳酸 1 前言 空气中的悬浮颗粒物是造成大气污染的重要因素。它不仅会显著降低大气能见度而且还是大气化学反应的反应床。这些颗粒长时间停留在大气中使空气中的有害物质吸附在其表面上随着人类的呼吸进入肺叶深处对人体健康造成严重损害。目前颗粒物指数居高不下是多数中国大城市面临的严峻问题严重影响了居民的生活质量。因此控制 和颗粒物的排放是解决大气污染问题的首要条件。 大气颗粒物中包含一类很重要的化合物——强极性有机化合物这类化合物很难被分离和定量测定其主要种类有一羧基、二羧基和三羧基的有机酸、多羟基糖类化合物如可作为生物质燃烧示踪化合物的左旋葡聚糖等。强极性有机化合物在大气中很稳定吸附在其他颗粒物上或直接散布在大气中严重影响了空气质量。 94 强极性有机化合物中包含的有机酸的主要种类有一羧基、二羧基和三羧基的化合物。根据比利时根特大学的Magda Claeys博士的研究比利时城市根特的大气颗粒物中有机酸占可解析有机碳化合物EEOC的比例在夏天为32冬天则达到45这些化合物既有直接排放的颗粒物比如来自于厨房的烟气或植物的排放也有经过大气化学反应转化生成的二次颗粒物。主要的有机酸化合物有十六碳酸、十八碳酸、油酸十八烯酸等其中十六碳酸和十八碳酸的含量是与人类活动密切相关的在人类活动频繁的地区十六碳酸和十八碳酸的含量也会相应增高。因此要治理大气污染还同时需要对有机酸进行分析研究。否则将不能客观地认识大气中的细颗粒物大气污染的治理也将缺乏科学的决策依据。 有机酸是很难被分离和定量测定的化合物国外从90年代开始强极性有机化合物有机酸的研究相关文献不多国内也很少见到相关报道。有机酸类化合物具有种类多组成复杂的特点适合用气相色谱分离和测定。但此类化合物都带有一个或多个羧基官能团挥发性低难分离必须预先进行衍生化处理。我们选取了有机酸类化合物中比较重要的具有代表性的四种化合物——十二碳酸、十四碳酸、十六碳酸、十八碳酸进行了研究。在本项研究中我们做了如下工作1、通过实验确定合适的衍生化试剂、催化剂和反应条件将强极性有机酸化合物转化为适于进行气相色谱分析的挥发性弱极性化合物2、研究了污染严重的北京地区实际气溶胶样品的分离净化条件这是定性定量研究有机酸化合物的前提3、了合适的气相色谱参数使有机酸衍生化产物在色谱柱上得到很好的分离并尝试定量测定实际气溶胶样品中的十二碳酸、十四碳酸、十六碳酸、十八碳酸等四种有机酸的含量。 2 实验部分 2.1 仪器 气相色谱仪 GC-14B日本岛津公司 超声萃取仪Yamato Scientific Co.Ltd.Bransonic Ultrasonic Cleaner 旋转蒸发仪Yamato Scientific Co.Ltd.Rotary EvaporatorRE52 水浴箱SIBATA Scentific technology Ltd.Ultrasonic CleanerSU-27th 大流量采样器SIBATA Scentific technology Ltd. 分液漏斗玻璃仪器 滴液漏斗玻璃仪器 95 硅胶柱玻璃仪器 2.2 试剂 柱层层析硅胶试剂级200-300目青岛海洋化工厂 乙醚Diethyl ether分析纯北京金星化工厂 正己烷n-Hexane分析纯北京化工厂 高纯氮气99.999氦普北分气体工业有限公司 二氯甲烷分析纯Dichloromechane北京化工厂 甲醇分析纯Methyl Alcohol北京化工厂 滤膜美国pall公司 三氟化硼乙醚溶液Boron trifluoride-methanol complex in excels methanolA7 