浅论缅甸蝰蛇毒纤溶酶fⅱaa的分离及生物活性

浅论缅甸蝰蛇毒纤溶酶fⅱaa的分离及生物活性 浅论缅甸蝰蛇毒纤溶酶F?aa的分离及生物活性 浅论缅甸蝰蛇毒纤溶酶F?aa的分离及生物活性 作者:陈慧珍， 梁秀霞， 邱鹏新， 陈家树【摘要】 【目的】 从 缅甸蝰蛇毒中分离纯化得到纤溶酶F?aa并研究其纤维蛋白溶解活 性。【方法】 缅甸蝰蛇蛇毒纤溶酶F?aa经过离子交换层析和凝胶层 析分离程序得到，SDS-PAGE电泳测得其分子质量，用纤维蛋白平板 法测得其纤维蛋白溶解活性，SDS-PAGE电泳测得其纤维蛋白原和纤 维蛋白水解特异性。通过小鼠背部皮下注射F?aa 测定F?aa的局 部出血活性。取昆明种小白鼠42只，体质量(20 ? 2)g，雌雄各半， 随机分成7组，每组6只，皮下注射0.1 mL的F?aa(5个剂量组: 用生理盐水配制成浓度分别为0.025、0.05、0.075、0.1、0.5 mg/mL)， 生理盐水和粗毒(0.1 mg/mL)做对照。6 h后处死小白鼠，从皮内侧 面测量出血点的大小，计算最小出血剂量(MHD)。【结果】 通过三步 分离方法得到蛇毒纤溶酶F?aa，其分子质量是69 000 u。F?aa在 纤维蛋白平板和加热纤维蛋白平板上均显示了纤维蛋白溶解活性。纤 维蛋白原和F?aa (0.2 g/L)保温后，Aα 和Bβ链分别在5 min和 6 h后完全水解。γ-链在24 h后部分水解。F?aa水解纤维蛋白的 过程与纤维蛋白原的水解过程相似。蛇毒纤溶酶F?aa(0.025、0.05、 0.075、0.1、0.5 mg/mL)的皮内出血点直径(mm)分别为7.7 ? 1.0、 9.9 ? 1.4、10.5 ? 1.8、.7 ? 1.4、13.5 ? 1.3。最小出血剂量(MHD)为6.0 μg。【结论】 F?aa是一种可以直接降解纤维蛋白且 具有出血活性的α-纤维蛋白酶。 【关键词】 纤溶酶; 蛇毒; 蝰蛇 Abstract: 【Objective】 To purify F?aa， a fibrinolytic enzyme from Burmese Russell’s Viper (Daboia Russelli Siamensis) venom， and investigate its fibrinolytic characterization. 【Methods】 F?aa was purified from Burmese Russell’s Viper venom by ion-exchange chromatography and gel-filtration. Molecular weight was determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Fibrinolytic activity was determined using fibrin plates technique. Specific cleavage of fibrinogen and fibrin was shown on SDS-PAGE. The local hemorrhagic activity was assayed by subcutaneous injection on the back of mouse. 42 Kunming strain mice (20 ? 2) g， bisexual each half， were randomly divided into 7 groups with 6 individual per groups. F?aa (0.025， 0.05， 0.075， 0.1， 0.5 g/L) were each injected subcutaneously in the back with the test samples in 0.1 mL of 0.9% saline， by control of 0.9% saline and crude venom and sacrificed after 6 hours and the diameters of hemorrhagic spots measured on the underside of the skin. 【Results】 F?aa was achieved by a three-step fraction with a molecular weight of 69 000. F?aa showed fibrinolytic activity whether on fibrin plate or heated fibrin plate. After incubated with F?aa (0.2 g/L)， Aα and Bβ of fibrinogen disappeared within 5 min and 6 h respectively. The γ-chain was partially degraded after 24 h. The process of fibrin hydrolysis by F?aa was similar to that observed with fibrinogen. F?aa (0.025， 0.05， 0.075， 0.1， 0.5 g/L) was injected subcutaneously， the diameters(mm) of hemorrhagic spots measured on the underside of the skin of which were 7.7 ? 1.0， 9.9 ? 1.4， 10.5 ? 1.8， .7 许多蛇毒特别是蝰科的 蝰亚科和蝮亚科中含有能够具有生物活性的蛋白酶，它们作用于高等 动物的血液凝固或者纤溶系统[1]。蛇毒中能够直接或者间接水解纤 维蛋白(原)的酶有凝血酶样酶(thrombin-like enzymes)、血浆纤溶 酶原激活物(Plasminogen activators)和纤维蛋白(原)溶解酶(以下 简称纤溶酶)，三者统称纤维蛋白原水解酶。这些酶中只有纤溶酶能 够直接降解纤维蛋白和纤维蛋白酶原。目前大约有70多种具有或者 不具有出血活性的纤溶酶被分别从Agikistrodon acutus、 Agikistrodon contortrix、 Cerastes cerastes、 Trimeresurus mucrosquamarus、 Vipera lebetina、 Crotalus atrox等蛇毒中分 离出来并进行了性质研究。蝰蛇是世界上的主要毒蛇之一，蝰蛇(缅 甸亚种)属于蝰科蝰亚科，主要分布于东南亚的十几个国家和地区。 蝰蛇毒中含有丰富的血液毒素，至今已从其中分离出多种凝血毒素， 如凝血因子?激活剂(RVV-?)、凝血因子?激活剂(RVV-?)[10-]和凝酯酶A2[13-15]和出血蛋白酶[16]、蛋白酶抑制剂[17]。目前国内外均未见同种蛇毒纤溶酶的研究报道。仅Chakrabarty等[16]从蝰蛇(缅甸亚种)毒中分离出一种具有纤溶活性和酯酶活性的出血因子VRR-73，其通过激活纤溶酶原降解纤维蛋白，因此其降解方式是间接的。本文第一次从蝰蛇(缅甸亚种)毒中分离出一种大分子质量的具有纤维蛋白溶解活性的蛋白组分F?aa，并进一步探讨了F?aa的生物活性特点。F?aa是一种新的蛇毒纤溶酶，既可降解纤维蛋白原，又可降解纤维蛋白，其作用方式是直接的，F?aa具有较强的出血活性。我们试图进一步开发新的蛇毒资源。缅甸亚种蝰蛇中毒死亡率高，目前对其研究有限，本文为阐明蛇伤中毒以及临床对其抗毒素的制备和应用研究提供了理论基础。 1 与方法 1.1 材 料 冻干的蝰蛇(缅甸亚种)粗毒从广州医学院蛇毒研究所购买。 CM-Sephadex C-50、SuperdexTM 75 和 DEAE-Sephadex A-50均购自Pharmacia公司。牛纤维蛋白原，纤溶酶，分子质量标准蛋白购自美国Sigma公司。人凝血酶购自珠海经济特区生物化学制药厂。其它试剂均为国产纯。实验动物:昆明种小白鼠(No. 2004A087，二级)，雌雄各半，体质量(20 ? 2) g，由中山大学北校区动物中心提供。 1.2 F?aa的分离纯化 F?aa的分离纯化步骤均在4 ?下进行，在280 nm处测定其吸光度。每一个分离步骤结束后进一步测定所有成分的纤溶活性(具体方法见后)。取粗毒1.0 g溶解在5 mL蒸馏水中，在0.1 mol?L-1，pH值6.8的醋酸铵缓冲液中透析，4 ?下3 000 × g离心低温离心10 min。将CM-Sephadex C-50离子交换柱(2.6 × 80 cm)用上述缓冲液平衡，取离心过的粗毒上清液上样，用上述缓冲液洗脱，待非吸附成分完全洗脱出来后，改用分别含有不同浓度的NaCl (0.5 mol?L-1和1.0 mol?L-1)的上述缓冲溶液共1 000 mL进行联合梯度洗脱，洗脱液用分部收集器收集，每管3 mL，流速 mL?h-1。具有纤溶活性的成分进一步透析、冻干并进行下一步SuperdexTM 75 (1.6 cm × 80 cm)的分离。分离柱用0.1 mol?L-1，pH值6.8的醋酸铵缓冲液平衡，流速4 mL?h-1。将SuperdexTM 75所得到的纤溶活性成分透析、冻干，用DEAE-Sephadex A-50(1.6 cm × 80 cm)进一步分离。DEAE-Sephadex A-50用0.01 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液进行平衡，用含有不同浓度的NaCl(从0.1 mol?L-1 , 0.7 mol?L-1)和不同pH值(pH从8.0 , 7.0)的该缓冲溶液共1 000 mL进行直线梯度洗脱，流速 mL?h-1 。 1.3 蛋白定量测定 根据Bradford法，用含有考马斯蓝G-250的试剂进行蛋白质浓度测定[18]，牛血清白蛋白作为标准蛋白。 