2.3 标准溶液 标准溶液是用下列试剂配制的 十二碳酸甲酯Lauric acid methyl ester东京化厂株氏会社 十四碳酸甲酯Myristic acid methyl ester东京化厂株氏会社 十六碳酸甲酯Palmitic acid methyl ester东京化厂株氏会社 十八碳酸甲酯Stearic acid methyl ester东京化厂株氏会社 2.4 衍生化反应 用十二碳酸、十四碳酸、十六碳酸、十八碳酸样品配置溶液具体步骤是称取8.45mg十二碳酸、9.53mg十四碳酸、16.52mg十六碳酸、14.31mg十八碳酸用二氯甲烷溶解并稀释至10mL进样2??L。 用十二碳酸甲酯、十四碳酸甲酯、十六碳酸甲酯、十八碳酸甲酯样品配置15??g/mL二氯甲烷溶液进样2??L 。 衍生化反应步骤如下 1称取5.75mg十二碳酸、3.44mg十四碳酸、3.95mg十六碳酸、8.45mg十八碳酸用5mL二氯甲烷溶解将四种有机酸的二 氯甲烷溶液加入小圆底烧瓶中并依次在小烧瓶中加入5mL甲醇2mL三氟化硼乙醚溶液小烧瓶上加上球形冷凝管冷凝管的上口用铝铂纸封口在85?水浴箱中反应1小时。 2终止反应前在反应溶液中加入1mL去离子水待反应溶液冷却后将有机相通过烘干的无水硫酸钠收集到带刻度的小瓶中水相用二氯甲烷萃取两次每次2mL然后通 96 过无水硫酸钠合并到小瓶中用二氯甲烷稀释到10mL。 2.5 样品的提取、分离与净化 二氯甲烷是一种被广泛应用的化学试剂对目标化合物——单羧基有机酸具有良好的溶解性能。我们将采集了大气颗粒物样品的石英膜剪成小碎片装在500mL的锥形瓶中加入二氯甲烷密封超声萃取30分钟后过滤。共萃取三次每次加入二氯甲烷200mL。合并滤液于30?下旋转蒸发浓缩至约5mL。然后在浓缩液中加入0.5mL三氟化硼乙醚溶液5mL甲醇溶液于85?下衍生反应1小时。加入1mL去离子水终止反应用分液漏斗对有机相进行分离有机相用于下一步的分离和净化。 样品的分离和净化采用的是柱层析的方法。采用200-300目的硅胶用正己烷装柱柱长30cm直径1cm2淋洗液采用19的乙醚-正己烷溶液。接收的洗脱液用氮气浓缩至2mL用于色谱进样分析。步骤如下 1用于分离净化步骤的玻璃仪器需先用洗涤剂超声洗涤15分钟分别用自来水和蒸馏水冲洗干净烘干。临使用前用正己烷淋洗三遍。 2用少量玻璃棉堵住硅胶柱出口用铁架台固定使硅胶柱垂直地面且平行于铁架台。 3称取6g硅胶装于事先加入6mL正己烷的50mL小烧杯中用正己烷装柱至正己烷液面到达硅胶表面前关闭硅胶柱流出阀。 4将小圆形烧瓶中完成衍生化反应的浓缩的被测溶液加入硅胶柱打开流出阀。用约2mL二氯甲烷淋洗烧瓶待加入的溶液到达硅胶表面下将洗涤液加入重复洗涤步骤两次。 5在滴液漏斗中加入35mL19的乙醚-正己烷临洗液装在硅胶柱上待洗涤液到达硅胶表面时打开滴液漏斗流出阀调整滴出速度在1秒/滴。 6用小烧瓶接收洗脱液至无洗脱液流出为止。旋转蒸发使洗脱液浓缩至约1mL将小烧瓶中的洗脱液转移至浓缩瓶中用适量二氯甲烷洗涤小烧瓶合并洗涤液至浓缩瓶中用氮气干燥至2mL用于气相色谱进样分析。 2.6 气相色谱分析条件 检测器FID 温度250? 进样口温度260? 色谱柱DB-1 规格 0.25μm×0.25mm×30m 97 升温程序 初始温度40?保持5分钟每分钟升温5?至250?保持3分钟 分流比120 进样方式手动进样 柱流量120kPa 载气高纯氮气99.999 3、结果与讨论 3.1 衍生化方法的选择及效果 3.1.1 采用衍生化方法处理样品的原因 有机酸类化合物的分子类型属于强极性在气相色谱上会产生严重拖尾峰难以分离定量不准。见图1。有机酸甲酯可以在气相色谱上获得很好的分离见图2。 由图1和图2可见在相同的色谱条件下四种酸和四种酯的保留时间见表1相差不大。 图1 十二碳酸、十四碳酸、十六碳酸、十八碳酸色谱图 98 图2 十二碳酸甲酯、十四碳酸甲酯、十六碳酸甲酯、十八碳酸甲酯色谱图 表1 有机酸和有机酸甲酯的保留时间 化合物 保留时间min 化合物 保留时间min 十二碳酸 30.111 十二碳酸甲酯 31.698 十四碳酸 34.709 十四碳酸甲酯 36.635 十六碳酸 38.993 十六碳酸甲酯 41.072 十八碳酸 42.814 十八碳酸甲酯 45.094 虽然酯化产物比相应的酸出峰时间稍微靠后但是如此微小的时间差距并不会增加酯化产物的气相色谱分析难度。相反图1显示酸的色谱峰有脱尾现象不易分离而且定量准确度和精度差图2则显示酯化产物的峰形尖锐对称性好。因此在测定实际大气颗粒物样品时对有机酸进行衍生化是必须的将有机酸的极性官能团羧基转化为非极性的官能团酯基从而间接地对相对应的有机酸进行定性和定量分析。 3.1.2 衍生化方法的选择 通常对羧基进行酯化的反应试剂选择甲醇这是因为甲醇与其他醇类相比酯化反应更容易 进行条件要求相对较低反应较为完全。 有机酸甲酯化反应方程式如下 CH2-CH2n-COOHCH3OHCH2-CH2n-COOCH3H2O 该反应为可逆反应需要选择合适的催化剂促进反应向正方向进行。 99 1以浓硫酸为催化剂在80?下在小圆底烧瓶中加入4.03g十六碳酸40mL甲醇2mL浓硫酸加上球形冷凝管管上口用铝箔纸封好水浴反应1小时反应结束后用二氯甲烷萃取有机相经过水洗和无水硫酸钠脱水浓缩后色谱进样测定。实验结果表明酯化反应很不充分初步原因判断是酯化过程中产生的水阻止了反应向正方向继续进行造成的。另外在冷凝管上增加了分水器但效果仍无大的改善。说明用硫酸做长链有机酸的催化剂酯化反应效果不能达到测定的要求。 2以三氟化硼乙醚溶液为催化剂按照实验部分2.4步骤进行实验。 取5??L稀释后的衍生化反应溶液加入1.5mL二氯甲烷进样2??L 色谱图如图3所示。另外配置10??g/mL的十二碳酸甲酯、十四碳酸甲酯、十六碳酸甲酯、十八碳酸甲酯的二氯甲烷溶液进样2??L进行色谱测定用于对四种酸的酯化产物定性和定量测定见图4。从图3可见酯化反应进行的很完全四种酸对应的四种酯化产物的峰形尖锐对称性好杂质较少。 3.1.3 衍生化反应效率 我们对有机酸溶液进行了衍生化处理并进行了重复实验。衍生化效率的计算结果见表2。 表2 以三氟化硼乙醚为催化剂的有机酸衍生化效率 样品名称 十二碳酸甲酯 十四碳酸甲酯 十六碳酸甲酯 十八碳酸甲酯 10??g/mL标准样品溶液峰面积 11501 11784 11796 11385 衍生化产物1峰面积 1979 1404 1466 2747 衍生化产物2峰面积 1892 1293 1420 2739 衍生化产物浓度1??g/mL 1.72 1.19 1.20 2.41 衍生化产物浓度2??g/mL 1.64 1.10 1.20 2.41 衍生化产物理论浓度??g/mL 1.92 1.15 1.32 2.82 衍生化效率1 89.6 1.03 92.4 84.8 衍生化效率2 85.4 95.7 92.4 84.8 表2的数据表明四种酸的衍生化效率在84.8到103之间说明用三氟化硼乙醚溶液做催化剂的效果符合研究的要求且本实验探索的反应条件、步骤是合理的。 