1.4 分子质量测定 参照Laemmli (1970)[19]的方法，采用SDS-PAGE 垂直平板式电泳测定分子质量。相对分子质量标准蛋白质采用β-牛乳糖(175 000)，副肌球蛋白(83 000)，谷氨酸脱氢酶(62 000)，醛缩酶(47 500)，磷酸丙糖异构酶(32 500)，β-乳球蛋白A(25 000)，溶菌酶(16 500)，抑肽酶(6 500)。 1.5 纤溶蛋白原溶解活性的测定 取F?aa(150 μL，1 g/L)加入纤维蛋白原(溶解在0.01 mol?L-1乙酸铵溶液，pH 8.0乙酸铵缓冲液中)溶液450 μL中，于37 ?温育。分别在5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h各取20 μL的反应液，立即加入5 μL的等量的电泳上样缓冲液，100 ?水浴3 min，以4%的浓缩胶和%分离胶作SDS-PAGE。同样以50 U?L-1的人纤溶酶作对照[20-22]。 1.6 纤溶蛋白溶解活性的测定 纤溶蛋白溶解活性用纤维蛋白平板法[23-24]测定。取20 μL不同浓度的纤溶酶F?aa于平板面，每一样品加三点，37 ?保温24 h，观察透明圈的形成测量其直径并计算面积(mm2)。同样，在将标准平板于85 ?加热1 h制作成的“加热平板”上重复上述试验。用生理盐水作阴性对照，尿激酶作阳性对照。纤维蛋白降解产物同样经过SDS-PAGE分析[5，25]。取纤维蛋白原(100 μL，10 g/L)和100 μL凝血酶(10 kU?L-1)混合并于37 ?下温育30 min。形成的蛋白凝块用0.01 mol?L-1的乙酸铵缓冲液(pH 8.0)洗涤3次。加入F?aa (100 μL， 2 g?L-1)继续37 ?温育，分别在0.5、 1、 3、 6、 、 24、 48 h 取样加入电泳上样缓冲液终止反应，作SDS-PAGE分析。以50 U?L-1的人纤溶酶作对照。 1.7 局部出血活性测定 出血活性的测定参照Kondo[26]的方法进行。取昆明种小白鼠42只，体质量(20 ? 2)g，雌雄各半，随机分成7组，每组6只，清洁背部皮肤并去毛后，分别皮下注射0.1 mL的F?aa(5个剂量组:用生理 盐水配制成浓度分别为0.025、0.05、0.075、0.1、0.5 mg/mL)、生理盐水和粗毒(0.1 mg/mL)。6 h后处死小白鼠，取其背部皮肤，从皮内侧面测量出血点的大小，以引起平均直径为10 mm的出血点所需的剂量为最小出血剂量(MHD)，以此来判断有无出血活性。 1.8 统计学方法 数据表示为x ? s，统计分析采用t检验。 2 结 果 2.1 F?aa的分离纯化 F?aa组分经过3步分离纯化程序得到。粗毒经过CM-Sephadex C-50阳离子交换层析得到11个蛋白峰(图1)，其中第2(F?)和6峰(F?)具有较高的纤溶活性。 F?进一步经Superdex 75凝胶层析得到3个蛋白峰(图2)， 其中主峰即F?a具有纤溶活性，将其再经过DEAE-Sephadex A-50 阴离子交换层析得到3个蛋白峰(图3)，其中第1峰(F?aa)具有较强的纤溶活性。在SDS-PAGE F?aa显示一条带(图4)，通过标准蛋白质的分子质量对数及相对迁移率绘得的标准曲线(图5)，通过标准曲线计算得相对分子质量是69 000。从1.0 g粗毒能分离出17.7 mg的F?aa。 2.2 F?aa的纤维蛋白原溶解作用 SDS-PAGE结果显示，F?aa对纤维蛋白酶原的Aα链、Bβ链和γ链均有裂解作用(图6)，Aα链在5 min内几乎完全降解，接下来Bβ链在2 h内消失，γ链对F?aa的作用不敏感，γ链在温育24 h后仅部分降解。当纤溶蛋白酶与人纤溶酶温育，Aα链、Bβ链均在5 min内消失，γ链在1 h内降解，主要的降解片断产物也不同于F?aa，这些显示F?aa有不同的作用位点(图7)。人纤溶酶对纤维蛋白原的的作用结果见图7。 2.3 F?aa的纤维蛋白活性 采用纤维蛋白平板法测定F?aa纤溶活性。不同浓度(0.25， 0.5， 1.0， 2.0 g?L-1)的F?aa 20 μL加到纤维蛋白平板表面。结果显示F?aa能够溶解纤维蛋白而且具有量效关系(图8)。F?aa能够溶解加热的纤维蛋白平板，而尿激酶不能。F?aa降解纤维蛋白的过程与纤维蛋白原相似(图9)。SDS-PAGE结果显示，F?aa对纤维蛋白的α链、β链和γ-γ二聚体均有水解作用，对α链最敏感，β链其次，而对γ-γ二聚体的水解作用较弱。 2.4 F?aa的局部出血活性 F?aa(0.025、0.05、0.075、0.1、0.5 g?L-1)0.1 mL皮下注射，6 h后取皮并测量皮内侧面出血点直径(mm)分别为7.7 ? 1.0、9.9 ? 1.4、10.5 ? 1.8、.7 ? 1.4、13.5 ? 1.3(mm)。最小出血剂量(MHD)为6.0 μg(图10)。