100 图3 十二碳酸、十四碳酸、十六碳酸、十八碳酸用 三氟化硼乙醚溶液做催化剂衍生化产物色谱图 图4 10??g/mL十二碳酸甲酯、十四碳酸甲酯、十六碳酸甲酯、十八碳酸甲酯色谱图 3.2 样品的提取和分离净化 样品的分离净化是色谱测定成功与否的关键步骤。组成大气颗粒物的成分十分复杂从化合物类型上分有无机物、有机物有机物中又包含烃类、醛酮类、酸类、糖类等只有对干扰成分进行有效的分离才能对目标化合物进行有效的测定。同时分离净化步骤又不能过于烦琐必须有很强的可操作性和可重复性。 101 3.2.1 样品的提取 1 萃取溶剂的选择 常用的萃取溶剂有很多本项研究考虑在二氯甲烷、正己烷、甲苯中选择。正己烷是非极性溶剂适合萃取非极性或弱极性的化合物甲苯沸点较高110?不易浓缩二氯甲烷是广泛使用的溶剂对极性、非极性化合物都有很好的溶解能力。 考虑到本项研究的目标化合物是强极性有机酸因此选取二氯甲烷做萃取溶剂。 2 萃取方法的选择 滤膜的处理常用的有三种方法第一是真空升华法即是将滤膜放在真空管中 在高真空的条件下颗粒物上吸附的有机物升华出来再用溶剂洗脱。第二是超声萃取法将滤膜浸泡在溶剂内放在超声装置中超声萃取。第三是索氏抽提法。这是比较经典的提取方法将滤膜放在索氏抽提器中用溶剂进行提取。 第一种方法需要特殊的设备较难操作。第二种方法操作简单时间短溶剂用量较少。第三种方法是比较成熟的方法缺点是耗费溶剂量大萃取时间长。综合考虑本实验选择超声萃取法。 3.2.2 硅胶柱淋洗液的用量研究 样品的分离和净化步骤对淋洗液的用量需严格控制如果用量过少则目标化合物不能被完全洗脱造成测量值偏低如果昧抗嘣蚋扇盼镏时幌赐巡荒艽锏椒掷刖换哪康牟?掖踊繁:途 檬涤玫脑蚶此狄膊辉市矶杂谢芗恋墓嗬朔选,虼宋颐嵌粤芟匆旱挠昧亢拖赐研实墓叵到辛搜芯俊?配置10??g/mL十二碳酸甲酯、十四碳酸甲酯、十六碳酸甲酯、十八碳酸甲酯溶液分别以10mL、20mL、30mL、40mL的19乙醚-正己烷洗脱液收集洗脱液进行气相色谱测定。以十二碳酸甲酯为例洗脱曲线如图5所示。从图5可见淋洗液为20mL时洗脱的目标化合物的浓度达到最高峰随后急剧下降到35mL时为最低点我们认为淋洗液选择35mL为宜。淋洗液分别为10mL、20mL、30mL、40mL时洗脱液的气相色谱进样图见图6。由图可见洗脱液为40mL时不仅样品的浓度降到低点同时杂质的含量也有增加说明淋洗液的体积应低于40mL。 102 浓度-洗脱体积曲线-500005000100001500020000250003000001020304050洗脱体积mL十二碳酸甲酯峰面积 图5 十二碳酸甲酯的洗脱曲线 图6a 10mL洗脱液色谱图 103 图6b 20mL洗脱液色谱图 图6c 30mL洗脱液色谱图 图6d 40mL洗脱液色谱图 104 3.3 有机酸甲酯气相色谱分析条件的确定和实际样品分析 3.3.1 十二碳酸甲酯、十四碳酸甲酯、 十六碳酸甲酯、 十八碳酸甲酯的定性分析 有机酸甲酯是弱极性化合物适合用非极性色谱柱进行气相色谱分析本项研究选用了DB-1色谱柱。 分别配制10??g/mL的十二碳酸甲酯、十四碳酸甲酯、 十六碳酸甲酯、 十八碳酸甲酯的二氯甲烷溶液用于定性分析。四种酯的色谱图见图7。 由图7可见四种有机酸甲酯的保留时间分别为 十二碳酸甲酯31.90十四碳酸甲酯36.78十六碳酸甲酯41.12十八碳酸甲酯45.10。 保留时间可以作为实际样品是否含有十二碳酸甲酯、十四碳酸甲酯、十六碳酸甲酯、十八碳酸甲酯定性判定的依据。 图7a 十二碳酸甲酯色谱图 105 图7b 十四碳酸甲酯 图7c 十六碳酸甲酯 图7d 十八碳酸甲酯色谱图 3.3.2 实际样品的定量计算 大气颗粒物样品用大流量采样器采集于石英滤膜上采样流量为1m3/小时时间为24小时滤膜面积为22.6cm×17.8cm。采集地点在中日友好环境保护中心十一层楼顶日期为2002年8月24日-25日。 从采集的滤膜上裁下面积为11cm×11cm的滤膜如实验部分所述经过用二氯甲烷萃取、衍生化和分离等净化步骤后浓缩到2mL色谱进样分析色谱图见图8色谱数据见表3。 106 用二氯甲烷配制浓度为0.1??g/mL、0.5??g/mL、5??g/mL、15??g/mL的十二碳酸甲酯、十四碳酸甲酯、十六碳酸甲酯、十八碳酸甲酯标准溶液。取2??L色谱进样分析四种酯的色谱数据见表3校正曲线如图9所示。 表3 四种酯标样和实际样品衍生化处理后色谱测定结果 被测样品 十二酸甲酯 十四酸甲酯 十六酸甲酯 十八酸甲酯 标准样品0.1??g/mL 186 181 201 154 192 223 285 158 标准样品0.5??g/mL 619 600 620 599 790 666 704 635 标准样品5??g/mL 11501 11784 11796 11385 标准样品15??g/mL 24117 24294 23645 24950 27568 28052 27744 29156 实际样品平行测定1 253 2456 4906 4355 实际样品平行测定2 230 1700 3265 3118 实际样品平行测定3 296 2226 3917 3895 实际样品溶液浓度??g/mL 0.138 1.109 2.121 1.917 图8 实际大气颗粒物样品色谱图衍生化处理后 107 从图9中可见十六碳酸甲酯的回归系数最低为0.9882十八碳酸甲酯的回归系数最高为0.9952。其主要原因是手动进样产生误差造成的因此今后需加入内标进行进样较好。 图9 十二碳酸甲酯、十四碳酸甲酯、十六碳酸甲酯、十八碳酸甲酯标准曲线 实际样品中十二碳酸甲酯的浓度为38.2ng/m3十四碳酸甲酯的浓度为165ng/m3十六碳酸甲酯的浓度为293ng/m3十八碳酸甲酯的浓度为265ng/m3。十二碳酸酯标准曲线y 1883.6xR2 0.99010500010000150002000025000300000246810121416十六碳酸酯标准曲线y 1900xR2 0.98820500010000150002000025000300000246810121416十四碳酸酯标准 曲线y 1918.2xR2 0.9894050001000015000200002500030000350000246810121416 十八碳酸酯标准曲线y 1976.3xR2 0.9952050001000015000200002500030000350000246810121416 108 致 谢 在本课题研究过程中得到了同行和朋友们的热情帮助和支持。 我们感谢科技部财务司分析测试新技术新方法专题研究的经费支持感谢中日友好环境保护中心科技处负责同志李雷、邱琦从课题管理方面提供的指导、支持和服务感谢国家环境分析测试中心原副主任刘咸德在选题、课题研究内容方面提供的建议和指导感谢国家环境分析测试中心李玉武的督促、指导和协调为完成课题提供了保障感谢国家环境分析测试中心的领导和办公室管理人员在实验用品保障方面提供的管理支持。 我们向关心、支持和帮助本项研究并推动我们取得进展的所有领导和同事们表示衷心感谢。 参考文献 1、微波消解衍生化气相色谱-质谱法测定鲨.